Microbiota umano e metagenomica

LABORATORIO

Questa metodica di analisi metagenomica ci permette di determinare e analizzare cosa costituisce il nostro microbiota. I passaggi che si vanno ad eseguire sono:

1. Raccolta del nostro campione
2. Estrazione di DNA batterico
3. Amplificazione del gene 16S
4. Preparazione della libreria
5. Sequenziamento
6. Analisi dei dati

Si utilizzano diversi kit per estrarre DNA dal campione di feci. All'interno di questi kit sono presenti i reagenti e la plasticheria che dobbiamo utilizzare per la nostra analisi metagenomica.

Il kit che abbiamo preso in considerazione è il QIAmp DNA STOOL MINI.

1. RACCOLTA DEL CAMPIONE

Raccolta del campione fecale in una provetta che presenta una palettina da utilizzare per la raccolta con all'interno un liquido inattivante. Il liquido inattivante distrugge qualsiasi virus o microrganismo infetto presente, stabilizzando solo il DNA che è la macromolecola di interesse che ci serve per l'analisi. Il liquido inattivante è presente

Perché tutela la sicurezza e la salute dell'operatore impiegato per analizzare il campione fecale. La quantità che si raccoglie dal campione per essere analizzata è di 0,2 g. Viene raccolto all'interno delle cappe microbiologiche e pesato tramite l'utilizzo di bilancia analitica. Il campione deve essere mantenuto in frigorifero ad una temperatura di 4°C, se la consegna avviene entro 24 h dalla raccolta. Se il campione viene raccolto prima delle 24h, deve essere conservato in congelatore ad una temperatura di -20°C fino alla data consegna.

2. ESTRAZIONE DEL DNA

Purificazione senza utilizzo di sostanze tossiche. Sono presenti reagenti, che non è dato conoscere, che mi consentono di avere il mio DNA pronto per la PCR. Ho il mio campione che pongo in una provetta (buffer) contenente un reagente utile per lisare le cellule batteriche. Successivamente, viene posto un altro reagente che inibisce le DNAasi così da degradare tutte le DNAasi presenti che

Potrebbero compromettere il campione. Digestione delle proteine presenti. Serie di purificazioni con utilizzo di Etanolo. Alla fine si diluirà il campione con acqua così da avere il nostro "prodotto finale".

3. AMPLIFICAZIONE Tramite utilizzo di primer si va ad amplificare il gene 16S, in modo specifico le regioni v2 e v3 poiché si ha già un ricco database di dati inerente a queste due regioni. Si utilizza un sequenziatore Illumina Solexa. Si attua, quindi, Bridge PCR. Vengono aggiunti degli adattatori che si legano alle flow cell e degli indici, così da poter pullare tutti i campioni insieme. Questi indici sono dei barcode (sono delle sequenze nucleotidiche che sono diverse per soggetto) che ci permettono di identificare soggetto A da soggetto B. Illumina, a seconda del kit, fornisce 382 barcode diversi. 382 ma solo su 4 kit diversi. Quindi sono presenti kit A, B, C e D. Così si riesce ad arrivare a più di mille soggetti diversi.

Un pool di frammenti che è costituito dagli ampliconi che corrisponde ognuno ad ogni microrganismo presente nel campione di un dato soggetto con adattatori e barcode pronti per essere sequenziati. Viene eseguita elettroforesi per verificare se l'amplificazione è avvenuta (ricorda che viene verificata mediante posizione del frammento che indica a sua volta la dimensione). Ogni barcode ha come dato dimensionale di riferimento, un frammento di 270bp.

4. PURIFICAZIONE

Dopo aver effettuato l'elettroforesi, il mio campione viene posto a purificazione tramite l'utilizzo di biglie magnetiche (non viene utilizzata la colonnina perché si perde troppo DNA). I magneti attirano il DNA. Il materiale di non interesse, tramite anche l'uso di aggiunta di etanolo (che poi viene eliminato), viene scartato con prelievo tramite puntale. Con l'utilizzo di acqua, come passaggio finale, ultimo la purificazione del mio campione con conseguente distacco del DNA.

5.

QUANTIFICAZIONE

Avviene tramite l'utilizzo di un QUBIT (fluorimetro) che tramite una retta di taratura, che si costituisce tramite dati di taratura standard, paragona il mio campione alla retta standard. È presente nello strumento un piccolo foro dove viene posto il campione e la lettura viene eseguita velocemente.

La ditta dello strumento fornisce una soluzione che si miscela ad una certa quantità del nostro DNA. 2ul del nostro campione viene posto a contatto con 198 ul di questa working solution (la soluzione), che tra l'altro è molto comoda per via del fatto che è una soluzione da banco e non da frigorifero, miscelandoli nel vortex per qualche minuto e poi ponendoli successivamente in un cassetto (perché non può stare troppo a contatto con la luce) per 15 minuti. Dopo 15 minuti la provetta viene inserita nel QUBIT dove avviene la lettura della stessa. (QUESTO NON È OBBLIGATORIO SAPERLO).

Questa quantificazione è utile perché

Quando si va a sequenziare è opportuno sapere quanto DNA è presente in ogni campione (quantità o concentrazione di DNA espressa in ng/ul). Si prende come riferimento il campione che presenta minore concentrazione di DNA e si diluiscono gli altri campioni per avere la stessa quantità di questo campione che ha una concentrazione bassa (perché ovviamente non si può aumentare il DNA in laboratorio). Quindi tutti i campioni devono essere portati alla concentrazione più bassa. L'illumina arriva a toccare 20pm di tutti i campioni, il MINION addirittura arriva a concentrazioni di fentomoli (10^-5). Quindi anche pochissimo DNA è utile per sequenziare.

Viene posto al sequenziatore ILLUMINA. Dove avviene il tutto. Si avranno determinate reads che poi verranno poste ad analisi bioinformatica. I dati ottenuti indicheranno le percentuali di tot microrganismi trovati e presenti così da poter disegnare una cake diagram.

NON VORREI DIRE COSE SBAGLIATE!

MA IN LABORATORIO È STATA ESEGUITA PRIMA ANALISI QUANTITATIVA E POI SUCCESSIVAMENTE AMPLIFICAZIONE. MICROBIOTA - INTRODUZIONE STORIA DELLA MICROBIOLOGIA CLASSICA I microrganismi commensali positivi sono di numero maggiore rispetto ai microrganismi patogeni. PATOGENI: PRESENTI POCHI PATOGENI OPPORTUNISTI: UN CERTO NUMERO SONO PATOGENI SOLO IN DETERMINATE CIRCOSTANZE COMMENSALI: PRESENTI IN MAGGIOR NUMERO 121 Cos'è nata la Microbiologia? La nascita della microbiologia viene attribuita a Robert Koch, ricercatore e Premio Nobel di fine 800'. Koch concentrò tutto i suoi studi in determinati casi di infezione, ponendo le basi per i suoi 4 postulati che hanno rivoluzionato il mondo della scienza e della biologia. La formalizzazione dei postulati derivava soprattutto dalla grande esperienza che ha accumulato nel campo della tubercolosi nell'uomo, una delle più temibili malattie di tutti i tempi, il cui agente (la cui denominazione scientifica èMycobacterium tuberculosis) è stato poi denominato "bacillo di Koch" proprio in suo onore e memoria. Koch applicò i suoi postulati allo scopo di dimostrare che gli agenti della tubercolosi del carbonchio (una malattia sostenuta dal batterio Bacillus anthracis) erano diversi. La sagacia dei postulati di Henle-Koch risiede nella loro logica semplice: in sostanza, essi richiedono che, prima di dichiarare che "un dato microrganismo causa una data malattia", sia necessario: a) Associarlo a una sindrome clinica b) Isolarlo in coltura pura c) Riprodurre la malattia re-inoculandolo in un animale recettivo d) Reisolare lo stesso agente da quest'ultimo animale 122 Nel corso del tempo, altri studiosi come Pasteur e Metchnikoff hanno dato un grosso contributo alla nascita della microbiologia. Pasteur, ha basato i suoi studi su come i microrganismi hanno la capacità di trasformare la sostanza organica. Prima di lui alcuni studiosi tedeschi a metà 800

hanno dimostrato che il materiale organico subiva una fermentazione alcolica

che aveva come prodotti finali l'etanolo e l'anidride carbonica dovuti all'attività di forme microscopiche da loro sconosciute, quali microrganismi. Pasteur scoprendo il lievito pose una risposta alla questione inerente all'identità delle forme microscopiche citate in precedenza. Successivamente, diede un grande contributo al livello alimentare scoprendo metodi come la pastorizzazione che hanno dato vita all'era industriale alimentare. A lui è annoverata anche la scoperta della fermentazione butirrica.

Metchnikoff, scoprì la fagocitosi e i suoi meccanismi (meccanismo per ostacolare le infezioni batteriche)

di cui gli valse anche il Premio Nobel per questa scoperta. A seguito di quest'ultima scoperta gli viene annoverata anche l'importanza nel mondo della microbiologia per aver scoperto batteri che producono acido lattico. I batteri in questione

sono i Lactobacillus Bulgaricus, nome scelto da lui per onorare la Bulgaria, conosciuta un tempo per essere stata una nazione con vita longeva, supponendo che tutto fosse dovuto al grande consumo di latti fermentati. MICROBIOTA E MICROBIOMA Per Microbiota si intende l'insieme di microrganismi che colonizzano una determinata nicchia ecologica. È un complesso di comunità microbiche. La nicchia ecologica, oggetto del nostro studio, è il corpo umano. Questo termine sostituisce il termine Microflora. Funzioni: - Digestione di zuccheri complessi introdotti con la dieta - Sintesi di acidi grassi a corta catena (SCFA) - Rimozione di sostanze tossiche derivanti da processi fermentativi - Detossificazione delle sostanze xenobiotiche (sostanze estranee all'organismo) - Sintesi di Vitamine e Minerali - Protezione contro Patogeni (Antagonismo o Competizione) e Produzione di sostanze antimicrobiche - Mantengono il Sistema Immunitario in allerta Per Microbioma si intende

L'insieme di geni che costituiscono l'intero genoma di un microrganismo/i. È riconosciuto che l'organismo umano presenta un numero maggiore di cellule procariote (microrganismi) rispetto al numero di cellule eucariotiche presenti. Infatti, di conseguenza il microbioma risulta essere 200 volte maggiore del numero dei geni dell'intero genoma umano. Studiando il Microbioma possiamo avere informazioni sulle vie metaboliche e quindi avere informazioni sul METABOLOMA. Ricavare queste informazioni dal Metaboloma aiuta a capire quali sono i possibili metaboliti che vengono prodotti da tutte le pathway metaboliche presenti in un microrganismo. Il metaboloma aiuta anche a capire come il microbiota contribuisce alla salute dell'uomo, fornendo una serie di informazioni quali fisiologiche che i microrganismi hanno (e che non abbiamo noi come esseri umani). 123 Questi microrganismi contribuiscono all'E