Microbiologia per scienze biologiche

Microbiologia

Introduzione

Giovedì 5 marzo 2020 20.31

Esame: prova scritta + orale. Scritto con 6 domande e 2 ore e mezza di tempo. 2 domande con risposta più esaustiva (una facciata di foglio protocollo) per un totale di 20 punti. 4 domande più brevi per un totale di 12 punti. Sempre domanda su metabolismo microbico. L'orale è breve e le prime domande sono relative agli errori dello scritto. 1 settimana\10 giorni tra prova scritta e orale.

Microbiologia = scienza che tratta aspetti di uno specifico gruppo di organismi, i microorganismi. Essi sono definiti come grandi tra qualche decimo di micrometro a qualche micrometro. La microbiologia nasce attorno al 700 con l'avvento del microscopio. I microorganismi non sono visibili ad occhio nudo in forma unicellulare, ma possono aggregarsi. Per studiare in maniera specifica le caratteristiche fisiologiche di alcuni microorganismi si isolano quelli interessati (in piastre Petri per esempio).

• Batteri: Organismi unicellulari aventi forme diverse e habitat diversi.
• Archea: Unicellulari procarioti simili agli eucarioti e con caratteristiche peculiari, tra cui i loro habitat.
• Funghi e alghe: Microorganismi eucarioti.
• Protozoi

Tre domini

Bacteria, Archea ed Eukaria. Maggioranza di biodiversità: Bacteria ed Archea. Questo per via del tempo che hanno avuto di svilupparsi e modificarsi (sono considerati i più antichi). Alcuni organismi non sono mai stati coltivati ma sono state sequenziate sequenze geniche significative (pallini rossi). Variabilità evolutiva deriva dalla loro capacità riproduttiva.

Microbiologia

Se a t=0 abbiamo un microorganismo e un organismo più grande, dopo un’ora il microorganismo si è già riprodotto una volta, in un giorno si è già arrivati alla 48esima generazione. Ciò non accade negli organismi di maggiori dimensioni. Questo ha anche applicazione in ambito di adattamento, che è favorito a diverse condizioni.

I batteri non riproducendosi sessualmente non hanno variabilità genetica, tuttavia ci sono meccanismi di ricombinazione genica svincolati dalla riproduzione. Questo ha permesso loro di colonizzare ambienti diversi, anche i più estremi. La loro capacità di adattamento è anche dovuta al loro metabolismo e alla velocità con cui si riproducono. La microbiologia è una scienza di base che offre la possibilità di studiare organismi modello per comprendere processi universali del mondo biologico (come E. coli), è sfaccettata in diverse discipline (ambientale, genica, medica, ...), ma può essere anche una scienza applicata, ad esempio per sfruttare processi metabolici sviluppati dai microrganismi nel corso degli anni.

• Fissazione ammonio = processo microbico.
• Nitrificazione e in generale tutti i processi ossidativi del ciclo dell'azoto sono processi microbici.
• Annamox = ossidazione anaerobica dell'ammonio che produce azoto atmosferico.
• Relazione tra comunità microbica e obesità. Possibilità di migliorare e alterare il microbiota.
• Utilizzo di microorganismi per depurare le acque (processi di depurazione dell'ammonio e denitrificazione).
• Utilizzo dei microorganismi come agenti di decontaminazione.

Storia della microbiologia

Sabato 7 marzo 2020 14.56

La microbiologia è una disciplina giovane: è solo dalla seconda metà dell'800 che abbiamo la possibilità di studiare microorganismi in laboratorio, ovvero vederli, farli crescere in colture. Questo perché la loro dimensione micrometrica non ne permette la visione a occhio nudo in forma non aggregata. Lo sviluppo di tale disciplina si è basato di rivoluzioni tecnologiche.

1. Nell'arco del 1600 sono stati sviluppati i primi microscopi. Nel 1665 Robert Hooke brevetta un microscopio a lente singola con il quale egli era riuscito ad osservare i corpi fruttiferi dei funghi.
2. Inizio della disciplina attribuito a un commerciante di stoffe olandese Antonj van Leeuwenhoek = primo a descrivere batteri, lieviti e protozoi nella loro forma unicellulare. Egli costruisce microscopi a ingrandimenti da 50 a 300 volte le dimensioni visibili ad occhio nudo. Questo perché era necessario per lui visualizzare nel dettaglio le stoffe e i tessuti che commerciava. Nel 1676 descrive animali acquatici, che si scoprì essere poi lieviti e batteri. Lui li chiama "animalcules". Dopo queste scoperte la microbiologia si arresta per un centinaio di anni.

Primo microscopio = una sola singola lente all'interno di una piastra metallica. Il campione viene posizionato sulla punta dell'ago che si trovava sotto alla lente. Il movimento dell'ago poteva avvenire sia in verticale che orizzontale. C'era poi una vite dietro all'ago per mettere a fuoco.

3. 1800: prima rivoluzione tecnologica. Personalità importanti che riprendono l'attività di visualizzazione di microorganismi e visualizzazioni delle loro attività:

• Ferdinand Cohn: studia le prime alghe unicellulari e il batterio Beggiatoa.
• Paul Ehrlich: sviluppa la colorazione "vitale" con il blu dimetilene.
• Hans Christian Gram = denominazione ai microorganismi a seconda del modo in cui si colorano (gram positivi e negativi) con una colorazione differenziale da lui messa a punto = colorazione di gram. Oggi si parla di monodermi (gram-) e didermi (gram+).

Teoria della generazione spontanea

Dal 1600 al 1800.

Da sostanza organica, in particolare il cibo, in putrefazione si potevano evolvere determinati organismi:

• Dal cibo in putrefazione = larve di insetti.
• Dalle acque stagnanti = insetti o girini.
• Dalle derrate alimentari = topolini.

Si pensava che la vita di questi piccoli organismi fosse spontanea, ovvero si generasse dalla trasformazione della sostanza inanimata in sostanza viva. Dura fino alla fine del diciannovesimo secolo. Dalla sua confutazione nasce la teoria cellulare e della biogenesi.

Prima confutazione: Francesco Redi (1668)

Esperimento A = controllo positivo. Se lasciamo un pezzo di carne esposto per qualche giorno osserviamo la comparsa di larve di insetto e mosche. Se lo stesso contenitore viene sigillato, almeno per un certo periodo di tempo superiore non c'è presenza di questi organismi di grandi dimensioni (è stato protetto il pezzo di carne da qualcosa di esterno, il che è già una prima confutazione, in quanto tali organismi vengono portati dall'esterno anziché svilupparsi dal pezzo di carne).

Il pezzo di carne viene poi ulteriormente coperto da una garza, che permette il passaggio di aria ma non di particelle più grossolane (mosche e altri corpuscoli). Si deduce quindi che tali organismi provengono dall'esterno. Se si prende un pezzo di garza utilizzato nell'esperimento c, lo si mette in un contenitore sigillato con della carne, si vede la formazione di larve. Ciò che era stato depositato dalle mosche nella garza era ciò che seminava vita dalla bistecca.

Quando si ha una generazione di mosche e di larve esse non si generano dall'interno della carne o dall'aria, ma deriva da organismi esterni che generano semi vitali che poi si sviluppano anche una volta che la carne viene di nuovo chiusa in maniera ermetica.

Tuttavia evidenze quotidiane dicono che la presenza di soluzioni liquide andavano incontro a un certo intorpidimento per via della presenza al loro interno di microorganismi, il che fa mantenere la teoria della generazione spontanea.

Spallanzani e Pasteur

Nell'esperimento di Spallanzani un brodo in assenza di trattamento termico sviluppa una torbidità, e questo avviene sia in un contenitore aperto all'aria sia in un contenitore successivamente chiuso. Questo sembra ancora avvalorare la teoria della generazione spontanea.

Pasteur un secolo dopo porta ad ebollizione il brodo e lo suddivide in due ampolle: una aperta e una sigillata. Osserva che l'intorbidimento avviene solo in quello aperto. I sostenitori della teoria della generazione spontanea sostengono che ciò avviene perché nella soluzione è presente una "forza vitale" che dà origine agli organismi. Essa se riscaldata viene uccisa, e in un contenitore vuoto non può più essere attaccata dall'aria né da organismi esterni. Anche questa obiezione viene confutata.

Louis Pasteur

(Medico e microbiologo francese) usa una fiasca con del brodo non sterile (lo stesso di Spallanzani). La sua fiasca viene però modificata: si forma un collo di cigno con curvatura verso il basso che permette l'ingresso di aria ma allo stesso tempo blocca il materiale pulviscolare sul suo gomito, non facendolo entrare in contatto con il liquido. Pasteur sterilizza questo liquido, il vapore viene espulso e all'interno della fiasca il materiale è sterile (no microorganismi). Se si lascia questa fiasca anche per molto tempo, nonostante l'aria sia in costante contatto con il liquido, non c'è torbidità. Se invece la stessa fiasca dopo un certo periodo di tempo viene inclinata entrando in contatto con il materiale pulviscolare dell'ansa, una volta riportato il liquido nella fiasca, in poco tempo la sostanza va in putrefazione.

Obiezione confutata dal fatto che se la forza vitale fosse presente nell'aria e dunque permeava il liquido, la bottiglia era effettivamente in contatto con l'aria quindi avrebbe portato allo sviluppo microbico. Il fatto che esso si verifichi solo per contatto viene interpretato con la presenza di microorganismi nelle particelle solide che depositandosi nel collo non sono entrate in contatto con il liquido.

Teoria della biogenesi

= ogni organismo vivente è generato da un organismo vivente (ogni cellula è generata da un'altra cellula) si sviluppano contemporaneamente alle teorie evolutive di Lamarck e Darwin (1800) che permisero di affrontare le contraddizioni di questa teoria "omnis cellula e cellula, omne vivum e vivo".

Nel 1800 un gruppo di scienziati guidato da Robert Koch (tra cui vi erano Walter Hesse e Julius Petri) compie la "seconda rivoluzione metodologica". Sviluppano metodi per coltivare microorganismi su un terreno solido, che permette il loro isolamento in cultura pura.

Capsula Petri = permette attraverso lo sviluppo di agenti di solidificazione (prima gelatina o fette di patata ideati da Koch, oggi grazie a Hesse Agar, estratto di un'alga non gelatinoso) di coltivare organismi su un terreno solido. Ad alta temperatura devono essere liquidi, poi solidificano per permettere l'insediamento di microorganismi in un ambiente sterilizzato. Colonia microbica = gruppo clonale di cellule che si sono sviluppate a partire da un unico gene che per duplicazione ha dato origine a un gruppo di cellule visibile ad occhio nudo. Le colonie possono essere diverse, e organismi che hanno morfologie di colonia diverse sono microorganismi diversi. Vedendo una colonia singola separata da un'altra colonia possiamo definirla una cultura pura, cioè distinta. Le comunità microbiche sono complesse, non si riesce ad attribuire a specifici organismi ciò che vediamo in una comunità complessa. Il riuscire a separare colonie pure ha permesso di identificarne delle caratteristiche. Hesse introduce l'Agar = agente solidificante che deriva da alcune alghe che ha una temperatura di solidificazione compatibile con la produzione di terreni solidi lasciati a temperatura ambiente, tuttavia quando si alza la temperatura questo agente può essere aggiunto nel terreno e non comporta la solidificazione dell'ambiente.

Le malattie infettive

L'isolamento in coltura è servito in studi di patogenicità = proprietà di alcuni microorganismi di generare malattie in uomo e animali. Era già stato postulato nel 1500 che la trasmissione potesse essere a distanza, dunque senza contatto necessario. Doveva esserci un mezzo di trasmissione che mettesse in contatto infettivo due organismi.

1546 = Girolamo Fracastoro di Verona pubblica "De contagionem". Epidemia del colera che si sviluppa a Londra nel 1800 di origine batterica (oggi si sa essere Vibrioni): aveva provocato qualche centinaio di morti. Non si riusciva ad attribuirne una causa. Per la prima volta si applica un approccio epidemiologico: si colloca sulla mappa di Londra i casi infettati da colera. Si intuisce così che stavano tutti attorno ad una fontana. Non è mai stato dimostrato se effettivamente fosse vero, ma era stata individuata come mezzo di infezione. La fontana è stata chiusa e l'epidemia si è riassorbita (non è chiaro se fosse già in fase di conclusione). Casimir J. Davaine dimostrò che le malattie infettive potevano infettare anche gli animali. Joseph Lister inizia a sviluppare una tecnica di sterilizzazione dato e conosciuto il fatto che organismi patogeni potessero abitare e colonizzare gli strumenti chirurgici. Trovare dei trattamenti per ridurre la contaminazione microbica ha ridotto le morti per infezioni ospedaliere e post-operatorie.

Robert Koch e Lous Pasteur: elaborano la teoria microbica delle malattie. Koch isola per la prima volta Bacillus anthracis = agente eziologico dell'antracia, malattia degli animali che può colpire l'uomo. Per la prima volta si isola un organismo associato a una malattia: Mycobacterium tuberculosis e Vibrio cholerae. Lascia criteri generali per capire se un agente è causa di malattia = postulati di Koch. Nel 1905 vince il premio Nobel per la medicina. Devono essere verificati tutti e 4 secondo la sua teoria:

• Il sospetto patogeno deve ritrovarsi in tutti i casi di malattia ed essere assente nei casi sani. Si individua con microscopia e colorazione.
• Il sospetto patogeno una volta individuato va isolato e fatto crescere in coltura pura.
• Tutti organismi iniettati in individui sani dovevano portare alla malattia. Si fanno esperimenti di iniezione in cavie.
• Dall'animale artificialmente infettato deve essere possibile isolare nuovamente l'agente patogeno.

Oggi si sa che alcuni organismi patogeni possono trovarsi anche in soggetti sani, che non tutti gli organismi sono coltivabili, c'è poi una variabilità della risposta immunitaria per cui non sempre l'esposizione all'agente patogeno porta alla formazione della malattia. Ora i postulati tendono ad essere trasferiti all'ambito molecolare. Sono stati riconvertiti per cercare di definire quale gene determini la patogenicità o virulenza degli organismi. Non si parla di batteri, ma determinanti genetici che definiscono la patogenicità di un organismo. Ci possono essere organismi molto simili attribuibili allo stesso genere o specie, ma alcuni individui possono essere patogeni, altri no.

• Il gene per essere generatore di patogenicità deve essere presente in tutto il ceppo patogeno e assente in quello innocuo. Esempio Shigella ed Escherichia coli (il primo è virulento, l'altro no).
• Se viene inattivato il gene che si sospetta essere codificante, la patogenicità diminuisce, non per forza si annulla, in quanto i meccanismi di patogenicità possono essere differenti.
• A sua volta se revertiamo la mutazione che abbiamo prodotto, si dovrebbe ripristinare il livello della patogenicità. Lo stesso avviene se si inserisce un gene patogeno in un ceppo sano.

Luis Pasteur

Confuta la teoria della generazione spontanea. Attività anche nello sviluppo dei vaccini: primo vaccino somministrato contro la rabbia nel 1885 ad un uomo. Il successo che ebbe questa attività porta alla nascita dell'istituto Pasteur a Parigi. Scoperta dei primi antibiotici (chemioterapia vs malattie infettive batteriche): Alexander Fleming e Gerhard Domagk (lavorava alla Bayer). Scoprono rispettivamente la penicillina (sostanza prodotta da un fungo del genere Penicillium) e sulfamidici. Da tali scoperte nel corso del 20esimo secolo e 21esimo si scoprono altre venti classi di antibiotici. La ricerca è continua per via della resistenza agli antibiotici. Grazie a questo le malattie batteriche non sono più la principale causa di morte.

Scoperta della diversità microbica

Nel 1800 inizia a svilupparsi la microbiologia ambientale = studio dei metabolismi con Martinus Beijerinck e Sergej Vinogradskij. Il primo sviluppa la tecnica della coltura di arricchimento = creazione di condizioni artificiali che permettono la crescita selettiva di alcuni organismi rispetto ad altri. Per esempio per favorire la crescita di organismi azoto fissatori si crea un terreno in assenza di fonti di azoto. Manipolando l'ambiente si modificano le condizioni ambientali favorendo lo sviluppo di organismi rispetto ad altri e dunque fare selezione.

Vinogradskij = introduce il concetto di chemiolitotrofia e conia il termine autotrofia. Chemiolitotrofia = capacità di utilizzare sostanze inorganiche come fonte di nutrimento.

Colonna di Vinogradskij è di fatto una colonia di arricchimento che permette la stratificazione di organismi con capacità microbiche differenti all'interno di una colonna d'acqua. Questo permette la coltura soprattutto in lagune o paludi a basse concentrazioni di ossigeno. Parte più bassa = microorganismi che data la presenza nel sedimento di sostanza organica e assenza di ossigeno possono produrre idrogeno. Questo risale la colonna dell'acqua e siccome non c'è ossigeno ma solfati in questa zona si trovano molti batteri solfato riduttori che riducono i solfati a solfuri. Fonti solubili di solfuro possono risalire la colonna di acqua e trovarsi in acqua in due condizioni: una anossica (nella parte più bassa) e una ossica (nella parte più alta) con condizione intermedia a bassa concentrazione di ossigeno.