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Enterococcus faecalis.

Agar Mac Conkey

•Caratteristica funzionale: selettivo e differenziale per Gram-.

•Meccanismo d'azione: Il cristal violetto e i sali biliari inibiscono la crescita dei batteri Gram+.

Presenza del rosso neutro come indicatore del pH.

Questo terreno contiene il lattosio come unica fonte di carboidrati.

1.Batteri che fermentano il lattosio si presentano sotto forma di colonie con varie sfumature di rosso in

quanto producono acidi che fanno scendere il pH. (E.coli)

2.Batteri che non fermentano il lattosio formano colore colonie trasparenti o incolore.

gar Sale-Mannitolo

•Caratteristica funzionale: selettivo differenziale, utilizzato per isolare stafilococchi, batteri gram

positivi.

•Meccanismo d'azione:Una concentrazione di NaCl pari al 7,5% seleziona la crescita degli

stafilococchi. Gli stafilococchi patogeni possono essere distinti in base a rilascio di prodotti acidi quando

utilizzano il mannitolo come fonte di carbonio ed energia. I prodotti acidi fanno virare l'indicatore di pH

(rosso fenolo) verso il giallo come avviene per esempio per lo Staphylococcus aureus.

Agar Salmonella-Shigella

•Caratteristica funzionale: altamente selettivo,utilizzato per l'isolamento selettivo di salmonelle

shigelle, batteri Gram negativi.

•Meccanismo d'azione: Contiene un'elevata concentrazione di sali biliari e citrato di sodio e lattosio

come unica fonte di carboidrati e, come colorante, il rosso neutro. Quest'ultimo è un colorante che

vira al rosso quando il pH della soluzione scende al di sotto di 6.8. Ciò fa sì che le colonie fermentanti il

lattosio appaiano, nella piastra di coltura, colorate di rosso. Come fonte di zolfo è presente il tiosolfato

di sodio ciò permette di evidenziare batteri producenti acido solfidrico.

1.Le Salmonelle sono batteri non fermentanti lattosio per cui su questo terreno danno colonie incolori,

producono però acido solfidrico e presentano quindi il centro della colonia di colore nero.

2.Le Shigelle in grado di crescere su agar SS danno origine a colonie incolori ma prive di centro nero.

La crescita microbica

Per crescita si intende un aumento del numero di cellule di una popolazione. Una specie è mantenuta solo

come risultato di una continua crescita della popolazione. La crescita continua fino a quando la cellula madre

si divide in due nuove cellule figlie: questo processo è chiamato scissione binaria. La divisione avviene dopo

che la cellula madre ha aumentato il proprio volume e ha duplicato tutte le componenti cellulari necessari.

Dalle introflessione della membrana citoplasmatica e della parete cellulare si ferma un setto.

Crescita di una popolazione batterica

Durante un ciclo di divisione cellulare tutti i componenti cellulari raddoppiano, si definisce:

Generazione: intervallo di tempo in cui si formano le cellule figlie a partire da una.

Tempo di generazione: tempo necessario per duplicarsi, è variabile e dipende dal terreno di crescita

utilizzato. G= t/n aka durata della crescita esponenziale/n° di generazioni

Crescita esponenziale: è un modello di crescita della popolazione in cui in un dato intervallo di tempo

raddoppia il numero di cellule, la velocità d’incremento del numero delle cellule è bassa nella fase

iniziale ma aumenta sempre di più con il passare del tempo, quindi negli stadi successivi della crescita,

l’aumento del numero di cellule è esplosivo.

L'aumento del numero di cellule durante la crescita esponenziale di una coltura batterica è una progressione

geometrica in base 2. Esiste una relazione tra il numero di cellule presenti inizialmente in una cultura è il

numero di cellule presenti dopo un certo periodo di crescita esponenziale. Conoscendo il numero iniziale e

finale di cellule si può ottenere il numero di generazioni. N= N 2

n

0

Ciclo di crescita

Quando un microrganismo colonizza un nuovo ambiente, il suo modo di moltiplicarsi non è costante ma

dipende dalle caratteristiche dell'ambiente, dalla temperatura e dal tipo di microrganismo.

Riportando su un grafico cartesiano,in ascissa il tempo ed in ordinata il numero di cellule vitali, si ottiene la

curva di crescita batterica, che ci dà un'indicazione dell'andamento della crescita in una popolazione

batterica. In una coltura chiusa, in provetta o in una fiasca (detta in Batch) la crescita non può continuare

all'infinito.

Comunque la curva può essere divisa in quattro sezioni:

Fase di latenza (fase lag):è il periodo impiegato dal microrganismo ad adattarsi all'ambiente. Se una

cultura in fase di crescita esponenziale è trasferita in un terreno con la stessa composizione mantenendo

inalterate tutte le condizioni di crescita non si osserva una fase di latenza. Quando l'inoculo è formato da

cellule danneggiate si osserva una fase di latenza necessarie le cellule per riparare il danno subito e ciò si

osserva anche quando una popolazione batterica viene trasferita ad un terreno più ricco ad uno più povero.

Fase di crescita esponenziale (fase log):dove il microrganismo si moltiplica velocemente,

sfruttando al massimo le risorse dell'ambiente. È possibile mantenere le colture in questa fase trasferendo i

batteri in nuovi terreni (coltura continua).

• Fase stazionaria :dove il microrganismo arresta la sua crescita, poiché uno o più nutrienti sono

terminati. I batteri che si dividono e quelli che muoiono sono in equilibrio, alcune cellule entrano in uno

stato di latenza in attesa di condizioni migliori. Alcuni batteri in questa fase iniziano a produrre metaboliti

secondari(es. antibiotici), che il batterio usa per ridurre la competizione, ostacolando la vitalità di

microrganismi potenziali competitori.

• Fase di declino (o di morte):dove il numero di microrganismi comincia ad abbassarsi, poiché le

cellule morte

iniziano a superare quelle in divisione o in latenza.

MISURAZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA DIRETTA

1. Conta totale

Il numero di cellule di una popolazione può essere determinato mediante conta diretta microscopio che può

essere fatta sia su campioni essiccati sia su campioni sospesi in un liquido utilizzando speciali camere di conta.

Lo spessore tra il reticolo e il vetrino copri oggetto è noto ed è quindi possibile determinare il volume di

sospensione batterica contenuta in ogni riquadro. Si contano le cellule presenti in ogni riguardo del reticolo al

microscopio, tale valore è convertito il numero di cellule per mm di sospensione. Tuttavia questo metodo

presenta diversi limiti:

• è impossibile distinguere tra cellule vive e cellule morte,

• è difficile individuare cellule di piccole dimensioni, risulta difficile ottenere stime precise,

• è necessario utilizzare il microscopio a contrasto di fase se il campione non è colorato.

• Bisogna immobilizzare le cellule prima della conta

• è un metodo inadeguato per sospensioni a bassa densità.

Questo metodo, utilizzando un singolo terreno e una serie di condizioni di crescita, permette un'attenta analisi

delle condizioni che hanno determinato lo sviluppo solo di un sottogruppo della popolazione totale.

2. Conta vitale o conta in piastra

Si definisce vitale una cellula capace di dividersi e dare origine ad una progenie una conta vitale consiste nel

determinare il numero delle cellule di un campione in grado di formare colonie su un terreno opportunamente

agarizzato. Questo tipo di conta si può eseguire con:

• Il piastramento in superficie in cui un volume noto di una cultura opportunamente diluita, viene

distribuito con una spatola di vetro sterile sul terreno agarizzato. La piastra viene incubata fino alla

comparsa delle colonie che vengono quindi contate.

• Il piastramento per inclusione in cui un volume noto di una coltura viene pipettato in una piastra

sterile e successivamente viene aggiunto un terreno agarizzato fuso e il tutto viene mescolato. Il

microrganismo incluso deve essere in grado di sopportare temperature di 45°/50°C. Le colonie così

non si formano solo in superficie ma nell'intera piastra.

La conta in piastra consente, grazie all'impiego di terreni altamente selettivi, di ottenere informazioni

attendibili sull'analisi microbica di campioni come le acque di rifiuto o gli alimenti.

In entrambi i casi è importante che il numero di colonie che sviluppano non sia troppo elevato o troppo basso:

l'affollamento determinerebbe un conteggio sottostimato; la carenza, diminuisce la significatività statistica del

numero di cellule calcolate.

Diluizioni scalari

La pratica corrente che è anche quella statisticamente è più valida come sistema contare le piastre

che contengono un numero di colonie compreso tra 30 e 300.

Per ottenere un numero di colonie appropriato molto spesso il campione da comprare deve essere

diluito. Poiché raramente si conosce, anche solo approssimativamente, il numero delle colonie, di

solito è necessario effettuare più di una diluizione, utilizzando una serie di diluizioni scalari in base

10.

Per ottenere una diluizione di 10 volte (10-1), si possono mescolare 1 ml di campione con 9 ml di

diluente.

Procedimento:

1. Operando sotto una cappa sterile, preparare 10 tubi sterili con 9 ml di soluzione fisiologica, siglandoli con

10-1 10-10).

l’indicazione della diluizione della coltura che sarà effettuata (da a

2. Prelevare 1 ml di sospensione batterica da una coltura di Escherichia coli e addizionarlo alla soluzione

10-1.

fisiologica contenuta nel tubo siglato

3. Agitare pochi secondi sul vortex per rendere omogenea la sospensione batterica.

10-1

4. Prelevare 1 ml di sospensione batterica dalla diluizione e addizionarlo alla soluzione fisiologica

10-2,

contenuta nel tubo siglato agitando sul vortex.

10-10.

5. Ripetere le stesse operazioni fino alla diluizione

6. Prelevare 0,1 ml da ciascuna diluizione e versarli al centro di altrettante piastre di terreno solido LB

agar.

7. Distribuire con una spatola monouso la sospensione batterica su tutta la superficie della piastra.

8. Capovolgere le piastre ed incubarle a 37°C per 12-15 ore.

9. Individuare la piastra di terreno ottimale per la conta e contare il numero di colonie cresciute.

10. Calcolare il titolo iniziale della coltura batterica di partenza (CFU/ml) applicando la formula:

(numero di colonie / 0,1 ml) x fattore diluizione.

MISURAZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA INDIRETTA

Un metodo per stimare il numero di cellule consiste nell'effettuare misure di torbidità. Una sospensione

cellulare appare torbida perché ogni cellula riflette la luce; tanto più è torbida tanto maggiore è la luce riflessa

e il numero di cellule presenti.

La torbidità può essere misurata da due strumenti che fanno p

Dettagli
Publisher
A.A. 2016-2017
8 pagine
SSD Scienze biologiche BIO/19 Microbiologia generale

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher xxrox92 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Università degli Studi di Catania o del prof Campanile Floriana.