Microbiologia

MICROBIOLOGIA

Testi consigliati:

• “Microbiologia Generale” E. Galli, G. Dehò (CEA) (2012)

• “Biologia dei Microrganismi”, volumi 1 e 2, Brock, Madigan, Martinko, Parker (CEA) (2007)

Argomenti:

1) Introduzione:

➢ Sviluppo storico della microbiologia e delle tecniche microbiologiche;

2) Organizzazione strutturale e funzionale dei microrganismi procarioti:

➢ Confronto tra cellule di Eucarioti, Eubatteri, Archeobatteri.

➢ I diversi tipi morfologici di microrganismi.

➢ La cellula procariotica: la parete cellulare in Eubatteri Gram-positivi e Gram-negativi, inibitori della

biosintesi della parete; capsula, pili e flagelli; membrana citoplasmatica, citoplasma, ribosomi e

inibitori della sintesi proteica; il nucleoide, struttura ed organizzazione del cromosoma, inibitori della

replicazione. La trascrizione e la traduzione nei batteri.

➢ La spora batterica.

3) Crescita e controllo della crescita microbica:

➢ Crescita batterica: concetti fondamentali, metodi di misura, curva di crescita e velocità di crescita;

influenza degli agenti fisico-chimici (pH, temperatura, ossigeno). I terreni di coltura. Metodi di

sterilizzazione.

4) Metabolismo:

➢ Gruppi nutrizionali: autotrofi ed eterotrofi.

➢ Metabolismo energetico. Anabolismo e Catabolismo. Approvvigionamento energetico e di materia.

Produzione di energia e potere riducente.

➢ Fermentazione. Respirazione aerobica dei substrati organici (vie metaboliche convergenti nel ciclo

degli acidi tricarbossilici). Le catene di trasporto degli elettroni. Respirazione aerobica di composti

inorganici. Respirazione anaerobica.

➢ La fotosintesi nei procarioti: analisi comparativa dei batteri fotosintetici anossigenici e dei cianobatteri

ossigenici

➢ Assimilazione di N e S. Fissazione dell'azoto.

microrganismi e alla regolazione dell’espressione genica:

5.1) Introduzione alla genetica dei

➢ Mutazione. Selezione e vaglio di mutanti.

➢ Meccanismi di trasferimento dell‘informazione genetica nei batteri. Trasformazione. Plasmidi.

Proprietà generali. Coniugazione. I batteriofagi. Ciclo litico. Ciclo lisogenico. Controllo della

lisogenia. Trasduzione generalizzata e specializzata.

➢ Regolazione positiva e negativa dell’inizio della trascrizione nei procarioti.

La regolazione dell’espressione

5.2) genica nei batteri:

➢ Strategie e livelli di regolazione. Reti regolative. Repressione da catabolita. Risposta stringente.

Allarmoni. La risposta a shock termico. I sistemi di regolazione a due componenti.

6) Classificazione e filogenesi dei procarioti:

➢ Definizione di specie. Problemi relativi alla definizione di specie nei procarioti.

➢ Tassonomia e filogenesi dei procarioti risultante dall’utilizzazione di metodi molecolari.

7) Caratteristiche metaboliche fisiologiche ed ecologiche dei principali gruppi di procarioti:

➢ Gram negativi eterotrofi: Enterobatteri (fermentazione acido mista e butandiolo), Pseudomonas

(degradazione di idrocarburi aromatici e alifatici). Batteri prostecati. I batteri metofili. Gram positivi:

Bacilli, Clostridi (fermentazione di aminoacidi), Batteri lattici (fermentazione omolattica e

eterolattica) Streptomiceti

➢ Phylum Clamidie, Spirochete, Deinococci.

➢ Gli Archaea: alofili estremi, ipertermofili e metanogeni. La metanogenesi.

8) Interazione dei procarioti con altri organismi:

- La simbiosi Rhizobium-Leguminose. Cenni ad Agrobacterium. I microrganismi patogeni. Difese

specifiche e aspecifiche dell’ospite. Le tossine batteriche. Meccanismi molecolari di patogenicità.

9) Gli antibiotici:

- Definizione. Struttura e meccanismo di azione. Determinazione della Minima Concentrazione

Inibente. Basi genetiche della antibiotico-resistenza.

Sviluppo storico della microbiologia e delle tecniche microbiologiche

La cellula è l’unità fondamentale, strutturale e funzionale in cui è organizzata la materia vivente. Cellula

animale e cellula vegetale hanno dimensioni diverse. Le cellule vegetali hanno inoltre una struttura di

rivestimento che è la parete cellulare.

La parete cellulare è presente anche nei procarioti ma la sua composizione è molto diversa da quella vegetale.

Le differenze tra cellula eucariotica e procariotica riguardano in primo luogo il nucleo, ben strutturato e

delimitato dalla cisterna perinucleare negli eucarioti, assente nei procarioti che hanno invece il materiale

genetico localizzato in una particolare regione della cellula che prende il nome di nucleoide. Altre differenze

riguardano la divisione cellulare poiché nei procarioti non si ha la meiosi, la presenza di una parete cellulare

l’assenza di tutta una serie di organelli presenti negli

diversa da quella eucariotica e eucarioti. Sono invece

presenti apparati per i processi di replicazione, trascrizione e traduzione. La membrana infine è sede nei

procarioti di molti processi.

I procarioti sono caratterizzati da un particolare tipo di cellula ma non costituiscono un gruppo

filogeneticamente omogeneo. Distinguiamo infatti tra due grandi gruppi: Archeobatteri ed Eubatteri.

LUCA corrisponde all’organismo da cui poi per evoluzione sono derivati gli attuali organismi. La vita sulla

una ha portato ai procarioti e l’altra agli eucarioti. Tutti i procarioti

Terra si è evoluta su due grandi linee di cui

sono unicellulari e hanno la stessa struttura cellulare ma il fatto che non siano filogeneticamente omogenei

implica che tra archea ed Eubatteri ci siano delle differenze.

Gli Eubatteri costituiscono un gruppo più numeroso rispetto a quello degli archea e annoverano tra di essi i

patogeni; ad oggi non si conoscono archea patogeni. Inoltre poche specie eubatteriche vivono in ambienti

estremi dove invece troviamo gli archea. Tipico habitat degli archea è rappresentato dalle bocche vulcaniche

dove i valori di pH sono molto bassi e la T è molto elevata.

Nessuna specie appartenente agli eubatteri produce metano cosa che invece fanno gli archea. I bacteria

includono invece tutte le specie che fanno fotosintesi; esiste un tipo di archea che ottiene energia dalla luce

tuttavia non usando pigmenti comunque non rientra tra gli organismi fotosintetici.

Altre differenza con gli archea riguardano importanti dettagli molecolari come la composizione di membrana

e parete. –

Le cellule procariotiche mediamente hanno lunghezza compresa tra 1 5 µm e larghezza di circa 1 µm. Alcuni

microrganismi raggiungono dimensioni intorno ai 10 µm; esistono inoltre casi eccezionali con cellule enormi

–

di 100 1000 µm.

La “microbiologia consapevole” nasce con l’invenzione del microscopio ottico. Il primo a studiare i

microrganismi fu un mercante di stoffe appassionato di scienze di nome Antony van Leeuwenhoek. Egli

utilizzò il microscopio per osservare le sue stoffe ma si rese ben presto conto che con esso poteva osservare

molto altro.

Redi, Spallanzani e Pasteur diedero un importante contributo alla microbiologia. Per un paio di secoli si pensò

infatti che i microrganismi potessero avere origine dalla materia organica. Si parla al riguardo di teoria della

generazione spontanea la quale viene sfatata proprio grazie al contributo di questi tre scienziati. Questa teoria

nasceva a partire da osservazioni empiriche: essi videro che lasciando del materiale organico esposto all’aria

per un certo periodo di tempo questo andava in contro a putrefazione e su di esso era possibile osservare la

comparsa di larve e vermi. Redi dimostrò allora che solo nel momento in cui le mosche depositano le uova

possono svilupparsi le larve: coprendo il materiale con una garza non si aveva infatti la comparsa di larve.

Pasteur invece smantellò definitivamente la teoria della generazione spontanea con il suo famoso esperimento

delle fiasche a collo di cigno. Nel suo esperimento Pasteur prende dei liquidi contenenti microrganismi e li

versa in una fiasca. Poi, utilizzando il calore, fa assumere una particolare forma a collo di cigno alla fiasca. A

questo punto sterilizza il tutto.

La particolare conformazione del collo della fiasca fa sì che l’aria entri ma gli organismi in essa contenuti

facciano fatica a risalire il collo stesso. Al termine dell’esperimento infatti non si osservavano microrganismi

nel liquido.

Pasteur a questo punto va ad inclinare la fiasca facendo sì che il liquido entri in contatto coi microrganismi e

si contamini. Tale contaminazione è visibile anche ad occhio nudo poiché il liquido da limpido diventa torbido.

Con questo esperimento Pasteur demolisce definitivamente la teoria della generazione spontanea.

Pasteur dimostrò anche che le fermentazioni sono operate dai microrganismi. Per moltissimi anni si pensò che

la fermentazione delle bevande alcoliche fosse una semplice reazione chimica dovuta al processo di

riscaldamento comune a molte preparazioni. Pasteur dimostrò invece che la fermentazione, ovvero il processo

che converte gli zuccheri in alcol, era operata da diversi ceppi di lievito. Egli arrivò alla sua scoperta

esaminando il vino di una azienda vinicola francese che lo aveva convocato perché il vino veniva sempre

acido. Lo scienziato capì che la causa di ciò era che la fermentazione non veniva fatta da lieviti ma da altri

microrganismi che avevano contaminato il liquido e trasformavano lo zucchero in acido lattico, motivo per cui

il vino era appunto acido.

Pasteur, così come Koch, si occupò anche di microrganismi patogeni: egli mette per la prima volta in relazione

e scopre che microrganismi “attenuati” possono essere usati per vaccinare.

malattie e microrganismi –

Koch, premio Nobel per la medicina nel 1905, razionalizza (cioè dimostra) la relazione causa effetto tra

è l’agente eziologico del carbonchio.

malattia ed agente responsabile. Egli dimostrò che il Bacillus anthracis

Questo batterio è sporigeno. Le spore sono estremamente resistenti a calore, raggi UV, detergenti o acqua

ossigenata e le loro dimensioni sono ancora più ridotte di quelle del batterio. Esse possono pertanto essere

inalate e, quando questo accade, germinare all’interno dell’organismo.

Koch formula i postulati di Koch e definisce il concetto di coltura pura cioè originata da un solo tipo di batterio.

In particolare fa questo mettendo a punto sistemi per coltivarli su terreni solidi. Inizia utilizzando delle fette di

patata poiché queste contengono amido che rappresenta la fonte di nutrimento. Successivamente si specializza

introducendo l’uso dell’agar.

Postulati di Koch (1881):

• L’agente causale deve essere presente in tutti i casi della malattia di cui è ritenuto il responsabile

e deve essere assente negli individui sani.

• L’agente causale deve essere isolato dall’individuo affetto e, posto in coltura, deve dare origine a

una popolazione cellulare omogenea.

• L’inoculo di una coltura pura dell’agente causale in individui sani deve dar luogo alla comparsa

della malattia di cui è ritenuto responsabile.

• L’agente causale può essere re – isolato dall’organismo infettato sperimentalmente.

I microrganismi sono anche importanti attori nei cicli biogeochimici che servono a riciclare i vari elementi.

Beijerinck e Winogradsky iniziano lo studio dei microrganismi nell’ambiente che non causano malattie.

Beijerinck sviluppa i terreni di arricchimento. Fino a Koch i microrganismi erano generalmente coltivati in

terreni complessi e ricchi; questi terreni consentivano la crescita di qualunque microrganismo. Al contrario i

terreni di arricchimento permettono di selezionare alcuni tipi specifici di microrganismi. Esistono ad es. dei

batteri che contengono un’elevata concentrazione salina; in tal caso il terreno di arricchimento deve contenere

molti sali, al fine di favorire la crescita di questi microrganismi e sfavorire quella degli altri.

e chemiolitotrofi. Quest’ultimi usano composti inorganici come

Winogradsky isola per primo batteri autotrofi

fonte di energia.

I microrganismi sono stati studiati per capire in che modo essi siano riusciti a colonizzare tutti gli ambienti

della Terra ma anche per scoprire la natura di DNA, RNA e proteine nonché i processi di trasferimento genico

orizzontale. Beadle e Tatum sviluppano la teoria un gene - un enzima proprio studiando un microrganismo

rappresentato in questo caso da un fungo. E. coli invece ci ha permesso di scoprire la natura del materiale

genetico e la sua conservazione. Inoltre da esso ricaviamo enzimi di restrizione ovvero endonucleasi che E.

coli usa per difendersi: nel momento in cui viene introdotto al suo interno materiale genetico indesiderato E.

coli lo taglia rendendolo così inefficace.

Tappe importanti per la storia della microbiologia sono:

- Scoperta degli antibiotici: Fleming identifica una sostanza prodotta da un fungo, la penicillina, che ha

come bersaglio la biosintesi della parete cellulare. Tale sostanza rappresenta dunque il primo

antibiotico scoperto.

- Esperimento di Luria e Delbruck: ci dice che anche nei batteri le mutazioni sono casuali e vengono

selezionate dalla natura.

Nel 1944 Avery, MacLeod e McCarty danno vita al primo batterio “trasformato” con DNA puro:

- nasce

la biologia molecolare.

Negli anni ’70 inizia l’uso degli enzimi di restrizione: nasce l’ingegneria genetica che costruisce

- sinteticamente molecole di DNA poi usate per trasformare altre cellule.

Alla fine degli anni ’80 viene sequenziato il DNA la

- cui prima sequenza prodotta è stata quella di un

batteriofago. Verso la metà degli anni ’80 nasce la possibilità di amplificare qualsiasi sequenza di

DNA mediante PCR e siamo a metà degli anni ’90 quando viene sequenziato il genoma di un altro

da parte dell’istituto TIGR. Ad oggi abbiamo il genoma di più di 1000 procarioti

organismo

sequenziato e di alcuni eucarioti quali uomo, lievito, C. elegans e Drosophila.

–

La maggior parte dei batteri hanno dimensioni comprese tra 1 2 µm. Tali organismi sono sempre unicellulari

ma possono presentare forme diverse.

Buona parte dei batteri hanno una forma tondeggiante e sono detti cocchi. Altri hanno forma allungata e sono

detti bastoncelli.

Altre forme sono quelle di spirilli, spirochete, prostecati e filamentosi in cui le cellule si dividono ma non si

separano totalmente.

I batteri possono vivere isolati oppure formare degli aggregati multicellulari come le colonie; è il caso dei

batteri che crescono su un terreno solido. Da una cellula se ne formano tante altre che danno origine a questi

aggregati visibili a occhio nudo.

Altri tipi di aggregati sono i miceli e i biofilm. Lo studio dei biofilm è iniziato da qualche anno e riveste

un’importanza dal punto di vista medico in quanto molti batteri patogeni formano dei biofilm nei nostri tessuti.

Questi biofilm hanno una certa impermeabilità che rende inefficaci gli antibiotici. Inoltre le cellule batteriche

all’interno del biofilm comunicano tra loro scambiandosi informazioni.

Alcuni batteri si aggregano invece a formare corte catenelle: è il caso di sarcine e streptococchi.

Vediamo ora una carrellata di batteri noti e importanti:

- Brucella abortus, così chiamata proprio perché causa aborto, è un patogeno degli animali bovini e

ovini ed è un coccobacillo. Viene definita coccobacillo perché la maggior parte delle cellule ha forma

sferica, qualcuna invece di bastoncello.

- Anabaena è invece un batterio filamentoso appartenente al gruppo dei cianobatteri. I cianobatteri

svolgono la fotosintesi ossigenica e sono dotati di cellule specializzate per la fissazione dell’azoto

dette eterocisti, riconoscibili perché più grandi delle altre cellule della colonia.

- Enterococcus faecium è un patogeno opportunista che può provocare malattie in individui non

completamente sani.

- Staphylococcus aureus è un patogeno che quando viene seminato in piastra dà origine a colonie che

presentano colorazione gialla. Causa malattie della pelle ma anche endocardite.

- Streptococcus pyogenes è responsabile di infezioni della pelle e faringiti soprattutto nei bambini.

- Bacillus cereus è un Gram positivo che vive nel suolo. Possiamo trovarlo come contaminante nel cibo

tuttavia non è particolarmente pericoloso. Al contrario di:

- Bacillus anthracis che è invece molto pericoloso.

- Bradyrhizobium interagisce con le leguminose entrando in simbiosi con esse. Quando ciò avviene il

procariote inizia la fissazione dell’azoto.

- Clostridium tetani produce una neurotossina ed è responsabile del tetano.

- Lactobacillus: sono batteri Gram positivi che svolgono fermentazione e sono pertanto usati

nell’industria casearia.

- Clostridium botulinum, è un Gram positivo che produce la tossina che causa il botulismo.

- Corynebacterium diphteriae, causa difterite perché produce una tossina che fino a qualche tempo fa

causava molti morti.

è un cianobatterio filamentoso che non fissa l’azoto.

- Spirulina,

- Vibrio cholerae, ha una forma a virgola ed è il batterio patogeno che produce la tossina responsabile

del colera.

Organizzazione strutturale e funzionale dei microrganismi procarioti

Le cellule di Bacteria e Archea sono caratterizzate dal fatto di condividere la stessa struttura cellulare.

Entrambe sono delimitate da una membrana cellulare e da una parete. La parete cellulare ci consente però di

distinguere i batteri in due grandi gruppi: Gram + e Gram -. Gli archea invece hanno una parete diversa sia da

quella dei Gram + che da quella dei Gram -.

Sono inoltre presenti appendici esterne quali flagelli, pili e fimbrie, di natura proteica, e la capsula che

rappresenta una struttura accessoria e quindi non essenziale. La capsula è una struttura di rivestimento in genere

di natura polisaccaridica ed è quasi sempre associata a virulenza.

Con il termine envelope viene indicato il rivestimento della cellula comprendente membrana plasmatica e

parete cellulare. All’interno della cellula osserviamo una massa biancastra che è il nucleoide e un citosol privo