Ecologia del microbiota umano ed elementi di metagenomica

Ecologia del microbiota ed elementi di metagenomica

Definizioni

• Ecologia: analisi e studio delle interazioni tra organismi e il loro ambiente
• Microbiologia: studio della biologia dei microrganismi
• Ecologia microbica: ecologia dei microrganismi e loro interazione con altri microrganismi e con l’ambiente che li circonda
• Microbiota umano: insieme dei microrganismi che colonizzano il corpo umano
• Metanogenomica: analisi culture-indipendente per lo studio di comunità microbiche complesse direttamente nel loro ambiente naturale. Si basa sul sequenziamento di DNA (prelievo campione-estrazione DNA-analisi DNA). Non si va a prelevare e coltivare il campione in laboratorio
• Ecosistema: complesso di piante, animali e comunità microbiche che interagiscono tra loro formando un’unità funzionale. Formato da tanti habitat. Vi sono quindi varie nicchie ecologiche che permettono o meno lo sviluppo di microrganismi differenti
• Habitat: ambiente adatto alla vita di una specifica popolazione

I microrganismi che colonizzano il nostro corpo non recano danni, ci aiutano. Una piccola parte di microrganismi detti patogeni portano malattia. Ci sono molti esperimenti su topi axenici (germ-free) privi di microrganismi, questi sono debolissimi e vivono poco e sono completamente sterili. Il microbiota aiuta il topo a crescere e regolare le funzioni vitali. Il microbiota intestinale viene considerato come un ulteriore nostro organo perché svolge funzioni indispensabili per il nostro organismo.

Classificazione

Possono essere sia:

• Procarioti: batteri e arkea
• Eucarioti: animali, piante, muffe alghe e lieviti. Le alghe e i lieviti sono unicellulari ma con una struttura più complessa dei procarioti.

Tante discipline si legano alla microbiologia: genetica, biochimica, biologia molecolare, chimica, ecologia, farmacologia. Perché è molto più facile partire da organismi semplici che da quelli più complessi. Quindi molte cose si studiano sugli organismi più semplici per poi traslarle su dei sistemi più complessi. Ci sono anche discipline nate più recentemente che si allacciano alla microbiologia come la microbiologia medica, la genetica microbica e l’ecologia microbica.

La microbiologia ha un grosso impatto anche a livello pratico perché vi sono delle aree applicative in cui la microbiologia serve: industria agro-alimentare, industria chimica, ambiente ed energia, biotecnologie industriali.

I batteri influenzano il nostro stato di salute molto di più di quanto si possa immaginare. Da sempre si è cercato un equilibrio tra i batteri buoni come sostanze protettive e i patogeni.

Interazione dei batteri con l’ambiente

Lo studio delle attività microbiche porta alla comprensione del ruolo svolto dai microrganismi nell’ambiente che occupano. Le attività dei microrganismi possono essere:

• Dirette: si possono studiare direttamente i prodotti del metabolismo microbico
• Indirette: studio dell’interazione con l’ospite

Negli ambienti naturali convivono tipi di microrganismi diversi che interagiscono tra loro e nell’ambiente. Ogni ambiente è abbastanza complesso e colonizzato da batteri.

Microrganismi ed ecosistemi

• Microrganismi ed esseri viventi (colonizzatori o agenti patogeni)
• Microrganismi ed agricoltura (batteri azoto fissatori)
• Microrganismi negli alimenti (trasformazione di alimenti per la loro conservazione)
• Microrganismi, ambiente ed energia
• Microrganismi e biotecnologie

Microrganismi come agenti di malattia: patogeni che portano a infezione. Il livello del danno dipende dalla patogenicità del batterio. Ogni ospite può rispondere diversamente in base al proprio sistema immunitario. La virulenza è la misura quantitativa della capacità di un patogeno di creare danno. Alcuni microrganismi sono più virulenti di altri causando un danno più o meno maggiore.

Il potere di danneggiamento dell’ospite di un patogeno dipende da alcuni fattori come la capacità di colonizzare, di invadere, la capacità di elaborare tossine e indurre risposte più o meno intense da parte dell’ospite.

I microrganismi agiscono in vari modi:

• Alterando le barriere di permeabilità (liberano molecole che permettono di farsi spazio tra le cellule)
• Usando strutture di superficie per attaccarsi e aderire al tessuto ospite
• Impiegando strutture per evitare la fagocitosi
• Adottando mimetismi antigenici
• Impiegando proteine sensoriali che rispondono a stimoli ambientali che determinano l’espressione di geni specifici di virulenza. Mettono in atto dei sistemi per cui in presenza di determinate caratteristiche si attivano producendo geni per la virulenza o geni che gli permettono di sopravvivere in determinate condizioni. Il suo genoma comprende tutte le informazioni ma ovviamente non esprime sempre tutte le proteine, ciò avviene solo con determinati stimoli e in determinati momenti poiché non sono geni fondamentali.

Microrganismi ed agricoltura

I microrganismi del suolo sono fondamentali per il ciclo del carbonio e partecipano con le piante alla fissazione di anidride carbonica. Intervengono nel ciclo dell’azoto e trasformano azoto organico in sali di ammonio. Vi sono microrganismi che sono in grado di fermentare cellulosa ed emicellulosa permettendo così ai ruminanti di poterle digerire, cosa impossibile per i mammiferi. Questi batteri vengono detti ruminali e usano azoto non proteico e urea consentendo all’animale di sfruttare le forme semplici dell’azoto.

Microrganismi e ambiente

• Sono usati nel trattamento di composti inquinanti prodotti dalle attività umane attraverso un processo di bio-risanamento. Degradano sostanze come petrolio, solventi o pesticidi (risanamento biologico).
• Trasformano i rifiuti solidi (compostaggio): processo di trasformazione della frazione organica biodegradabile del rifiuto urbano per ottenere fertilizzanti.
• Trattamento dei fluidi

Microrganismi ed energia

La biomassa microbica, i prodotti di scarto domestici o agricoli possono essere convertiti in biogas come metano ed etanolo dall’attività di specifici gruppi microbici. Si può sfruttare la biomassa per produrre elettricità. La bioelettricità microbica viene considerata l’elettricità del futuro. L’UE vuole aumentare la produzione di biocarburanti o studiare come produrre direttamente energia elettrica.

Microrganismi e alimenti

Negli alimenti i microrganismi possono essere presenti in maniera utile o dannosa. In alcuni casi l’attività diretta o indiretta di microrganismi usati nei processi di trasformazione degli alimenti contribuiscono alla conservabilità dell’alimento e al raggiungimento di adeguate caratteristiche organolettiche come sapore e consistenza. Ma la loro contaminazione da patogeni è dannosa perché causa implicazioni igienico sanitarie. Inoltre più il cibo viene manipolato, più può essere contaminato. La presenza di microrganismi negli alimenti freschi può essere dannosa.

Gli alimenti possono essere divisi in:

• Ottenuti in seguito a fermentazione di materia prima da parte principalmente di batteri lattici: formaggio, yogurt, pane, salumi, vino
• Ottenuti senza modificazioni: latte alimentare, verdura, frutta. Possono essere contaminati alterandone il valore nutrizionale
• Ottenuti con aggiunta di microrganismi: prodotti probiotici (alimenti funzionali) come alimenti con aggiunta di Omega 3 o da antiossidanti

Microrganismi e biotecnologie

Si usano applicazioni tecnologiche delle biotecnologie ottenendo prodotti tramite organismi viventi. Esistono vari tipi di tecnologie: quelle applicate all’acqua, quelle ambientali, quelle industriali, agro-alimentari, quelle legate alla medicina, all’industria. Le applicazioni possono essere di 2 tipi:

• Classiche: producono vino, birra, distillati e pane che derivano da processi fermentativi operati da microrganismi
• Avanzate: usano l’ingegneria genetica apportando modifiche al DNA per creare nuovi prodotti come avviene con gli OGM (organismi geneticamente modificati).

Gli OGM sono esseri viventi il cui patrimonio genetico è stato manipolato e modificato in laboratorio. Determinati microrganismi possono acquisire funzioni particolari che non ha invece il microrganismo di partenza. Un esempio sono le fragole che resistono al freddo grazie all’introduzione di un gene preso da un pesce artico, oppure ottenere dal lievito l’insulina umana, o il mais che resiste a determinati insetti.

Ci sono problemi riguardanti l’impatto di questi nuovi organismi sull’ambiente perché non si sa ancora se possono sviluppare dei rischi o meno. Si possono sviluppare resistenza ai farmaci o ruolo nutrizionale di alcune proteine. Sono molto utili in alcuni casi ma non si conosce l’effetto.

Strutture batteriche

Intervengono nell’interazione con altri microrganismi e con l’ambiente. Dall’interno verso l’esterno troviamo:

• Citoplasma
• Membrana cellulare
• Spazio periplasmatico
• Parete
• Membrana esterna (in alcuni microrganismi)

All’esterno dell’involucro cellulare possiamo trovare una capsula, i pili e i flagelli. Sono strutture coinvolte nell’interazione.

Differenze tra cellula eucariote e procariote

La procariote è più piccola di massimo 4 micron, le eucariotiche sono decisamente più grandi. Bisogna usare un microscopio con un potere di ingrandimento di 1000 volte. Le procariotiche non hanno nucleo e nemmeno membrana. Hanno un cromosoma unico e circolare privi di istoni e mancano gli organelli. Le membrane non contengono steroli. All’esterno si trova una parete con peptidoglicani e mureina.

I ribosomi si trovano in entrambe le cellule. Alcuni cianobatteri possono raggiungere i 50 micron.

Parete cellulare: in base a questa i batteri si distinguono in Gram + e Gram -. È una distinzione che prende il nome dalla colorazione di Gram. Entrambi hanno una membrana citoplasmatica.

• I Gram + hanno un sottilissimo strato periplasmatico tra la membrana e la parete (la quale è formata da peptidoglicano per il 90% e conferisce rigidità e protezione alla cellula). Questi all’esterno hanno la parete. Possiedono acidi teicoici che attraversano la parete o acidi lipoteicoici
• I Gram - invece hanno uno spesso periplasma che contiene un sottile strato di peptidoglicano e poi presenta una complessa membrana esterna lipopolisaccaridica.

Acidi teicolici: sono polisaccaridi che presentano dei gruppi P e conferiscono una carica - sulla superficie cellulare e possono contribuire al passaggio di ioni attraverso la parete cellulare. Sono formati da ribitolo e glicerolo uniti da legami fosfodiesterici. Il loro ruolo è strutturale e possono essere importanti perché aderiscono alle mucose cellulari dell’ospite. Gli acidi teicoici che si legano ai lipidi della membrana sono detti ACIDI LIPOTEICOICI: sono legati al gruppo 6-ossidrile dell’acido muramico della parete cellulare. Il peptidoglicano è formato appunto da N-acetilglucosamina e N-acetilmuramico. Questi acidi sono molto studiati perché si è evidenziato che hanno un possibile coinvolgimento nella porosità, elasticità e resistenza della parete. Sembra anche che siano coinvolti nei rapporti di adesione con l’ospite. Rappresentano inoltre una fonte di fosfato dove vi è carenza prendendolo dalle sue stesse strutture.

Gram -: la membrana esterna dei batteri Gram - è complessa. È formata da LPS formato a sua volta da 3 parti:

• Lipide A: porzione più interna che si ancora alla membrana esterna. È una regione lipidica tossica per gli animali (chiamata endotossina) e attiva la risposta immunitaria poiché è riconosciuto da specifici recettori delle cellule immunitarie dell’ospite. Un’eccessiva risposta da parte dell’ospite può anche creare uno shock settico.
• CORE polisaccaridico diviso in una porzione interna e una esterna. L’interna è più conservata con zuccheri a 7 atomi di carbonio e l’esterna è variabile con zuccheri a 6-7 C.
• Un antigene O che è la vera e propria struttura esterna. Costituita da unità tetra- o penta-saccaridiche ripetute che si estendono verso l’esterno. È in grado di indurre la produzione di anticorpi specifici nell’ospite.

In tutta questa struttura le sostanze possono comunque entrare nella cellula attraverso proteine di membrana dette PORINE che formano dei canali per il loro passaggio.

Le strutture di superficie

Le strutture di superficie sono implicate in molti processi tra cui l’adesione al substrato, la protezione alla fagocitosi e l’interazione con gli ospiti. Tra queste vi sono:

• Glicocalice
• Fimbrie o pili
• Strato paracristallino o chiamato S-LAYER

Glicocalice

È una struttura polisaccaridica che può essere di due tipi:

• Capsula: matrice ben organizzata che non lascia passare le particelle
• Strato mucoso: matrice lassa non organizzata e deformabile che non è in grado di impedire il passaggio delle particelle.

Nonostante la struttura sia diversa le funzioni sono le stesse: permettono l’adesione ad altri batteri o superfici, proteggono dall’essiccamento in quanto soprattutto lo strato mucoso assorbe molta acqua e infine svolgono funzione di protezione verso il sistema immunitario. Lo strato mucoso è formato da polisaccaridi ad alto peso molecolare anche detti ESOPOLISACCARIDI (EPS) che in rarissimi casi possono essere costituiti da amminoacidi. Ad esempio il Bacillus anthracis ha EPS formati dal NAD.

I patogeni utilizzano queste strutture per la loro patogenesi in quanto sono sistemi virulenti usati per raggiungere gli organi bersaglio. Ad esempio lo Streptococcus mutans utilizza gli EPS per la formazione della placca dentaria scindendo il saccarosio in fruttosio e glucosio.

Gli EPS contengono molta acqua e sono costituiti da singole unità ripetute di monosaccaridi tutte uguali (omosaccaridi) o diverse (eterosaccaridi) uniti da legami glicosidici. Questa struttura viene anche usata per la formazione di BIOFILM: comunità strutturate di cellule batteriche racchiuse in una matrice polimerica autoprodotta e adesa ad una superficie inerte o vivente (strato su superficie solida).

In vitro quando un microrganismo produce EPS si crea sulla superficie una patina gelatinosa. Gli EPS sono anche usati a livello tecnologico come addensanti di alcuni prodotti alimentari modificando le proprietà chimico-fisiche. Sin dagli anni '50 è conosciuta la produzione di destrano da parte di Leuconostoc mesenteroides che è usato nell'industria alimentare.

Gli EPS possono anche avere un effetto prebiotico per la salute umana. I prebiotici sono sostanze alimentari non digeribili dai nostri normali enzimi, così vengono lasciati indigeriti e arrivano nell’intestino formando un substrato per lo sviluppo di microrganismi probiotici. Hanno un effetto positivo sui microrganismi buoni che hanno attività fermentativa.

Gli EPS hanno ulteriori proprietà:

• Attività antitumorale: in uno studio sono stati estratti gli EPS da un ceppo di Lactobacillus plantarum e in vitro sono stati messi a contatto con delle cellule tumorali (soprattutto HT29 che sono cellule tipicamente intestinali). Si è visto che le EPS inibiscono la proliferazione delle cellule tumorali. Gli EPS possono essere usati come una sorta di medicinale per curare tumori, ma ancora sono stati sperimentati soltanto in vitro.
• Effetto immunostimolatorio: in un altro studio sono stati estratti EPS da un ceppo di Lactobacillus rhamnosus e stimolano l’attività stimolatoria, in questo caso gli splenociti.

Bifidobatteri

• Batteri Gram +, non mobili e non sporigeni
• Sono morfologicamente ramificati (forma a Y)
• Anaerobi stretti principalmente perché la loro nicchia ecologica è l’intestino degli esseri umani o insetti (non c’è ossigeno o c’è una piccolissima quantità)
• Fermentano gli zuccheri, producono acido acetico e lattico (2:1). Quando sono stati scoperti all’inizio del 1900 erano stati inclusi nei batteri lattici, ma non lo sono. Sono uniti ai lactobacilli perché hanno alcune loro stesse caratteristiche positive.
• Temperatura ottimale a 37-41° C
• Acido-tolleranti (PH minimo 3.5)

Sono normali componenti dell’ecosistema intestinale.

Gli EPS nei Bifidobatteri. Alcuni Bifidobatteri producono EPS. I vari geni che codificano per gli EPS (9 cluster di EPS di similarità) sono stati confrontati a livello filogenetico. La comparazione tra geni avviene tramite sistemi bio-informatici. Nell’albero filogenetico i ceppi più diversi si distanziano a sinistra, i più uguali a destra. Il ceppo ancestrale è quello più spostato a sinistra rispetto a tutti gli altri. I cluster di EPS sono condivisi per nicchia ecologica: nell’intestino umano si ritrovano le EPS cluster 1 e 2, nell’intestino di vari animali si trovano il 3 e il 4.

Heatmap

È una mappa in cui i diversi colori assumono significati diversi. Ad esempio il nero può indicare assenza e il rosso presenza. Rappresentano tutti i geni di EPS suddivisi in base ai colori poiché ogni colore rappresenta una determinata funzione. Non esiste un’organizzazione strutturale comune tra i vari bifidobatteri (infatti la heatmap risulta molto confusionaria).

Espressione EPS: in un esperimento si è pensato di simulare le condizioni intestinali perché è qui che si ritrovano tali microrganismi. Si sono formulati 2 substrati di crescita:

• Uno simula l’ambiente fecale di bambino
• Un altro simula l’ambiente fecale di un adulto

Si sono fatti crescere i bifidobatteri tipici del bambino nel terreno di crescita che...