Microbiologia

Lezione del 25/09/20 CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI

La più recente classificazione proposta da Carl Woese riconosce tre regni: Bacteria, Archea ed Eukarya (comprendente

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tutti gli eucarioti sia unicellulari che multicellulari che hanno una compartimentalizzazione cellulare). I procarioti si

distinguono in tre gruppi principali: archeobatteri ed eubatteri.

Gli Archea sono molto meno rappresentati rispetto a quella degli eubatteri sono microrganismi che si sono specializzati

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per colonizzare nicchie strane (ad esempio i metanogeni, che si sono specializzati nella produzione di metano;

termoacidofili che sono in grado di vivere in condizioni idi pH estremamente basse; alofili estremi che sono in grado di

vivere in ambienti con concentrazioni saline elevate).

La “vita microbica” sulla Terra ha dominato per più di 3-5 miliardi di anni.

Ancora oggi, i microrganismi sono i più numerosi tra tutti i gruppi di viventi, sono ubiquitari, e colonizzano tutti gli ambienti,

compresi quelli più estremi (dalle profondità oceaniche ai ghiacciai artici…), che ricordano la Terra ai primordi della sua

formazione.

Si ritiene contengano il 50% d C ed il 90% di N biologico presente sulla Terra sono intuitivamente alla base della catena



alimentare ed essenziali per il riciclo degli elementi.

I microrganismi fotosintetici competono con le piante per organicare CO e produrre O . I patogeni sono una minoranza. Sono

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per lo più innocui o benefici (Vitamine K e B).

Microbiota insieme dei microorganismi che popolano una determinata nicchia ecologica

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Microbioma è riferito al genoma, al DNA, della comunità microbica che risiede in un determinato ambiente

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I batteri si sono adatti a qualsiasi ambiente durante la loro evoluzione sulla terra ed attualmente isolati da:

• Sorgenti termali (Yellowstone Park)

• Ghiacciaio marino (Antartide) ad esempio i psicrofiri riescono a vivere a temperature basse

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• Saline (Thailandia)

• Area desertica rocciosa dell’Antartide (sono presenti solamente come licheni) 1

LA CELLULA

Le differenze principali sono:

• Nucleo con un nucleolo (nella cellula eucariotica) nei procarioti abbiamo il nucleoide

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• Gli organuli negli eucarioti separano le funzioni della cellula

• La cellula eucariotica è avvolta da una parete cellulare che ritroviamo in alcuni procarioti, come i funghi, che si perde

nelle cellule procariotiche superiori

Batteri ed archea in media hanno una dimensione di 1 micron −6

→ 10

I microrganismi eucariotici, ad esempio un lievito, hanno una dimensione più grande circa 10-20 micron (μm).

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La membrana nucleare è assente negli archea e negli eubatteri, mentre è presente negli eucarioti in cui abbiamo la presenza

di un nucleo propriamente detto.

Archea e Batteri sono in grado di fissare l’azoto elementare, mentre invece gli organismi eucarioti non sono in grado di farlo.

La crescita a temperature maggiori di 100° è possibile nel caso solo degli archea che si sono evoluti per colonizzare ambienti

estremi.

Come possono presentarsi i batteri nello spazio?

Solitamente i batteri Gram positivi si distinguono in base alla loro morfologia in:

• Cocchi hanno la caratteristica di essere cellule sferiche che possono disporsi nello spazio con diverse modalità.

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Generalmente sono immobili, cioè privi di quelle strutture superficiali (come i flagelli) che garantiscono la motilità

La divisione secondo un solo asse porta ad i diplococchi (cellule disposte in coppie che si si separano dopo la

o divisione cellulare) e agli streptococchi (cellule disposte in catene in quanto tendono a rimanere unite dopo la

divisione cellulare)

La divisione secondo due assi perpendicolari può generare le tetradi (4 cellule che rimangono disposte su un

o unico piano) ed i fogli monostratificati (cioè cellule disposte su un piano a formare “fogli” monostratificati)

La divisione secondo tre assi perpendicolari porta alla formazione delle sarcine (dei cubi di 8 cellule) se i

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o piani di divisione sono regolari e orientati, altrimenti se i piani di divisione sono irregolari si originano degli

ammassi che prendono il nome di stafilococchi (grappoli). Le sarcine non sono dannose per l’uomo.

• Bastoncelli o bacilli cellule cilindriche a forma di “bastoncello” che possono essere sia immobili che mobili (quando

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sono mobili hanno dei flagelli). I caratteri morfologici assunti come criteri tassonomici sono: sono caratteristiche

tintoriali, dimensioni, lunghezza, spessore, presenza e disposizione della spora nello sporangio, e la motilità-flagello

mediata.

Le cellule si dispongono nello spazio con una modalità che dipende dai piani della loro divisione la divisione cellulare e la

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disposizione sono criterio fenotipici tassonomici. La divisione dei batteri avviene per scissione binaria da una cellula madre

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si ottengono due cellule figlie, che sono geneticamente uguali alla madre, quindi si ha una modalità di riproduzione clonale

(sia per i cocchi che per i bastoncelli). I batteri non prostecati sono batteri che non hanno peduncoli.

→

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TASSONOMIA BATTERICCA “CONVENZIONALE”

L’unità tassonomica fondamentale è la specie, una categoria, sistematica naturalmente delimitata in base a:

• Interfecondità parentale

• Fertilità della progenie

La propagazione dei batteri è CLONALE, per cui la definizione di specie batterica è arbitraria, ma ragionevole: “Una

specie batterica è definita come un insieme di CEPPI (i singoli isolati) che condividono un determinato fenotipo

(determinato dal loro genotipo), che si mantiene stabile ed è diverso da quello che caratterizza altri insiemi di

ceppi.”

La validità di questa definizione si basa sul concetto di GENOMA EQUILIBRATO, che favorisce il mantenimento di specie

stabili e ben adattate a determinati ambienti, tramite:

• Selezione stabilizzante (negativa) che elimina deviazioni eccessive dovute a mutazioni

• Selezione divergente (positiva) che può costituire la base di ulteriore speciazione si verifica quando una

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specie si trova in un ambiente che non gli è più ottimale perché magari c’è carenza di nutrienti la pressione

selettiva fa in modo che la specie si adatti attraverso mutazioni, attraverso l’acquisizione di materiale genetico

dall’esterno può condurre alla morte dell’individuo e quindi alla selezione stabilizzante o alternativamente

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all’acquisizione di quel carattere

La definizione di specie batterica è, oggi, integrata con criteri genomici e genotipici GENOSPECIE.

SCELTA DEI CRITERI FENOTIPICI

Scelta di quei caratteri fenotipici che sono altamente conservativi e che possono permettere di stabilire SE un DETERMINATO

MICRORGANISMO (un isolato clinico od ambientale) APPARTIENE ad una specie già descritta o ad una NON ancora descritta

(specie di nuova identificazione?).

IDENTIFICAZIONE DI SPECIE: basata su criteri discriminativi STABILI, evidenziabili tramite saggi che siano ALTAMENTE

RIPRODUCIBILI, di FACILE ESECUZIONE ed UNIVOCA INTERPRESTAZIONE

Morfologia cellulare, compresa la presenza di spore

➢ Caratteristiche tintoriali

➢ Motilità

➢ Forma della colonia

➢ Tipo di metabolismo

➢ Suscettibilità ad antibatterici

➢ Habitat

➢ Sequenze geno-specifiche*

➢

IDENTIFICAZIONE DI TIPO: individuazione di cluster nell’ambito della specie (differenze intra-specifiche), tramite:

sierotipizzazione (sierotipo)

➢ biotipizzazione (biotipo)

➢ tipo della colonia (morfotipo)

➢ genotipizzazione sequenze geno-tipiche**

➢

* e **: utilizzate nella diagnostica molecolare e per tracciare linee di discendenza evolutiva

La morfologia normalmente è mantenuta e propagata, ma sono noti casi di differenziamento morfologico in risposta al variare

delle condizioni ambientali.

• vibrione agente eziologico del colera, che è dovuto dalla secrezione di una tossina colerica che comporta una

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diarrea talmente profusa (10 l al giorno) che può portare il paziente alla morte, non tanto per l’infezione, ma per lo

shock ipovolemico 3

Lo shock ipovolemico è lo stato di shock causato dalla diminuzione acuta della massa sanguigna circolante,

 causata da emorragia o da perdita di liquidi (ipovolemia).

• spirochete ha una forma a cavaturacciolo (una spirocheta è il treponema pallidum l’agente eziologico della

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sifilide, una tra le più comuni malattie sessualmente trasmissibili)

spirillo

•

• Clostridium tossina tetanica e botulinica

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• C. perifringens agente eziologico della gangrena gassosa

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La gangrena gassosa è una sindrome infettiva acuta a rapida diffusione, spesso mortale, in cui dei batteri

 producono gas e tossine.

• Neisseria meningitidis sono diplococchi Gram – (ci sono polimorfonucleati)

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• Staphylococcus aureus cocchi gram + (cristal violetto)

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• Streptococcus spp. forma a catenella (spp. sta ad indicare che non si sa qual è la specie)

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• Streptococcus pneumoniae diplococchi Gram +

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• Escherichia coli coccobacillo gram – (si replica ogni 20 minuti)

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Perché Mycobacterium tuberculosis (→ agente eziologico della tubercolosi) non può essere colorato con la colorazione

di Gram? Perché questo microrganismo ha una struttura della parete che è quasi del tutto impossibile da penetrare. Questo

microrganismo si replica ogni 24 h. La difficoltà nell’assumere sostanze esogene, nutrienti e quindi antibiotici rende il

trattamento molto complesso, infatti un trattamento antibiotico per un’infezione normale è di 7 giorni (è pericoloso

interrompere un trattamento antibiotico prima del tempo perché la pressione selettiva dell’antibiotico potrebbe agire

selezionando un ceppo resistente), mentre invece il tempo necessario per fare un trattamento antibiotico per la tubercolosi

è di circa 6 mesi con un pool di almeno 4 antibiotici diversi, con una serie di piccoli effetti collaterali (fegato e organi deputati

alla detossificazione del corpo)

Mycobacterium leprae è l’agente eziologico della lebbra.

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Preparazioni “a fresco” per mettere in evidenza strutture molto rifrangenti: LE SPORE BATTERICHE.

CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI 4

I batteri sono microrganismi unicellulari, procarioti, di dimensioni di solito nell’ordine di pochi micrometri, ma possono variare

dai 0.2 μm circa dei micoplasmi (sono microrganismi privi di parete), fino a 30 micron di alcune spirochete . 5

Lezione del 29/09/20

Per procedere all’identificazione di un microrganismo è indispensabile avere una coltura pura

1. Crescita in terreno liquido: partendo da una popolazione batterica mista non possono essere isolare le singole specie

presenti, se non procedendo alla loro semina su terreno solido.

2. Crescita su terreno solido: cellule depositate sulla superficie di un terreno solido nutriente iniziano a dividersi e dopo che

migliaia (fino a bilioni) di cellule si sono formate (24 h), si osservano masse cellulari ad occhio nudo: LE COLONIE. Queste

risulteranno ben separate dove le cellule, depositate sul terreno, erano altrettanto ben separate. Le cellule della colonia

derivano tutte da quella originariamente depositata sul terreno, quindi UNA COLONIA È UNA COLTURA PURA.

La morfologia della colonia può fornire informazioni utili che aiutano nell’identificazione del microrganismo isolato. Quali:

1. Forma e dimensioni: tonda, irregolare, puntiforme...;

2. Margini: netti, ondulati, lobati, frastagliati...

3. Colore: pigmentata, più o meno opaca, traslucida, ...

4. Elevazione: convessa, umbonata, piatta, sopraelevata...

5. Struttura: rugosa, secca, mucosa

Proteus mirabilis è l’agente eziologico di infezioni urinarie che tendono a risalire verso il rene. La colonia dopo essere

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stata inoculata al centro della piastra, essendo un microrganismo mobile (grazie alla presenza dei flagelli), si allontana dal

centro dove è stato depositato l’inoculo per cercare i nutrienti. Quindi, si diche che con la motilità swarming sciama sulla

piastra dando vita a questi fronti.

Klebsiella pneumoniae veicola un’informazione genetica particolare che porta ad esprimere un fenotipo resiste ai

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farmaci. Le colonie hanno un aspetto quasi mucoide, traslucido, lisce (→ queste sono le caratteristiche che

contraddistinguono i batteri dotatati di capsula).

Bacillus subtilis hanno un aspetto umbonato (tendono a rilassarsi nella porzione centrale e ad essere sopraelevate ai

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margini).

Alcune delle caratteristiche possono essere così particolari da suggerire una “identificazione presuntiva”.

Corynebacterium diphtheriae è l’agente eziologico della difterite. Con la colorazione semplice del Blu di metilene mostra

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i bacilli colarti di blu, ma mostra anche la presenza di granuli all’interno del citoplasma che prendono il nome di granuli

metacromatici, perché assumono il Blu di metilene e restituiscono una colorazione rossastra. Una semplice colorazione che

non consente di distinguere i batteri Gram +/- permette però di mettere in evidenza delle caratteristiche distintive, come i

granuli metacromatici. 6

LA PARETE BATTERICA

Le pareti dei batteri GRAM POSITIVI e dei GRAM NEGATIVI hanno delle affinità tintoriali differenti.

La parete batterica, anche chiamata sacculo, si trova esternamente rispetto alla membrana citoplasmatica. Ci sono dei

batteri che ne sono privi, e sono chiamati Mollicutes micoplasmi.

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La parete ha come compito principale la protezione del batterio da insulti, che possono essere di natura fisica e/o chimica.

La parete protegge dalla lisi osmotica perché se poniamo la cellula batterica all’interno di una soluzione ipotonica, quindi con

uno squilibrio rispetto alla concentrazione che si trova all’interno del citoplasma, ed aggiungiamo del lisozima (enzima che

ha una blanda azione batterica perché è in grado di idrolizzare dei legami importanti della parete), questo inizia a digerire

la struttura della parete. Se la parete viene attaccata la cellula va in contro ad uno squilibrio osmotico talmente elevato che

la porta a morte con lisi cellulare.

Se facciamo lo stesso esperimento utilizzando una soluzione isotonica, cioè che ha la stessa concentrazione del soluto

cellulare, allora nel mezzo isotonico possiamo usare il lisozima ma in questo caso la digestione della parete non porta alla

morte, perché le cellule private della parete sono all’interno di una soluzione che ha la stessa concentrazione esterno-interno

vengono liberati quelli che vengono chiamati proteoplasti.



Si chiamano PROTOPLASTI le cellule che si ottengono dai GRAM-POSITIVI dopo digestione della mureina con lisozima.

Si chiamano SFEROPLASTI le cellule che si ottengono dai GRAM-NEGATIVI dopo idrolisi della mureina con lisozima, che lascia

la cellula rivestita dalla membrana esterna.

La parete, quindi, protegge dalla lisi osmotica quando l’ambiente extracellulare non è in equilibrio con il contenuto cellulare.

Determina la forma del batterio se priviamo il batterio della propria parete assume una forma sferica.

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Alcuni componenti chimici sono unici ed è importante perché si lega al concetto di tossicità selettiva, quindi numerosi agenti

antibatterici (come il lisozima) sono rivolti contro la biosintesi della parete perché sono caratteristiche peculiari dei batteri e

non trovano corrispondenti nella cellula eucariotica superiore danneggiano la cellula batterica, ma non sono tossiche per

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le cellule eucariotiche superiori.

Peptidoglicano suggerisce la natura chimica di questa parete che è costituita da una componente di natura glucidica e

una componente di natura proteica. La porzione del peptidoglicano è estremamente rappresentata nella parete di GRAM

+, mentre è ridotta nella parte dei batteri GRAM – che al di fuori troveranno una ulteriore membrana, la membrana esterna.

Il peptidoglicano è inserito all’interno di uno spazio che, non è semplicemente un cuscinetto di aria o di acqua, si chiama

spazio periplasmatico è un’ambiente tutto fuorché inerte (ci sono molte strutture coinvolte nel trasporto di soluti all’interno

e all’esterno della cellula, nella sintesi della parete).

Il SACCULO conferisce rigidità e forma, protegge l’integrità cellulare contrastando la pressione osmotica interna. È costituita

prevalentemente da PEPTIDOGLICANO o MUREINA.

L’involucro dei batteri Gram + è costituito da uno spesso strato di peptidoglicano (90%), mentre quella dei Gram- presenta

una struttura pluristratificata e più complessa, che comprende un sottile strato di peptidoglicano 7

PEPTIDOGLICANO

È uno strato rigido presente sia nei batteri Gram-positivi che Gram-negativi

L’unità base, quindi, è costituita da catene glicaniche (→ 2 zuccheri), legati mediante un legame glucosidico, che si

ripetono e formano delle lunghissime catene. Le catene sovrapposte sono invece legate dalla componente peptidica da

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ponti amminoacidici.

I due zuccheri del peptidoglicano che si alternano destrogiro e levogiro sono:

N-acetilglucosamina (NAG)

Acido N-acetilmuramico (NAM) è presente solo nella parete batterica

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Questi due zuccheri sono tenuti insieme da un legame  1,4 glicosidico (che è il legame che viene scisso dal lisozima).

Attaccata all’acido N-acetilmuramico c’è una catena di 4 amminoacidi (legame carbo-aminico), in realtà gli amminoacidi sono

5 ma nella composizione finale saranno solo 4.

L-alanina

o Acido D-glutammico

o L-lisina (o acido diaminopimelico nei GRAM -)

o D-alanina è un dimero (necessita una conversione dalla L-alanina da parte di un enzima RACEMASI) ed u