Microbiologia

TERMINE DELLA REPLICAZIONE

La replicazione termina quando il replisoma giunge

ad un sito, definito terminatore della replicazione,

posto dalla parte opposta a quella dell’origine di

replicazione. Nella regione di terminazione ci sono

alcune sequenze di DNA che definiscono i siti Ter,

riconosciuti dalla proteina Tus, responsabile del

blocco della forca replicativa. Quando la

replicazione è completa le due molecole circolari

sono legate insieme. Questo legame è risolto da un

enzima di nome TOPOISOMERASI IV.

METODI MOLECOLARI PER L’IDENTIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI (Estrazione e quantificazione di acidi nucleici)

ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

Si esegue un isolamento di DNA o RNA da tessuto o da cellule eucariotiche o procariotiche, è possibile estrarre acidi

nucleici partendo dai compartimenti cellulari in cui essi sono presenti, possibili fonti sono:

- Tessuti animali

- Tessuti vegetali

- Cellule eucariotiche o procariotiche

- Virus

- Mitocondri o cloroplasti

- Liquidi biologici

L’estrazione degli acidi nucleici è il primo passo nelle applicazioni di biologia molecolare. Esiste una serie di metodi,

tra i quali la scelta si effettua sulla base del:

• Materiale di partenza (organo intero, tessuto, coltura cellulare, sangue, liquido biologico, coltura

microbiologica pura o mista, matrice alimentare, ambientale…).

• Tipo di acido nucleico desiderato (ssDNA, dsDNA, RNA).

• Applicazione post-estrazione prevista (PCR, sequenziamento, clonazione, restrizione enzimatica).

• La qualità dell’acido nucleico estratto (quantità e purezza).

L’estrazione degli acidi nucleici dai vari materiali biologici procede in diverse fasi:

1. Rottura e lisi cellulare

2. Allontanamento delle membrane

3. Allontanamento dei lipidi, proteine e carboidrati (estrazione fenolica)

4. Estrazione eterea (per allontare il fenolo)

5. Allontanamento e distruzione di DNA o RNA (facoltativo)

6. Precipitazione alcoolica e purificazione degli acidi nucleici

7. Dosaggio

NUCLEASI

Le nucleasi si trovano sulla pelle, per cui si devono evitare contatti diretti od indiretti tra mani ed acidi nucleici, le

nucleasi sono enzimi che distruggono gli acidi nucleici, si distinguono in:

DNAsi – richiedono ioni metallici per la loro attività, sono termolabili e facilmente inattivate da agenti

 chelanti e dalla sterilizzazione in autoclave.

RNAsi – non hanno bisogno di cofattori, possono adsorbirsi a vetro e plastica e rimanere attive, sono attive

 entro un ampio range di pH e resistono alla sterilizzazione in autoclave.

La rottura e la lisi cellulare possono avvenire secondo metodi meccanici oppure mediante metodi non meccanici:

Omogenizzatore

o Vibrazioni ultrasoniche

o Sfere di vetro

o Schock termico

o Shock osmotico

o Digestione enzimatica (es. lisozima per la parete batterica)

o Detergenti o solventi organici (SDS, Triton, acetone, toluene)

o LISI BLANDA (batteri) permette la formazione di piccoli pori nella membrana utilizzando il Triton e lisozima,

o in questo modo è possibile isolare solo DNA plasmidico mentre il DNA cromosomiale rimane attaccato alla

membrana interna.

LISI SPINTA in cui le membrane vengono completamente frantumate utilizzando detergenti anionici quali

o SDS. Con la lisi spinta si isolano acidi nucleici totali (DNA cromosomiale, mRNA, rRNA, tRNA,ecc).

ALLONTANAMENTO DELLE MEMBRANE

A tal scopo si procede con una centrifugazione che permette la separazione SOVRASTANTE

di due fasi, una superiore (sovrastante) che contiene gli acidi nucleici in soluzione

ed una inferiore (pellet) che comprende membrane e frammenti cellulari.

DEPROTEINIZZAZIONE PELLET

Dopo la rottura della membrana plasmatica si otterrà una miscela complessa costituita da varie componenti cellulari

come il DNA, RNA, lipidi, mono e polisaccaridi, proteine e sali. La rimozione delle proteine dal lisato cellulare è una

tappa importante perché tra le proteine sono presenti enzimi capaci di degradare gli acidi nucleici, vi è inoltre la

presenza di proteine capaci di legarsi agli acidi nucleici impedendone la funzione e/o la purificazione.

Per questo motivo si impiegano:

• Cloroformio – alcool isolamilico

Le proteine formano un gel all’interfase cloroformio-acqua, mentre gli acidi nucleici rimangono in soluzione.

• Sodio dodecil solfato SDS

Detergente anionico che si lega alle proteine alterandone la struttura secondaria.

• Enzimi proteolitici:

- PROTEINASI K: una endopeptidasi aspecifica molto attiva.

- PRONASI: miscela di almeno 4 enzimi proteolitici, di cui due endopeptidasi (serina e metallo-proteasi) e due

esopeptidasi (carbossi e ammino-peptidasi).

• Fenolo

Una o più estrazioni fenoliche elimina residui proteici e lipidici (il fenolo si lega al core delle proteine

denaturandole ed è inoltre un solvente dei lipidi)

- Fenolo a pH basico (inibisce la DNAsi), usato per l’estrazione di DNA.

- Fenolo a pH acido (inibisce la ribonucleasi), utilizzata per RNA.

Dopo la centrifugazione si ottengono tre fasi:

1) Superiore che contiene la soluzione

di acidi nucleici;

2) Interfase di proteine denaturate;

3) Inferiore fase fenolica contenente

lipidi e proteine ricche di aminoacidi

idrofobici;

4) ESTRAZIONE ETEREA, si preleva quindi la

la fase superiore che viene poi

sottoposta ad estrazione eterea allo

scopo di allontanarne eventuali

residui di fenolo. Dopo la centrfugazione l’etere localizzato nella parte superiore del tubo viene allontanato.

La soluzione risultante costituisce la miscela di acidi nucleici.

5) ALLONTANAMENTO DI DNA O RNA, è possibile a questo punto eliminare uno dei due componenti, l’RNA

previo trattamento con ribonucleasi (RNAsi) mentre il DNA con l’uso di deossiribonucleasi (DNAsi).

La RNAsi viene usata per eliminare l’RNA in preparazione di DNA, la DNAsi invece viene usata per eliminare il

DNA che contamina le preparazioni di RNA.

6) PURIFICAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

La fase finale dell’estrazione è costituita dalla precipitazione

alcolica. La preparazione del DNA deproteinizzato è

miscelata con 2 volumi dietanolo assoluto, in presenza di

cationi monovalenti (acetato di sodio, acetato d’ammonio,

cloruro di sodio) e viene lasciata precipitare a -80°C.

L’alcool etilico determina modificazioni strutturali degli acidi nucleici che ne inducono l’aggregazione e quindi la

precipitazione. Tale precipitazione è fortemente dipendente dal raggiungimento di una massa critica. Per soluzioni a

concentrazione <10 μg/ml è opportuno aggiungere un carrier: t-RNA di lievito che non interferirà con le reazioni

enzimatiche alle quali il DNA sarà sottoposto.

Si può usare anche l’isopropanolo, che è più vantaggioso perché consente di operare con volumi infeiori, ma ha lo

svantaggio di essere meno volatile dell’etanolo e quindi più difficile da rimuovere.

Inoltre il saccarosio ed il cloruro di sodio coprecipitano con il DNA.

LAVAGGIO CON PELLET

Dopo la centrifugazione, i pellet di DNA vanno lavati in etanolo al 70 % e ricentrifugati.

Tale lavaggio allontana i sali, insolubili in tale solvente, ma non è in grado di allontanare il cloruro di sodio.

RISOSPENSIONE DEL DNA

Il DNA viene risospeso in un tampone a bassa forza ionica, in genere TE (Tris-EDTA) a pH 7,6- 8,0.

L’acido nucleico può quindi essere dosato ed essere utilizzato per ulteriori procedure quali digestione con

endonucleasi di restrizione, marcatura, ecc.

ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI UTILIZZANDO DEI KIT COMMERCIALI

I kit per l’estrazione degli acidi nucleici hanno il vantaggio di fornire reagenti standardizzati e di qualità garantita

dando così un elevato grado di affidabilità. L’estrazione automatizzata mediante strumenti consente di estrarre il

DNA senza alcun intervento manuale (circa 45’). Molti prodotti commerciali garantiscono facilità d’uso,

riproducibilità ed elevato livello di purificazione. Si basano essenzialmente sull’utilizzo di:

– Resina a scambio ionico.

– Matrice silicee.

– Gel filtration.

– Ultrafiltrazione.

QUANTIFICAZIONE – METODO DELLO SPETTROFOTOMETRO

Gli acidi nucleici assorbono la luce UV con un massimo alla lunghezza

d’onda di 260 nm. Tale assorbimento è determinato dalle basi azotate,

per cui è caratteristico del DNA a doppio e singolo filamento e dell’RNA.

1 A i DNA o doppio filamento = 50 μg/ml

260

1 A di RNA = 40 μg / ml

260

Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza della preparazione

degli acidi nucleici. Preparazioni pure di DNA hanno valori di A260/A280

uguali a 1,8 mentre preprazioni pure di RNA hanno valori di A260/A280 uguali a 2.

L’assorbanza a 230 nm indica la contaminazione del campione, dovuta a carboidrati, fenoli, peptidi o composti

aromatici. Per campioni puri il rapporto A260/A230 dovrebbe essere circa 2.2.

METODI MOLECOLARI PER L’IDENTIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI

(Metodi coltura dipendenti ed indipendenti, PCR e elettroforesi)

Per BIODIVERSITÀ o “diversità biologica” i intende la

variabilità degli organismi viventi qualsiasi fonte, inclusi,

tra l’altro gli ecosistemi terrestri, marini e gli altri ecositemi

acquatici e i complessi ecologici dei quali fanno parte.

Essa comprende la diversità all’interno di ogni specie, tra le

specie e degli ecosistemi.

METODI PER L’ANALISI DEI MICRORGANISMI E DELLE

COMUNITÀ MICROBICHE

• METODI COLTURE DIPENDENTI (CONVENZIONALI) – Permettono l’ISOLAMENTO dei microrganismi

mediante l’impiego di terreni selettivi specifici per la crescita seguito da una CARATTERIZZAZIONE mediante

saggi fisiologici e metabolici.

• METODI COLTURE INDIPENDENTI (MOLECOLARI) – Tecniche che prescindono dalla coltivabilità di un

microrganismo. Consentono di monitorare la COMPOSIZIONE e le DINAMICHE di popolazione delle comunità

microbiche presenti in varie matrici (acqua, suolo, reflui, etc) senza ricorrere a isolamenti preventivi.

METODI COLTURA-DIPENDENTI

Costituiscono le cosidette “procedure standard” di identificazione dei microrganismi. Prevedono:

1) ISOLAMENTO in COLTURA PURA

2) CARATTERIZZAZIONE fenotipica degli isolati ottenuti sulla base di caratteristiche morfologiche, biochimiche e

della composizione chimica cellulare.

I limiti di questo approccio non è applicabile indifferentemente a qualsiasi specie microbica.

Necessita quindi di essere adattato e ottimizato di volta in volta sulla base della matrice (ambientale e/o alimentare)

da analizzare e dei ceppi microbici in studio. Le tecniche proprie della tassonomia fenotipica forniscono risultati a

volte incerti e di difficile interpretazione. I m