Microbiologia

Microbiologia forestale

La microbiologia si occupa dello studio e della comprensione del mondo microbico, della diversità e dell'evoluzione di quest'ultime, di ciò che fanno nell'ambiente, nel corpo umano, negli animali e nelle piante. Si interessa quindi di quei organismi di dimensioni inferiori a 0,1 mm che prendono appunto il nome di microrganismi. Le cellule microbiche sono entità autonome che portano avanti i loro processi vitali indipendentemente da altre cellule, comprendono principalmente: batteri, lieviti e muffe (funghi), micro alghe, protozoi e virus (microrganismi acellulari, parassiti obbligati). I microrganismi influenzano e supportano tutte le altre forme di vita, per questa la microbiologia si occupa della comprensione dei fenomeni legati al mondo microbico e all'applicazione della nostra comprensione dei processi della vita microbica a beneficio delle necessità dell'uomo e del nostro pianeta.

Cellula

La cellula è l'unità fondamentale della vita, isolata dalle altre per mezzo di una membrana. Si distinguono cellule procariote prive di un vero e proprio nucleo e meno evolute rispetto all'eucariote dotate di un vero e proprio nucleo. Le caratteristiche essenziali delle cellule sono quelle proprietà di cui sono dotate tutte le cellule, ovvero:

• Metabolismo: le cellule assumono nutrienti e li trasformano espellendo i rifiuti. Si distingue un metabolismo genetico, coinvolto nella replicazione, trascrizione e traduzione, ed un metabolismo catalitico, implicato nei processi energetici e di biosintesi.
• Crescita: i nutrienti assunti dall'ambiente vengono convertiti in nuovi materiali cellulari per formare nuove cellule.
• Evoluzione: le cellule evolvono per acquisire nuove proprietà, gli alberi filogenetici mostrano le relazioni evolutive.

Vi sono poi delle determinate proprietà che appartengono solo ad alcune cellule:

• Differenziazione: alcune cellule possono formare strutture cellulari come una spora.
• Comunicazione: le cellule interagiscono tra loro attraverso messaggi chimici.
• Scambio genetico: le cellule possono scambiarsi geni attraverso molti meccanismi diversi.
• Motilità: alcune specie sono in grado di spostarsi autonomamente.

Microrganismi e loro ambiente naturale

Popolazione – gruppi di cellule derivanti da una singola cellula parentale per successive divisioni cellulari.

Habitat – l'ambiente in cui vive una popolazione microbica.

Comunità microbiche – l'insieme di più popolazioni che occupano lo stesso habitat e sono metabolicamente correlate. La diversità e l'abbondanza dipendono dalla quantità di nutrienti e dalle condizioni ambientali, si instaurano delle interazioni che possono essere di tipo vantaggioso, neutrale o dannose.

Ecosistema – organismi viventi ed i componenti fisico-chimici del loro ambiente.

Diffusione ed evoluzione della vita microbica

La vita sulla terra era già presente circa 3,8 miliardi di anni fa. Circa 3 miliardi di anni fa i cianobatteri cominciarono a immettere lentamente ossigeno nell'atmosfera, ma il livello attuale di O₂ non fu raggiunto fino a 500-800 milioni di anni fa. Gli eucarioti sono cellule nucleate che includono sia microrganismi sia organismi multicellulari. I tre domini evolutivi degli organismi cellulari sono: Bacteria, Archaea ed Eukarya (LUCA = antenato universale comune).

Gli Archaea ed Eukarya si separano molto tempo prima della comparsa, nei reperti fossili, delle prime cellule nucleate con organelli. I microrganismi sono una porzione abbondante della biomassa della terra e sono coinvolti nei cicli biogeochimici (C, S, N…).

Radici storiche della microbiologia

Diversi scienziati pionieri contribuirono alla nascita della moderna microbiologia. Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) fu lo scopritore dei batteri, Louis Pasteur (1822-1895) studiò i meccanismi di fermentazione e sconfisse la teoria della generazione spontanea (i microbi precedentemente si riteneva che nascessero dal nulla, creandosi da soli), creò il vaccino della rabbia ed altri principi di immunizzazione, creò il metodo della pastorizzazione. Robert Koch (1843-1910) stipulò i postulati di Koch, isolò microrganismi in colture pure e scoprì gli agenti eziologici della tubercolosi e del colera e compì diverse osservazioni al microscopio. La sconfitta della teoria della generazione spontanea avvenne mediante l'esperimento di Pasteur con la fiasca a collo di cigno. Nel punto (c) il liquido va in putrefazione poiché i microrganismi entrano insieme con la polvere. La curvatura della fiasca permette all'aria di entrare (elemento essenziale delle fiasche di Pasteur), ma impedisce l'ingresso dei microrganismi.

Postulati di Koch

• Il sospetto patogeno deve ritrovarsi in tutti i casi di malattia ed essere assente in animali sani. Prendere il sangue da animali infetti/malati, il sospetto patogeno deve essere presente nel sangue, mentre nell'animale sano deve essere assente.
• Il sospetto patogeno deve poter crescere in una coltura pura. Il sospetto patogeno deve crescere solo nel terreno contenente il campione dell'animale malato e deve essere presente nel campione dell'animale sano.
• Le cellule provenienti da una coltura pura del sospetto patogeno devono indurre la malattia in animali sani. Infettando così individui sani con il sospetto patogeno, gli animali devono ammalarsi.
• Il sospetto patogeno deve poter essere nuovamente isolato e se ne deve poter dimostrare l'identità con l'originale.

Isolamento dei microrganismi

Ogni colonia batterica si origina da una singola cellula batterica che cresce fino a produrre una massa di cellule visibile in piastra ad occhio nudo (colonia). Ogni colonia ospita una popolazione di cellule identiche cioè una coltura pura. Per isolare un batterio si deve lavorare in condizioni di steriltà prendendo un'ansa sterile (sotto cappa o vicino al becco Bunsen) e la si striscia nel terreno ripetendo l'operazione più volte. I primi terreni solidi utilizzati erano inizialmente la patata e la gelatina, la quale presentava il problema che fondeva a temperature elevate. Queste sostanze sono state poi soppiantate dall'agar (polisaccaride derivante dalle alghe rosse) usato come principale terreno di coltura, specialmente per le piastre Petri.

Strutture e funzioni delle cellule microbiche

L'albero filogenetico della vita come definito dal confronto delle sequenze dell'RNA ribosomiale mostra i tre domini degli organismi e alcuni gruppi rappresentativi di ciascun dominio. Tutti i Bacteria e gli Archea e la maggior parte degli Eukarya sono organismi microscopici; solo piante, animali e funghi contengono macrorganismi. LUCA: ultimo antenato universale comune. Le cellule eucariote e procariote si distinguono rispettivamente per la presenza e l'assenza del nucleo. Nei procarioti vi è inoltre l'assenza del reticolo endoplasmatico e dell'apparato di Golgi. In questo tipo di cellule vi è la presenza di un nucleoide, ovvero una massa aggregata di DNA (superavvolto) che costituisce il cromosoma delle cellule di Bacteria e Archea. Può inoltre essere presente del DNA extracromosomiale contenuto all'interno di strutture circolari denominate plasmidi.

Forma e dimensioni della cellula procariote

La morfologia di una cellula ne indica la sua forma. I batteri di tipo peduncolati e filamentosi non sono molto comuni.

Cocchi: bastoncini, spirilli

Spirochete: batteri peduncolati, batteri filamentosi

Divisione batterica ed organizzazione cellulare

La divisione batterica è una divisione simmetrica: i costituenti chimici della parete sono equamente distribuiti tra le due cellule, la madre perde la propria identità. La replicazione del DNA precede la formazione del setto.

• Diplococchi (2 cocchi insieme)
• Streptococchi (più cocchi insieme)
• Tetradi (4 cocchi insieme)
• Sarcine (8 cocchi insieme)
• Stafilococchi (grappoli di cocchi in numero variabile)
• Bacilli: diplobacilli, coccobacilli, streptobacilli

Il significato delle dimensioni ridotte

I procarioti hanno dimensioni variabili da 0,2 μm a circa 50 μm di diametro fino a raggiungere un massimo di 750 μm (dimensione tipica di 1-2 μm). Gli eucarioti invece, hanno dimensioni che partono da 10 e possono superare i 200 μm di diametro. Il vantaggio di essere di ridotte dimensioni rispetto alle cellule di grandi dimensioni è una maggiore superficie esterna, in rapporto al volume, quindi possono sostenere più intensi scambi di sostanze nutritive per unità di volume cellulare ed inoltre tendono a crescere più velocemente delle cellule grandi ed una data quantità di risorse sosterrà una popolazione più grande di cellule piccole piuttosto che di cellule grandi. Tuttavia, il limite inferiore che non può essere superato è di 0,1 μm, poiché si avrebbe un volume insufficiente per ospitare le componenti essenziali di una singola cellula vivente, come proteine, acidi nucleici, ribosomi ed altro.

La membrana citoplasmatica nei procarioti

La membrana citoplasmatica consiste essenzialmente in un doppio strato fosfolipidico che ha il compito di separare il citoplasma e l'ambiente esterno alla cellula. Si identifica quindi all'interno della membrana una regione idrofila (amica dell'acqua) nella parte più esterna della membrana, a contatto quindi con l'acqua e formata da glicerolo e gruppi fosfato. La regione più interna viene definita invece idrofoba (paura dell'acqua), è costituita dalle code degli acidi grassi. I lipidi di membrana sono quindi rappresentati dai fosfolipidi, molecole formate da una molecola di glicerolo esterificata da due soli acidi grassi. Il terzo gruppo alcoolico del glicerolo è legato ad un radicale fosforico, che a sua volta lega un etanolammina (fosfoditiletanolammina). Sono presenti dunque un'estremità polare, la quale interagisce con l'acqua e viene per questo definita idrofila. Vi è poi un'estremità apolare insolubile in acqua definita come idrofobica.

Legame estere

Nel legame estere si legano un alcol ed un acido, liberando di conseguenza una molecola d'acqua e formando il legame con l'altro composto. La membrana fosfolipidica si tratta quindi di un doppio strato fosfolipidico con la presenza anche di oligosaccaridi, glicolipidi, proteine e opanoidi (presenti nelle membrane di cellule procariote, per esempio il diplotene) o gli steroli (presenti negli eucarioti come per esempio il colesterolo) le quali sono molecole planari rigide e fungono quindi da composti che rafforzano le membrane citoplasmatiche. Gli acidi grassi, in base al numero di doppi legami, possono distinguersi in saturi (assenza di doppi legami), monoinsaturi (1 doppio legame) e polinsaturi (più di un doppio legame).

Stati fisico-chimici della membrana citoplasmatica e meccanismi di regolazione

La membrana può trovarsi sotto forma di due diverse fasi, una fase cristallina rigida od una fase liquido-cristallina con una fluidità maggiore. I fattori che determinano la fluidità del doppio strato sono:

• Temperatura – diminuendo la temperatura la fluidità diminuisce ed aumenta di conseguenza la rigidità.
• Proteine – un maggior numero di proteine comporta una diminuzione della fluidità.
• Lunghezza delle catene aciliche – una maggiore lunghezza corrisponde ad una minore fluidità.
• Insaturazione degli acidi grassi – una maggiore insaturazione degli acidi grassi causa una maggiore fluidità del doppio strato.
• Colesterolo – una maggiore concentrazione di colesterolo comporta una maggiore rigidità.

I meccanismi di regolazione coinvolti nella fluidità della membrana plasmatica sono:

• Aumento/diminuzione della lunghezza delle catene di acidi grassi.
• Aumento/riduzione del grado di saturazione degli acidi grassi.
• Passaggio degli acidi grassi insaturi dalla conformazione CIS a quella TRANS e viceversa.

I doppi legami con configurazione CIS (che costituiscono la configurazione di quasi tutti gli acidi grassi insaturi naturali) causano un inginocchiamento della catena idrocarboniosa, per cui si riduce la lunghezza dei segmenti paralleli che interagiscono con le molecole vicine, ottenendo lo stesso effetto di un accorciamento della catena. Al contrario i doppi legami in conformazione TRANS hanno un effetto di gran lunga inferiore sulla fluidità di membrana, in quanto la catena idrocarboniosa mantiene quasi la stessa conformazione delle catene sature.

• Aumento/diminuzione della sintesi di fosfolipidi contenenti opanoidi (Procarioti) o steroli (Eucarioti).

Proteine di membrana

La superficie esterna della membrana citoplasmatica è rivolta verso l'ambiente e nei batteri Gram negativi interagisce con una varietà di proteine che legano substrati o processano grandi molecole per il trasporto nella cellula (proteine periplasmatiche). Il lato interno della membrana è invece rivolto verso il citoplasma e interagisce con proteine coinvolte nelle reazioni energetiche ed in altre importanti funzioni cellulari. Attraverso l'interazione si ha lo svolgimento di processi importanti del metabolismo energetico ed il trasporto. Si distinguono due principali tipologie di proteine:

• Proteine integrali – attraversano tutta la membrana e non facilmente rimovibili, vengono impiegate principalmente come trasportatori.
• Proteine periferiche – possono essere esposte sia nella parte interna che esterna, sono debolmente associate con la membrana e facilmente rimosse come ad esempio i recettori.

Le lipoproteine sono molecole che possiedono una coda lipidica che ancora la proteina alla membrana, le proteine possono avere una parte idrofila ed una idrofoba.

Membrana degli archea

I lipidi degli archea possiedono i legami di tipo etere tra il glicerolo e le loro catene laterali idrofobiche, a differenza dei batteri in cui si ha un legame di tipo estere. Le catene laterali degli archea sono costituite da unità ripetute di isoprene (idrocarburo idrofobico a 5 atomi di carbonio). La membrana citoplasmatica degli archea può essere costituita con:

• Dietere glicerolo = 2 legami etere legati ad un glicerolo, si ha la formazione del FITANILE format da 4 unità di isoprene, ognuna a 5 atomi di carbonio per un totale di 20 atomi di carbonio.
• Tetraetere diglicerolo = formato da 8 unità di isoprene fino a formare un BIFITANILE, le estremità delle catene laterali di fitanile, rivolte verso l'interno da ciascuna molecola di glicerolo, sono legate covalentemente a formare una membrana a monostrato lipidico compatto, non vi è uno spazio interno, ciò comporta una maggiore resistenza alla denaturazione del calore, ampiamente diffuse tra gli ipertermofili.

La struttura della membrana degli archea può dunque essere a doppio strato o a monostrato (o una miscela di entrambi i tipi).

Funzioni della membrana citoplasmatica

1. Membrana di permeabilità – previene le dispersioni e funziona come centro di transito per il trasporto di nutrienti da e verso la cellula.
2. Sito di ancoraggio – siti di molte proteine coinvolte nel trasporto, nella bioenergetica e nella chemiotassi.
3. Conservazione dell'energia – siti di origine e utilizzazione della forza proton-motrice, la membrana può esistere in una forma energeticamente carica nella quale si viene a creare una separazione tra protoni H⁺ e ioni ossidrile OH^- attraverso la superficie. Questa forza può essere impiegata dalla cellula durante le funzioni di trasporto, motilità e biosintesi di ATP.

Membrana citoplasmatica come barriera di permeabilità

All'interno della cellula è presente il citoplasma, una soluzione acquosa di sali, zuccheri, amminoacidi, nucleotidi, ecc. La membrana citoplasmatica impedisce il passaggio passivo (per diffusione) dei soluti all'interno della cellula verso l'esterno e viceversa. L'unica molecola che riesce ad attraversare la membrana con una certa facilità è l'acqua, una molecola debolmente polare, ma abbastanza piccola per passare attraverso le molecole di fosfolipidi. Il trasporto di acqua può essere accelerato da specifiche proteine di trasporto chiamate acquaporine.

Trasporto passivo e trasporto attivo

Nel trasporto passivo il movimento della sostanza avviene nella direzione del suo gradiente di concentrazione, da una alta concentrazione ad una bassa concentrazione. Non è richiesta l'uso di energia, le molecole si muovono secondo un gradiente di concentrazione. Nel trasporto attivo invece il movimento della sostanza avviene contro il suo gradiente di concentrazione, necessita di consumo di energia poiché il movimento delle molecole avviene contro gradiente, da bassa concentrazione ad alta concentrazione.

Diffusione

Nel trasporto passivo si può assistere ad una diffusione semplice oppure una diffusione facilitata.

1. Nella diffusione semplice o passiva le molecole si muovono dalla regione a più alta concentrazione a quella a più bassa, coinvolge molecole di acqua, anidride carbonica e ossigeno, ovvero molecole polari che passano le membrane in questo modo.
2. Nella diffusione facilitata invece la membrana plasmatica contiene diversi tipi di proteine che mediano l'interazione tra la cellula e l'ambiente esterno. Vi è la presenza di proteine canale come ad esempio le acquaporine, le quali sono proteine costituite da molte α-eliche. Funzionano da pori selettivi della membrana, sono formate quindi da un canale dentro la proteina per il passaggio di molecole senza bisogno di energia. Le proteine trasportatrici o permeasi o carrier sono invece delle proteine nelle quali la sostanza trasportata si lega ad un sito attivo del carrier, questo determina un cambiamento conformazionale che porta la sostanza trasportata dalla parte opposta della membrana, uno dei due lati si chiude o si apre. Le molecole si spostano secondo il loro gradiente di concentrazione.