Microbiologia - Secondo semestre e laboratorio

Microbiologia: secondo compito

Virus

I virus sono strutture subcellulari, nucleoproteiche, non in grado di vivere autonomamente, infatti sono parassiti strettamente obbligati. Sono agenti infettanti e contengono acidi nucleici. Hanno due proprietà: possono moltiplicarsi e possono essere soggetti a mutazioni.

I virus propriamente detti sono quelli che infettano le cellule eucariotiche e di solito penetrano interamente nella cellula da infettare, mentre i batteriofagi o fagi sono quelli che infettano le cellule procariotiche e di solito durante l'infezione rimangono attaccati al di fuori della cellula iniettando in essa solo l'acido nucleico. La loro replicazione avviene all'interno della cellula parassitata utilizzando i meccanismi biosintetici cellulari. Inoltre essi vengono chiamati virioni quando sono al di fuori della cellula da infettare.

Hanno dimensioni molto variabili, vanno da 20 nanometri a circa 280 nanometri e per questo non sono visibili al microscopio ottico. I virioni sono costituiti da un genoma circondato da un involucro protettivo proteico detto capside che può assumere diverse forme. La grande maggioranza presenta un capside icosaedrico detto testa che racchiude l'acido nucleico, DNA o RNA, che di solito è complessato con istoni: il tutto è detto nucleocapside.

Il capside è formato da subunità proteiche ripetute, dette capsomeri, che possono formare o un capside di tipo elicoidale oppure un capside di struttura icosaedrica. Il capside, nei batteriofagi, può presentare un rivestimento costituito da un doppio strato lipidico che può essere esterno o interno. Il nucleocapside può essere rivestito da un involucro chiamato pericapside o envelope che è formato da una membrana lipidica di origine cellulare (si origina infatti dalle membrane della cellula ospite) o altrimenti il virus viene detto nudo. Sul pericapside si trovano delle glicoproteine codificate dal genoma virale dette spicole.

Il capside ha due strutture fondamentali: di tipo elicoidale in cui si hanno unità proteiche identiche intorno all'acido nucleico oppure di tipo icosaedrico che invece ha 12 vertici, 20 facce e 30 spigoli e per poterlo formare sono sufficienti due tipi di proteine diverse che costituiscono gli esoni e i pentoni. Esso rappresenta la struttura di circa il 96% dei fagi (come il fago T4), mentre la restante parte è filamentosa (come il fago M13), in cui interviene una sola proteina. Presentano inoltre una coda di dimensioni comprese tra 10 e 800 nm, attaccata al capside che viene prodotta con un meccanismo complesso che richiede energia ottenuta dall'idrolisi di ATP.

Batteriofagi o fagi o virus dei procarioti

Acido nucleico dei fagi

Può essere RNA o DNA, a singolo o doppio filamento, lineare o circolare e costituito da un'unica molecola oppure essere segmentato. Le estremità dei genomi dei fagi con doppia elica di DNA possono essere costituite da sequenze ripetute oppure possono essere a singola elica e tra loro complementari (dette anche estremità coesive che si possono appaiare tra di loro). Alcuni fagi hanno basi insolite che vengono incorporate come tali al momento della replicazione o che contengono modificazioni post-replicative.

I genomi inoltre possono differire per il loro ingresso nella cellula: possono essere introdotti nel batterio in modo continuo e immediato o in fasi successive intervallate da brevi pause. La trascrizione può utilizzare la RNA polimerasi batterica o virale o richiederle entrambe. Al momento dell'ingresso nella cellula il DNA lineare o a doppia elica di molti fagi viene convertito in forma circolare in modo che poi possa replicarsi o seguendo il modello θ (in cui si separano le eliche nel sito di inizio della replicazione e si sintetizzano uno o due RNA innesco per la sintesi del filamento leading a seconda che la replicazione sia unidirezionale o bidirezionale) o seguendo il modello σ (in cui si ha l'incisione di un'elica e si utilizza l'estremità 3' come innesco per la DNA-polimerasi). Il fago lambda ad esempio inizia la sua replicazione seguendo il modello θ per poi finire con il modello σ. In altri casi il DNA può essere ridondante, ovvero presentare delle lunghe estremità ripetute che poi si possono collegare tra loro formando dei concatameri (come nel fago T4) o circolarizzare grazie proprio alla presenza di queste estremità.

Riproduzione dei fagi

A seconda della modalità di riproduzione i fagi si distinguono in temperati e virulenti. I primi possono dare luogo al ciclo litico o al ciclo lisogenico mentre i secondi danno luogo al solo ciclo litico. Nel ciclo lisogenico si ha la momentanea integrazione del genoma virale in quello batterico e questa situazione può persistere a lungo, rimanendo anche in seguito alle divisioni del batterio. Ad un certo istante può avviarsi il ciclo litico in maniera spontanea o indotta.

Il ciclo litico consta di 6 fasi:

• Adsorbimento
• Penetrazione dell'acido nucleico
• Espressione dei geni fagici
• Replicazione del genoma fagico
• Morfogenesi virale (assemblaggio dei componenti ed impacchettamento del genoma)
• Rilascio e disseminazione

In particolare si ha la sintesi di proteine virali necessarie per la replicazione, viene replicato il genoma fagico assieme alle proteine per la sintesi di nuovi virioni. Il nuovo genoma viene impacchettato nel virione. Ci sono due diversi sistemi di incapsidamento: uno si basa sul riconoscimento del genoma fagico da parte di proteine poste alla base del capside ed è chiamato ad “estremità fisse” o “a quantità fissa” e l'altro che invece si dice a “testa piena”, in cui si ha comunque un riconoscimento delle sequenze ma l'unico vincolo che presente è quello legato alle dimensioni della testa del virus.

Il modello “a quantità fissa” è tipico di lambda ed in particolare si svolge grazie ad una terminasi legata ad un vertice specifico della testa che riconosce una sequenza specifica sul DNA e la taglia in modo sfalsato generando così l'estremità a singola elica da cui inizia l'ingresso del DNA nel capside. Tale processo continua fino a che non si incontra un'altra sequenza di taglio che genera la sequenza complementare alla prima.

L'altro processo invece, lo ritroviamo nel fago T4 e anche qui è il capside che in qualche modo riconosce il DNA. Esso riconosce un sito sul concatamero e assume una quantità fissa di DNA, ovvero fino a che la testa non è piena. Nel caso di fagi filamentosi infine, il DNA viene incapsidato grazie alla costruzione del capside attorno ad esso mentre fuoriesce dalla cellula e questo è un processo che non causa la lisi della cellula. I processi tipici di lambda e del fago T4 invece sono processi di forte stress per la cellula che alla fine lisa permettendo il rilascio dei nuovi virus. Lambda ad esempio produce delle oline che bucano la membrana e delle endolisine che digeriscono la parete.

Ciclo unico di crescita

I due studiosi Ellis e Delbruck si occuparono di studiare come avveniva il fenomeno della replicazione virale ponendo in una coltura di E. Coli campioni del fago T2. Nei primi minuti dopo l'aggiunta del fago i virioni si associano in maniera irreversibile alle cellule batteriche secondo una cinetica di primo ordine. Ciò è facilmente verificabile centrifugando a bassa velocità un campione di cellule infettate, infatti le UFP sedimentano insieme alle cellule e non rimangono nel surnatante.

Per circa mezz'ora si ha la fase di latenza in cui il titolo delle UFP rimane costante, dopo di che si ha un'improvviso aumento del titolo delle UFP, fase che è chiamata fase di scoppio o di lisi. Il rapporto tra cellule infettate e le UFP al termine di tale fase è chiamato numero di scoppio e rappresenta il numero medio di UFP prodotti da una singola cellula infettata. Questo è un esperimento importante, in quanto non solo ha fornito un metodo di studio della replicazione virale, ma ha anche permesso di potersi interrogare sulla natura del rapporto che c'è tra virus infettante e progenie prodotta.

T4 e ciclo litico

Questo fago appartiene ai fagi della serie T ed in particolare fu uno di quelli studiati da Delbruck. Egli con i suoi collaboratori prese in esame in particolare i fagi della serie pari poiché avevano due caratteristiche che li accomunavano: la prima è che si sviluppano all'interno della cellula ospite indipendentemente dall'integrità del materiale genetico e ne bloccano il metabolismo e la seconda è che la citosina è sostituita dalla idrossimeticitosina.

Il capside è icosaedrico allungato e ad esso è attaccata la coda costituita da una doppia struttura tubulare: la parte più esterna è quella contrattile che è formata da una guaina proteica. La coda termina con una piastra basale esagonale a cui sono attaccate le lunghe fibre della coda. All'inizio dell'infezione, l'adesione avviene grazie al riconoscimento di un residuo di glucosio presente nel nocciolo esterno del LPS e di una proteina OmpC. In seguito il tubo interno penetra nella cellula da infettare grazie alle contrazioni della guaina più esterna. Tra la testa e la coda si ha una sorta di collare che raggruppa sei piccole fibre, mentre sei fibre più lunghe sono ancorate alla piastra basale.

Il fago T4 usa le sue fibre della coda per legarsi specificamente al recettore sulla superficie del batterio da infettare, per esempio E. Coli. In particolare sul virus si hanno degli antirecettori complementari ai recettori presenti sulla cellula. In seguito alla contrazione delle fibre della coda il fago inietta il suo DNA all'interno della cellula ospite. Il capside vuoto adesso è come un fantasma al di fuori della cellula. Il metabolismo cellulare viene regolato dal DNA fagico: vengono prodotte proteine fagiche, nucleotidi del DNA cellulare degradato vengono utilizzati per creare le copie del genoma fagico. A questo punto le varie parti del fago si uniscono tra di loro: testa, coda e fibre.

Il fago produce lisozimi che digeriscono la parete batterica, si ha la perdita dell'equilibrio osmotico e la cellula lisa liberando i nuovi virioni.

Lambda e ciclo lisogenico

La testa è icosaedrica simmetrica, di tipo isometrico, è formata da due proteine E e D, presenti circa in 400 copie. Non presenta spine. La coda è costituita da un cilindro non contrattile ma flessibile con un'estremità conica composta da proteine diverse a cui si attaccano diverse fibre. Il suo genoma è costituito da DNA lineare a doppia elica, impacchettata senza contrarre rapporto con le proteine del capside e presenta geni organizzati in gruppi funzionali. Immediatamente dopo l'ingresso nella cellula tale genoma circolarizza grazie alle estremità coesive che vengono legate dalla DNA ligasi batterica.

Questo virus può attuare il ciclo lisogenico e il ciclo litico nella cellula ospite: il verificarsi o meno di questi processi dipende da una fine regolazione genica operata da proteine che agiscono in trans su una regione del suo genoma definita regione di controllo. I due promotori che codificano per le proteine legate ai due diversi cicli condividono lo stesso operatore e quindi, a causa dell'ingombro sterico, la RNA polimerasi non si può legare contemporaneamente. In particolare l'operatore è diviso in 3 parti: OR1, OR2 e OR3. Le proteine fondamentali per i due processi invece sono: CI, CII, CIII e Cro. CI è il repressore necessario per il ciclo lisogeno che impedisce la via del ciclo litico, CII è indispensabile per avviare la trascrizione di CI, CIII protegge CII dalla degradazione e Cro invece, è l'antirepressore ovvero un regolatore trascrizionale che impedisce l'espressione del gene cI consentendo l'attuazione del ciclo litico.

Quando lambda infetta una cellula vengono immediatamente trascritti i geni che si trovano sui promotori P_L e P_R: è la fase immediata precoce. La trascrizione si arresta su P_L dopo il gene N e su P_R dopo il gene cro. Questo significa che viene inizialmente prodotta la proteina cro. N è un antiterminatore che induce la RNA-polimerasi a proseguire con la trascrizione fino al gene int su P_L e ai geni O e P su P_R: questa è la fase ritardata precoce nella quale si ha la sintesi anche delle proteine CII e CIII. In seguito si ha la fase tardiva con la rispettiva trascrizione di geni.

Quindi quando lambda infetta una cellula le proteine Cro immediatamente prodotte si legano specificamente e in modo non cooperativo al sito OR3 impedendo alla RNA-polimerasi di attaccarsi e trascrivere nel senso di CI, ovvero di leggere dalla parte di P_RM (promotore per la trascrizione di CI). La RNA polimerasi può solo continuare a scorrere sul promotore di Cro, P_R. In questo caso si avrà il ciclo litico in cui i promotori P_L e P_R sono attivi.

Affinché si instauri il ciclo lisogeno deve intervenire CII. Essa agisce sul promotore del gene cI, P_RM, ed è suscettibile alle proteasi batteriche (essa deve venir protetta da CIII). CII viene prodotta quando cro viene trascritto ed è in grado di reclutare la RNA polimerasi in modo che legga il DNA sul filamento opposto a quello di cro e sintetizzi delle prime proteine CI. CII è molto instabile e la sua sintesi dipende da agenti ambientali. Essa inibisce la sintesi di Cro e quando si avrà un sufficiente numero di CI quest'ultima potrà legarsi all'operatore, in particolare con maggiore affinità OR1 e in seguito a OR2 in modo cooperativo. In questo modo la RNA polimerasi legge nella direzione del promotore P_RM e si ha il ciclo lisogeno. Quando è prodotta in grandi quantità si lega anche a OR3 e inibisce la sua stessa sintesi.

In particolare il vero fattore che sceglie quale via seguire è CII e la sua presenza è dovuta a fattori ambientali e alle quindi condizioni di vita del batterio. In genere se il batterio è sano e si replica velocemente è favorita la via litica mentre se è debole il fago preferisce integrarsi e aspettare tempi migliori. In caso di danni al DNA della cellula inoltre il fago è in grado di interrompere il ciclo lisogenico grazie alla proteina RecA che idrolizza il repressore e permette l'inserimento di Cro sull'operatore.

Fagi filamentosi (M13)

Hanno una struttura semplice e sono costituiti da un minor numero di proteine rispetto agli altri virus. M13 è lungo 1 micrometro, ha il capside formato da 5 tipi diversi di proteine tra cui anche quelle responsabili dell'adesione al pilo della cellula ospite. Essi penetrano attraverso l'adesione al pilo coniugativo di batteri come E. Coli ed utilizzano plasmidi ed enzimi della cellula ospite. Il genoma è costituito da una molecola di DNA circolare a singola elica.

La prima fase nel loro ciclo replicativo consiste nel passaggio a dsDNA circolare. Questi virus hanno sviluppato un particolare sistema poiché, il ssDNA non presenta il gruppo OH' all'estremità 3' e quindi per l'inizio della loro replicazione necessitano di inneschi a RNA che vengono prodotti da parte dell'RNA polimerasi o DNA primasi.

Saggio di placca

È un metodo che può essere utilizzato per misurare la concentrazione dei fagi nella sospensione di interesse. In particolare il sistema richiede un indicatore batterico ovvero una coltura batterica di un ceppo sensibile al fago che si vuole studiare. Il procedimento è il seguente: si semina in una piastra la coltura batterica e si attende fino a che non si ha la completa copertura di tutto il terreno (tappeto). Poi si aggiunge una coltura di fagi. Al termine dell'incubazione si avranno aree circolari trasparenti sul tappeto che saranno il luogo dove i batteri non sono cresciuti poiché lisati dai batteriofagi. Tali aree di lisi sono chiamate placche. Ellis e Delbruck in particolare dimostrarono che il numero delle placche è proporzionale alla concentrazione fagica ed è indipendente dalla temperatura e dalla concentrazione batterica e che la probabilità che una particella fagica formi una placca è di 0,4 in media. In buona approssimazione quindi ogni placca è il risultato dello sviluppo di una singola particella fagica che però viene chiamata unità formante placca UPF, poiché ciò che noi osserviamo sono le placche e non le entità che le generano.

Titolo = numero di placche di lisi / (volume sospensione virale X diluizione)

Virus propriamente detti (infettano cellule eucariote)

I virus degli animali hanno diverse forme e dimensioni e possono essere nudi o rivestiti ovvero presentare l'envelope. Essi possono avere simmetria elicoidale come nel caso del virus del mosaico del tabacco (TMV) oppure una struttura icosaedrica come nel caso degli adenovirus oppure ancora possono essere molto piccoli come i picornavirus e avere il DNA frammentato come nel caso degli orthomyxovirus.

Fasi dell'infezione

I virus degli animali vengono adsorbiti completamente al momento dell'infezione al contrario di quanto avviene nei fagi. Si hanno 6 fasi:

• Adsorbimento: si ha l'interazione specifica tra un recettore di membrana della cellula e gli antirecettori della molecola virale.
• Penetrazione e decapsidazione.
• Espressione genica e sintesi delle proteine virali: nel caso di virus a RNA questo processo avviene subito in quanto i ribosomi possono facilmente attaccarsi (è importante se il filamento è positivo o negativo: se l'RNA è positivo ha lo stesso senso dell'RNA messaggero, se è negativo deve essere copiato in uno positivo da una RNA-polimerasi-RNA-dipendente).
• Replicazione del genoma virale.
• Assemblaggio e maturazione dei virioni.
• Fuoriuscita dalla cellula: se il virus è dotato di pericapside, quest'ultimo verrà acquisito per gemmazione dalla membrana eucariotica.