Ecologia del microbiota umano ed elementi di metagenomica

METODI DI CONTA CON I MICROSCOPI

 Metodi diretti:

Camere di conta

o Coloranti fluorescenti (DEFT o FISH)

o

 Metodi indiretti

Su agar

o In provetta

o

CAMERE DI CONTA (camera Thoma)

Si una un vetrino reticolato di 16 quadranti per la conta totale dei microrganismi sia vivi sia morti.

Si aggiungono quindi i microrganismi e il copri-vetrino per creare spessore e successivamente viene

fatta scendere una goccia di microrganismi. Per la conta bisogna concentrarsi sui 4 quadrati che si

trovano sulla diagonale, i quali al loro interno avranno altri 16 quadratini. Vi è quindi una serie di

quadrati che ci permette di contare meglio ma anche in ogni quadrante bisogna sempre contare i

quadratini della diagonale.

6 6

FORMULA: n/16 x (4x10 ) 4x10 è una costante e rappresenta il fattore di diluizione

Si avrà come risultato: nei terreni solidi il numero di cellule per grammi, nei terreni liquidi: numero

di cellule per ml.

La camera Thoma è un metodo rapido e poco costoso. Ma vi sono molti svantaggi:

 Sono visibili solo poche cellule

 Se il terreno è troppo diluito non riesco a vedere niente

 Non si distinguono le cellule vive dalle cellule morte

 L’affaticamento degli operatori può causare errori

 È una tecnica impossibile da automatizzare

 È impossibile contare selettivamente determinati gruppi di microrganismi

 Difficoltà ad individuare cellule di dimensione ridotte che possono sfuggire alla conta

CONTA TRAMITE COLORANTI FLUORESCENTI

Si può usare il fluoroforo DAPI che si lega al DNA e dona una colorazione blu. Così riesco ad

individuare tutti i microrganismi. Altre due tecniche sono:

1. DEFT ( direct epifluorescent filter technique): il liquido con i microrganismi viene filtrato su

una membrana che trattiene le cellule. Il filtrato viene colorato col fluoroforo e così sarà 29

possibile distinguere cellule morte da cellule vive che risultano di colori diversi ma non sono

possibili conte selettive. È costoso e lungo.

2. FISH (fluorescence in situ hybriditazion): si usano coloranti fluorescenti legati a sonde

oligonucleotidiche e tramite questa sono possibili conte selettive. Ma vi sono porzioni di

DNA più o meno accessibili perché magari si ramificano. È anche possibile contare

microrganismi non coltivabili in piastra. Richiede circa 3 giorni di lavoro.

KIT BACHLIGHT

Permette di distinguere organismi vivi e morti. Comprende due sostanze chimiche:

 SYTO9 penetra nella membrana di tutti i microrganismi e si lega agli acidi nucleici e i

microrganismi appaiono verdi

 PI (propidium iodide) entra solo quando la membrana è danneggiata, sostituisce il SYTO9 e

si colora di rosso ed emetta una fluorescenza rossa.

Quindi i microrganismi vivi si colorano di verde, quelli morti di rosso.

In un ecosistema complesso i microrganismi rappresentano la carica totale divisa in vitale e non

vitale. CONTA

TOTALE

Vitale Non Vitale

non (microscopi

coltivabile coltivabile a)

Col microscopio ottico vedo la somma di vitali e non vitali. Il vitale e coltivabile riesco a valutarlo

al microscopio, il vitale non coltivabile non posso metterlo in piastra ma uso metodi culture-

dependent.

CONTA VITALE

E’ un metodo rapido per stimare il numero di microrganismi coltivabili presenti nel campione. Si

formano colonie cioè una serie di cellule figlie che creano un ammasso nel terreno e che originano

tutte da una stessa cellula madre. Valuto così l’unità formanti colonia (CFU). Ma se vi sono 2

cellule molto vicine io non riesco a capire se una colonia deriva da una cellula o dall’altra.

METODI DI CONTA SU TERRENI AGARIZZATI

 Conta per spatolamento: si preparano prima le piastre contenenti il terreno e si aggiungono i

microrganismi e poi si spatola. Spatolando il terreno si asciuga ma nel frattempo si 30

distribuiscono bene i microrganismi sulla piastra. Questa tecnica si usa per microrganismi

aerobi.

 Conta per inclusione: prima si aggiungono i microrganismi, poi il terreno e poi si mescola. I

microrganismi rimangono intrappolati all’interno dell’agar. Questa tecnica si usa per

microrganismi anaerobi in quanto non vengono così a contatto con l’ossigeno.

Prima di tutto bisogna diluire il campione per abbassare il numero di microrganismi. Poi si contano

le piastre che contengono da 30 a 300 CFU. Si possono segnare le colonie già contate o si può

dividere la piastra in 4 o 6 spicchi e contare un solo spicchio e poi moltiplicare.

DILUIZIONE SERIALE

Si preparano una serie di provette e si parte dal campione originale. Nella provetta si aggiunge 9ml

di brodo e 1 ml di campione e si miscela. Poi si aggiunge alla seconda provetta 9ml di brodo e 1ml

di miscela e così via nelle altre provette.

Quindi nella prima provetta avremo una diluizione 1/10 del campione, mentre nella seconda avremo

una diluizione 1/10 della provetta precedente ma una diluizione 1/100 del campione di partenza. Poi

si mettono in piastra e si va a valutare se vi sono ancora troppi campioni o meno: quindi o si

continua con la diluizione o si va avanti con la conta.

Nella conta per inclusione si mette in piastra 1ml di campione e nel terreno poi solidifica. Mentre

nella conta per spatolamento se metto 1ml sopra non va bene perché altrimenti si impiega molto

tempo a far assorbile quella quantità di campione. Si aggiungono allora 100 microlitri e poi si

spatola. Ma aggiungere 100 microlitri rappresenta come un’ulteriore diluzione quindi ne devo

tenere conto.

SEMINA IN DOPPIO STRATO

Si fa una conta per inclusione e una volta che il terreno si è asciugato si aggiunge un altro strato di

terreno. Si usa per gli organismi anaerobi obbligati.

SEMINA IN ALTO STRATO

Non serve per fare una conta ma viene usata quando si deve spedire il campione. Si prende una

provetta contenente il terreno agar, si aspetta che questa si raffreddi e si inocula il microrganismo.

Successivamente si lascia solidificare in modo tale da avere il ceppo bloccato, si mette a crescere un

giorno e poi si spedisce in maniera tale che c’è già stato un accrescimento.

FORMULA MEDIA PESATA

Una volta ottenute le piastra si applica una formula per capire quanti organismi si sono ottenuti.

Di solito si fanno 3 diluizioni in doppio e la formula è: 31

esponente della prima diluizione contabile

Somma CFU di tutte le colonie sulle 6piastre/(n+(0.1xn )+(0.01:n ))10

a b

N= numero delle piastre della prima diluizione contabile

N =numero delle piastre della seconda diluizione contabile

a

N =numero delle piastre della 3 diluizione contabile

b

FONTI DI ERRORE:

 Bisogna usare le migliori condizioni per lo sviluppo del microrganismo

 Non tutte le colonie si sviluppano allo stesso tempo

 Non tutti i microrganismi sono coltivabili quindi una parte può essere persa

 Le dimensioni delle colonie sono variabili e alcune possono essere molto piccole

 La conta vitale è soggetta ad ampio margine di errore quindi bisogna fare delle repliche

STRISCIO

Procedura classica per l’isolamento dei batteri. Attraverso vari passaggi su substrati solidi si ottiene

strisciando tante volte una coltura pura detto CEPPO BATTERICO. Vengono effettuati tre strisci

successivi in piastra per assicurare che la colonia sia pura. Dal liquido si passa sulla piastra, poi si

effettuano 3 strisci: con l’ansa si prende una colonia e si striscia sulla seconda piastra e si fa questo

procedimento su 3 piastre e infine si dà per assodato che la colonia sia purificata.

CONTA MPN

È fondata sulla deduzione in termini statistici del numero di batteri che è più probabile siano

presenti nel campione di un brodo di coltura inoculato con diverse diluizioni. Viene valutata la

presenza/assenza di una caratteristica rivelatrice. Ad esempio:

 Nel caso dei coliformi una caratteristica è la capacità di metabolizzare il lattosio con la

produzione finale di gas. Se nella provetta si inserisce una campanella (provettina di vetro

rovesciata) e questa produce gas allora la campanella si alzerà.

 A volte i microrganismi vengono inoculati in terreni a base latte, i batteri lattici acidificano il

mezzo e portano alla coagulazione del latte e quindi si riesce a vedere il coagulo

La provettina rovesciata viene dette campanella di Durham. Vengono allestite tutte le diluizioni, poi

se non cresce nulla la provettina rimane in basse, in caso di crescita la campanella si sposta verso

l’alto. 32

PROCEDURA:

 Il campione viene diluito e una aliquota viene pipettato nelle provette. Si fanno 3 replicati

per ogni diluizione

 Il substrato viene inoculato e incubato per minimo 24h

 Si individuano le provette positive

 Confronto con le tabelle statistiche per determinare il numero dei microrganismi presenti nel

campione

Successivamente andrò ad individuare la diluizione limite e individuare la tripletta caratteristica: è

un numero a 3 cifre costituite dal numero di provette positive nella diluizione limite (che

rappresenta l’ultima diluizione in cui tutte e tre le provette sono positive), dal numero di provette

positive in quella successiva (che ovviamente sarà minore di 3 perché altrimenti rappresenterebbe la

diluizione limite) e poi in quella dopo ancora. Successivamente si ricava dalla tabella il numero più

probabile corrispondente al numero caratteristico e vedo che ad esempio la mia tripletta 320

corrisponde a 9 che poi verrà moltiplicato per il fattore di diluizione che è corrispondente alla

2

diluizione limite. Quindi avremo 9 x 10 . ESEMPIO:

VANTAGGI: è un metodo facile da usare ed è possibile avere risultati in 4h

SVANTAGGI: è una tecnica meno precisa della conta in piastra, laboriosa e costosa.

MICROSCOPIA

 Microscopio ottico: permette l’osservazione di cellule intatte a basso ingrandimento

 Microscopio elettronico: permette studi più dettagliati della superficie cellulare e della

struttura interna

MICROSCOPIO OTTICO

Il microscopio ottico sfrutta la luce visibile per illuminare la struttura cellulare. Contiene delle lenti

oculari in cui si appoggiano gli occhi. Possono essere monoculari con un unico oculare o con

doppio oculare. Poi vi sono gli obiettivi che danno l’ingrandimento. Le lenti oculari hanno un

ingrandimento 10x, gli obiettivi sono 10x, 40x (si usa con la camera di Thoma), 100x (massimo

ingrandimento possibile nel microscopio ottico). Poi in basso si trova una sorgente luminosa che

illumina il campione che sta sopra nel vetrino. La luce passa attraverso il campione e poi attraverso

gli obiettivi e l’oculare. Il condensatore è interposto tra la sorgente luminosa e l’oggetto e collima i

raggi della luce sul piano del microscopio. 33

Solitamente per il microscopio ottico si parla di LENT