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NUTRIZIONE MICROBICA
L'insieme delle sostanze richieste sono definite nutrienti. I nutrienti sono utilizzate dalle cellule per la produzione di energia (attraverso reazioni metaboliche). A seconda del tipo di fonte di energia utilizzata distinguiamo:
- fototrofi: che utilizzano la luce come fonte di energia
- chemiotrofi: che sfruttano l'energia derivata dall'ossidazione di un composto chimico. A seconda della natura del composto distinguiamo:
- chemiorganotrofi, se utilizzano la sostanza organica (ad esempio l'uomo)
- chemiolitotrofi, se utilizzano sostanza inorganica (ad esempio i batteri)
Nello specifico per gli organismi che utilizzano il carbonio come fonte di energia possiamo distinguere tra:
- eterotrofi: se utilizzano il carbonio organico:
- fotoeterotrofi: sono principalmente batteri fotosintetizzanti e allo stesso tempo sono in grado di usare il carbonio organico presente nell'ambiente.
- chemioeterotrofi: è il gruppo più ampio.
Che comprende l'uomo:
- Autotrofi: se utilizzano fonti di carbonio inorganico come l'anidride carbonica:
- Fotoautotrofi: come le piante
- Chemioautotrofi: (esclusivamente chemiolitotrofi) esclusivamente batteri
In natura, chemioautotrofi e fotoeterotrofi costituiscono delle peculiarità, e vengono riscontrati in nicchie ecologiche particolari in cui sono gli unici in grado di sopravvivere.
Le esigenze nutrizionali dei microrganismi sono definibili in funzione della loro composizione cellulare. Una cellula microbica è formata per il 80% di acqua; i restanti elementi sono elencati in figura): si osserva come il carbonio abbia un'importanza fondamentale o come l'azoto rappresenti uno degli elementi limitanti.
Gli elementi, a seconda della loro importanza, si classificano in:
- Nutrienti principali (C, N, O, H): che si trovano in quantità molto elevate all'interno della cellula e che sono alla base di molte componenti cellulari
- Macronutrienti (P, S, K, ...)
(Mg, Ca, Na): elementi che riscontriamo in concentrazioni significative, poiché rappresentano la più importante fonte energetica per l'organismo55. Il quale accumula una tossina letale solo per le larve di farfalla e non per l'uomo (impiegate nella lotta biologica)56. Questo avviene in relazione al fatto che la fissazione della CO2 è un processo molto dispendioso57.
Micronutrienti (Fe, Co, Cr, Zn, Mo, Ni): sostanze, principalmente metalli, fondamentali in piccole quantità che svolgono in genere un ruolo strutturale. Sono anche definiti elementi in tracce.
Fattori di crescita (vitamine, aminoacidi, basi azotate): composti organici necessari in piccolissime quantità, indispensabili per la crescita. Non tutti gli organismi sono in grado di produrli attraverso la biosintesi.
La carenza/mancanza di tali elementi (in genere legata alla difficoltà di assimilazione) può costituire un problema per l'organismo. Nel caso del ferro (Fe2+, Fe3+),
la forma assimilabile è il Fe , allo stesso tempo però è anche la più instabile, pertanto tende ad ossidare spontaneamente a Fe3+. Affinché sia possibile introdurre il Fe nella cellula sono necessari agenti chelanti (siderofori) i quali, agendo da vettori, legano il Fe per portarlo all'interno della cellula. Alcuni esempi di siderofori sono: 3+idrossamato: molecola complessa che legandosi al Fe lo trasforma in idrossamato ferrico, in grado di penetrare nella cellula, dove viene sottoposto a ossidoriduzione e ridotto a Fe2+. (l'idrossamato liberato viene espulso) enterobactine o siderofori fenolici: una struttura ciclica insolubile che lega il ferro, trasformandolo in ferro chelato. (tecnica utilizzata da batteri patogeni quali enterobatteri) acquachelina: composta da una coda idrofobica e da una regione alla quale il ferro si lega (strategia utilizzata da batteri di organismi acquatici che usano acquachelina) TERRENO DI COLTURAIlterreno di coltura in cui coltiviamo il nostro organismo può essere:- di arricchimento: che consente di aumentare la carica del gruppo che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che rallentano la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in esame. A volte l'arricchimento è utile quando gli organismi di nostro interesse sono minoritari o non particolarmente competitivi. Un esempio di tecnica di arricchimento è quella messa a punto da Winogradsky.
- liquido torbido
- colonie, si presentano come macchie (solido)
- tappeto di cellule, quando la densità cellulare è molto elevata (10^9) e il tutto appare coeso (solido)
Cerchietto alla fine dell'ansa permette che si crei una goccia di liquido abbastanza definita. Questo strumento è sterilizzato con la fiamma di un becco bunsen. Rimanendo vicino alla fiamma ci assicuriamo di evitare la contaminazione delle piastre petri/provette.
ISOLAMENTO DI COLTURA PURA
Una delle prime tecniche di coltura applicata in laboratorio è stata l'isolamento della coltura pura (anche detta axenica): in cui è presente una sola tipologia di organismo, che deriva da una singola cellula (omogeneità genetica). Possiamo ottenere questo tipo di coltura tramite:
- coltura monocitogenetica, che sfrutta micromanipolatori (associati ad un sistema ottico) per separare e prelevare una singola cellula
57 In quantità elevate questi metalli possono essere dannosi (metalli pesanti)
58 Come nel caso degli amminoacidi, di cui l'uomo ha 8 aa essenziali che vanno introdotti con la dieta
59 La difficoltà di assimilazione del ferro è che
non entra spontaneamente nella cellula60. L'insolubilità permette di attraversare la membrana cellulare61. Polisaccaride di origine algale (agar agar) che gelifica a 48°C e liquefa a 72°C. Questa differenza di temperatura è utile perché permette di miscelare le cellule con il terreno strisciamento (tecnica più comune), che prevede l'uso di un ansa per prelevare la sospensione mista che viene quindi strisciata● seguendo un percorso con l'obiettivo di diluire le cellule nello spazio. Ottenuta la colonia userò l'ansa per fare una seconda piastra spandimento con spatola, in cui prendo la sospensione e con la spatola, spando la sospensione su tutta la piastra. Ripeto il processo● per 3 piastre in successione inclusione o disseminazione, miscelo la sospensione all'agar ancora liquido●. Una volta ottenuta una coltura pura dobbiamo identificarla. Le info possono essere: macro/micromorfologiche: possiamo distinguerle per aspetto (rizoide,lenticolare, filamentosa...), profilo (convessa, umbonata● rasata..), margine (eroso, filamentoso, stratificato...).
metaboliche●Le tecniche molecolari stanno prendendo il sopravvento. Queste consistono nell'estrazione del DNA di un gruppo microbico che viene sottoposto62 63a PCR, fornendo un primer , alla miscela, in grado di legare specificatamente la sequenza di dna che codifica per l'RNA ribosomiale . se i primersi legano aggiungiamo i nucleotidi e parte la replicazione da quel punto che prosegue in modo complementare rispetto alla catena su cuiandiamo a creare questa sequenza. Confronto con le banche dati. sulla base delle differenze di sequenza con il nostro frammento possiamoidentificare la sequenza e ricondurre ad una specieSe abbiamo a che fare con organismi eucariotici, l'obiettivo è quello di replicare il DNA che codifica per l'rrNA 18s. se invece il target sono i batteridovremmo replicare il DNA che codifica per l'RNA 16s.
METABOLISMO
CELLULARE
Il metabolismo è l'insieme di reazioni chimiche che avvengono all'interno della cellula. Le reazioni metaboliche possono essere:
- reazioni cataboliche: a rilascio di energia (ATP)
- reazioni anaboliche: ad acquisto di energia
Per comprendere meglio il metabolismo dobbiamo prima soffermarci sulle leggi fisiche che governano queste reazioni: questo perché le reazioni chimiche sono sempre accompagnate da rilascio di energia.
Definiamo energia libera, l'energia disponibile a compiere un lavoro (G). Il cambiamento di energia durante una reazione viene espresso come, per calcolare il cambiamento di energia sottraiamo G dei reagenti al G dei prodotti (per convenzione, l'energia di formazione degli elementi nel loro stato elementare è sempre uguale a zero).
Il cambiamento di energia durante una reazione viene espresso come (dove gli apici e ' indicano le condizioni standard a cui la reazione è ΔG avvenuta)
utile per il confronto tra reazioni diverse. In natura le condizioni, però, non sono quasi mai quelle standard. Fortunatamente è possibile calcolare partendo da: ΔG ΔG
Dove R e T sono due costanti fisiche, mentre K è la costante di equilibrio per la reazione in questione.
A seconda che il valore del risultato sia:
- esoergonicanegativo, la reazione sarà (a rilascio di energia)
- positivo, la reazione sarà endoergonica (ad assorbimento di energia)
Il valore di è diverso per ogni composto (in quanto ha un energia libera di formazione diversa): l'acqua ad esempio ha un valore di -237,2 ΔGkj/mole62 gli inneschi sono sequenze con posizioni di base azotate cerche e che sono certamente in grado di trovare una sequenza complementare nelle cellule che vogliamo studiare. Se noi inseriamo nella miscela di reazione una serie di reagenti, tra cui basi azotate, inneschiamo la denaturazione del dna e la replicazione forzata di
questi geni.
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