Microbiologia Marina, C. Vignaroli

Microbiologia marina

Un microbo è una forma di vita di taglia microscopica: 0,1 μm - 1 mm. Comprendono batteri, archaea, eukarya e virus. I microrganismi marini sono la prima forma di vita che si è sviluppata sulla Terra e ne sono stati i soli abitanti per due terzi della sua esistenza. Stima procarioti presenti nel pianeta: 4,17 x 10³⁰.

Importanza dei microrganismi marini

• 90% biomassa e 90% della PP degli ecosistemi marini
• Ruolo chiave in tutti i cicli biochimici e nel funzionamento degli ecosistemi
• Ruolo chiave nella rete trofica e nel riciclo dei nutrienti (microbial loop)
• Interazioni con gli altri organismi; simbiosi, associazioni e patogenicità
• Ruolo chiave negli scambi gassosi tra oceano e atmosfera
• Oltre il 50% della produzione di Ossigeno sulla Terra è dovuta a microrganismi fototrofici
• Fonti di nuovi composti bioattivi e vie metaboliche sfruttabili nelle biotecnologie
• Influenzati e influenzano a loro volta il cambiamento climatico

Studio dei microrganismi nella storia

Nel 1894, Bernhard Fischer utilizzò terreni di coltura per isolare batteri marini, sostituendo il brodo di carne usato da Koch con uno di pesce. Le conte risultavano molto imprecise (10³/mL), quindi ci si convinse che la popolazione batterica in mare fosse trascurabile. Nel 1941, Claude Zobell sviluppò il primo valido mezzo di coltura per la crescita di batteri marini: Zobell Marine Broth 2216, con una composizione simile all’acqua di mare, ma con un contenuto di carbonio fino a 170 volte maggiore.

Nel 1959, Jannasch & Jones effettuarono conte dirette al microscopio confrontate con tecniche di coltura con membrane filtranti. Nel 1977, Hobbie introdusse le conte con microscopio ad epifluorescenza. Nel 1981 si ottenne la prima coltura di un batterio oligotrofo obbligato, da un campione di acqua dolce. Fino ad allora la condizione di oligotrofia dell’oceano era poco chiara. Nel 2005, Kysela effettuò analisi seriale di sequenze ribosomiali. Nel 2006, Sogin introdusse il pyrotag sequencing.

In base ad alcune analisi di sequenze del DNA ribosomiale 16S, si ritiene che archaea e bacteria si siano separati precocemente, mentre archaea ed eukarya si sarebbero evoluti parallelamente più a lungo. Infatti, bacteria ed archaea hanno una struttura cellulare simile. I batteri si riscontrano in tutti gli habitat marini e la loro distribuzione è dettata primariamente dai nutrienti; tendono a diminuire in mare aperto e a maggiori profondità, sebbene siano ancora abbondanti oltre i 1000 m.

Distribuzione dei microrganismi marini

In acque superficiali risultano fortemente dominanti rispetto agli archaea (3x10⁴ vs 3x10³), oltre i 3500 m l’abbondanza dei due domini coincide (4x10³). Protisti e funghi unicellulari (del dominio eukarya) hanno in mare aperto concentrazioni comprese tra 10⁴ e 10⁶ cell/mL e possono essere abbondanti anche oltre i 1000 m di profondità, soprattutto in corrispondenza di acque costiere produttive; le picoalghe, durante i bloom, superano anche le 10⁵ cell/mL. La concentrazione media dei virus in mare è di 10⁷ al mL e decresce con la profondità e allontanandosi dalla costa; restano abbondanti anche a grandi profondità all’interno del sedimento.

I microrganismi sono in grado di colonizzare qualsiasi habitat sul pianeta. In mare, rappresentano un’importante componente del plancton. Approssimativamente, 1 μL di acqua marina superficiale contiene:

• 10000 virus
• 1000 batteri eterotrofici
• 100 cellule di Prochlorococcus
• 10 cellule di Synechococcus
• 10 cellule di alghe eucariotiche
• 10 cellule di protisti

Determinare abbondanza e diversità

L’enorme diversità microbica è dovuta alla plasticità del genoma, alla pressione selettiva esercitata dall’ambiente, a eventi di mutazione (modificazione e modulazione dell’espressione genica) e alla ricombinazione intracellulare. Tuttavia, un altro processo ha avuto un ruolo cruciale nella speciazione dei microrganismi: Horizontal Gene Transfer (HGT).

I meccanismi di HGT permettono il trasferimento di materiale genetico esogeno, permettendo quindi l’acquisizione da parte degli organismi di materiale genetico proveniente da altre specie. Il concetto biologico di specie non può essere applicato ai batteri, poiché si riproducono asessualmente. In microbiologia, per specie si intende un insieme di ceppi che condividono molte proprietà stabili. Un ceppo è una popolazione che deriva dalla moltiplicazione di un unico isolato in coltura pura.

Nell’ambito della stessa specie, i ceppi possono presentare lievi differenze l’uno con l’altro, che possono dipendere dalla presenza di diversi genotipi (HGT) o da diversa espressione genica:

• Biovar – diverse caratteristiche biochimiche o fisiologiche
• Serovar – diverse caratteristiche antigeniche, individuabili con reazioni sierologiche
• Morfovar – diverse caratteristiche morfologiche

La formazione di una nuova specie batterica parte con lo sviluppo di un ecotipo che sopravvive e vince la competizione con il wild type, replicandosi fino a dar vita ad una popolazione stabile. Il sistema binomiale viene applicato anche ai microrganismi, ma solo con l’applicazione di tecniche molecolari si iniziò a classificare i batteri valutandone anche le relazioni filogenetiche.

La macromolecola adatta ad uno studio di tipo evolutivo deve essere:

1. Universalmente distribuita
2. Funzionalmente omologa in ogni organismo
3. Facilmente allineabile con regioni di omologia
4. Soggetta a lente variazioni nella sequenza

Gli RNA ribosomali sono perfetti, perché hanno sequenze tipizzanti:

• Brevi
• Caratteristiche di un genere o di una specie
• Esclusive, quindi impiegabili per costruire sonde specifiche che identificano rapidamente il microrganismo

Nel 2010, grazie a studi basati sulle colture, avevamo descritto più di 10,000 specie di batteri e archaea e 200,000 specie di protisti. Tuttavia, la maggior parte dei microrganismi marini non sono ancora coltivabili: non abbiamo i terreni di coltura adatti, perché non conosciamo le esigenze nutrizionali dei vari ceppi. Il sequenziamento dell’RNA ribosomiale 16S può evidenziare una diversità fino a 100 volte maggiore e permette di costruire alberi filogenetici.

A specie nuove scoperte con metodi molecolari, ma non coltivabili, non è possibile assegnare un nome convenzionale: non possono essere descritti. Queste specie si identificano con il termine Candidatus seguito dal nome proposto per la specie, non in corsivo; sono chiamate ribotipi, e i filotipi sono gruppi di ribotipi correlati dal punto di vista filogenetico.

Anche le tecniche molecolari presentano degli svantaggi, tra cui il rischio di sovrastima del numero di specie: due organismi sono classificati come conspecifici se la sequenza dell’rRNA 16S coincide per il 97%. Gli studi molecolari, inoltre, non permettono di evidenziare le differenze morfologiche (di forma e taglia), che invece le colture possono mettere in risalto. Pertanto, è importante utilizzare le due tecniche e fare un confronto.

La crescita batterica

Il rapporto superficie/volume: maggiore è il rapporto superficie/volume di un batterio, maggiore è la sua efficienza nell’assorbimento dei nutrienti (osmotrofia); un’eccezione è rappresentata da Thiomargarita namibiensis, un solfobatterio di grandi dimensioni che mantiene una buona efficienza grazie alla presenza di un grosso vacuolo gassoso che occupa la maggior parte del volume interno.

In condizioni oligotrofiche, la crescita batterica nella prima fase è esponenziale; quando i nutrienti tendono a finire, si raggiunge una fase stazionaria, in cui i batteri riducono le proprie dimensioni ma continuano a dividersi; infine, nella fase cosiddetta esplicativa, i batteri non si dividono, ma sopravvivono abbassando il proprio tasso metabolico e mantenendo uno stato energetico molto elevato (per esempio, tenendo un’alta riserva di ATP).

Habitat microbici marini

L’habitat in cui un organismo trova le condizioni di crescita ottimali costituisce la nicchia ecologica primaria di quell’organismo. Esso può essere di dimensioni piccolissime: un microambiente. Nei microambienti le condizioni chimico-fisiche possono variare rapidamente nello spazio e nel tempo e questa eterogeneità può determinare una elevata diversità microbica.

• Neuston – interfaccia aria-acqua
• Plancton – ambiente pelagico (70% biomassa):
• Epipelagico
• Mesopelagico
• Batipelagico
• Abissopelagico
• Bentopelagico – interfaccia acqua-sedimento
• Benthos
• Epibionti – epizoon, epiphyton
• Endobionti

La composizione dell’acqua di mare è il risultato di:

• Apporti di acque continentali e di scarico
• Scambi e interazioni superficie-atmosfera
• Trasformazioni tra ioni in soluzione e minerali precipitati
• Processi biochimici

Considerata costante in tutti i mari: 96,5% di acqua e 3,5% di sali. La salinità è definita come quantità di sali (in g) in un Kg di acqua, e la salinità media degli oceani è di circa 35% ; NaCl e NaMg rappresentano da soli l’88,6% dei sali. Variazioni nella salinità sono dovuti a:

• Evaporazione
• Precipitazioni atmosferiche
• Apporto di acque continentali
• Mescolamento tra acque superficiali e profonde

Altri fattori:

1. Temperatura – cala con la profondità (termoclino) e varia con latitudine, stagioni, correnti.
2. Pressione – aumenta di 1 atm ogni 10 m di profondità, influenza le reazioni chimiche e la fisiologia cellulare.
3. Densità – funzione di T, S e pressione; variazioni di densità possono generare correnti, anch’esse fattori che influenzano la distribuzione delle comunità batteriche.
4. Saturazione di ossigeno – dipende da T, S e PO₂; le acque fredde e superficiali sono più ossigenate.
5. Disponibilità di CO₂ in colonna – 50-60 volte maggiore rispetto all’atmosfera; il sistema CO₂-carbonati ha funzione di tampone e regola il pH dell’acqua.
6. pH – 7,5-8,5 in media
7. Concentrazione dei nutrienti.
8. Presenza di particolato.
9. Grado di illuminazione.
10. Esposizione agli UV.
11. Clima.
12. Concentrazione di metalli pesanti e altri inquinanti.

3/4 della biomassa microbica si trova in mare aperto e oltre la metà è posta nei primi 100 m di profondità.

Protisti

Sono eucarioti unicellulari:

• Alghe – diatomee, coccolitoforidi, dinoflagellate
• Protozoi – radiolari, foraminiferi, ciliati

I protozoi si dividono in 4 gruppi: amebe, flagellati, ciliati e sporozoi (apicomplexa).

• Foraminiferi – amebe con gusci calcarei e pseudopodi, di mari superficiali soprattutto temperati.
• Radiolari – amebe con scheletri silicei, con pseudopodi usati per scopi alimentari e per il movimento; planctonici e bentonici, distribuzione legata soprattutto alla T e alla disponibilità di Si.
• Ciliati – forma sferica con ciglia intorno al citostoma, per la maggior parte eterotrofi che fanno fagocitosi, ma anche specie fotosintetiche. Connessione importante tra fito e zooplancton.

Funghi

Altri eucarioti marini microscopici, di acque superficiali e profonde, in ambiente costiero ed estuarino; sono decompositori della materia vegetale e possono fare simbiosi con licheni. Alcune specie sono parassite o patogeni di piante e animali.

Virus

Le entità più numerose e con più diversità della colonna d’acqua, anche se in termini di biomassa costituiscono solo il 5%; svolgono un ruolo importante di controllo sulla popolazione batterica.

I microrganismi nella rete trofica

I nutrienti nell’ambiente marino sono presenti sotto forma di materia organica particolata (POM) e materia organica disciolta (DOM); esse derivano da fonti esterne (apporti continentali o atmosferici), ma soprattutto dalle deiezioni e i resti di tutti gli organismi. Per la maggior parte degli organismi marini, queste forme non sono biodisponibili, ovvero non sono assimilabili direttamente. Per l’assimilazione occorrono:

• Una buona motilità e chemiotassi
• Sintesi di enzimi idrolitici associati alla membrana
• Traportatori di membrana

Microbial Loop – i microrganismi eterotrofi sono responsabili della reintroduzione dei nutrienti nella rete trofica, costituiscono infatti la fonte principale di materia organica per tutti gli altri organismi. La maggior parte della materia organica ed energia prodotta in mare viene consumata dai microrganismi e solo l’1-2% della PP viene trasferita ai consumatori finali della catena (pesci ittiofagi).

Viral Shunt – i virus contribuiscono alla rigenerazione di C e nutrienti disciolti in colonna d’acqua, pronti per essere assimilati nuovamente dai batteri, grazie alla loro attività di lisi batterica. Con essa operano anche una regolazione sulla popolazione microbica e favoriscono il trasferimento di materiale genetico (HGT). I batterivori fungono da anello di congiunzione tra la comunità microbica e gli altri livelli della rete trofica, un po’ come i ciliati, batterivori ma anche grazers, sono anello di congiunzione tra fito e zooplancton.

DOM: dimensioni micro e nano. Abbonda sulla superficie mucosa delle alghe soggette a epifiti, su cui forma la ficosfera; qui la concentrazione batterica è molto elevata.

POM: micro. Tende ad aggregare in particelle che sedimentano, dette neve marina; i batteri vi aderiscono e idrolizzano i composti, lasciando una scia di nutrienti (Plume) per altri organismi.

➢ I batteri adesi alla POM sostengono sé stessi o i batteri free living? Tra essi ci sono individui capaci di degradare la POM e individui privi di idrolasi; dopo circa 200h, il 97% della progenie, le cellule che non idrolizzano la POM, si stacca dalla superficie. È una strategia di conservazione dell’energia in ambiente oligotrofico, volta alla sopravvivenza della propria popolazione.

➢ Controllo bottom-up o top-down? La biomassa e abbondanza del batterioplancton è controllata dalla disponibilità di risorse o dalla pressione di grazing dei protisti? Solitamente, nella prima fase di crescita la predazione ha un impatto maggiore, mentre una volta raggiunta la fase stazionaria la disponibilità di risorse determina le dimensioni di popolazione. Inoltre, in ambiente eutrofico, dove c’è maggiore competizione per le risorse tra gli organismi, è più influente la disponibilità di nutrienti; in ambiente oligotrofico ha più potere la pressione dei batterivori.

Pelagibacter ubique – procariote appartenente al gruppo SAR11 degli α-proteobatteri, uno dei più piccoli finora scoperti. Ha il genoma più piccolo mai trovato in un organismo free-living: non ha porzioni di DNA non funzionali o ridondanti, non ha trasposoni, introni o elementi extracromosomali, presenta gli spazi intergenici più piccoli mai trovati. Ha il 60% in più di geni codificanti proteine transmembrana rispetto agli altri batteri, di cui la metà sono ATP-dipendenti.

Tra le proteine per cui codifica, c’è anche la proteorodopsina, un pigmento associato alla membrana che funziona come una pompa protonica attivata dalla luce: permette di sintetizzare ATP tramite una forma di fotosintesi senza clorofilla. Questo rappresenta un sistema ausiliario per sopravvivere in carenza di nutrienti.

Metodi di alimentazione dei batterivori

• Filter Feeding – utilizzo di apparati di locomozione (flagelli, ciglia) per creare correnti e convogliare le prede verso il citostoma; tipico di organismi sessili
• Interception Feeding – ricerca attiva della preda; tipico di protozoi liberi e mobili
• Diffusion Feeding – attesa passiva di prede mobili e secrezione di sostanze mucose per favorirne la cattura
• Mixotrofia – molto diffusa tra i protisti, oltre alla fagocitosi l’organismo può fare anche fotosintesi, anche se meno efficiente dei PP

➢ Selezione della preda:

• Nella ricerca – dimensioni, motilità, chemiotassi, sostanze tossiche
• Contatto – dimensioni, motilità
• Cattura – proprietà del rivestimento batterico
• Processamento – recettori superficiali
• Ingestione – morfologia del protista
• Digestione – temperatura, specie batteriche

Es. Gram – più facili da digerire perché hanno una parete più semplice rispetto ai Gram +.

➢ Effetti della predazione:

• Cambia la struttura morfologica della comunità batterica
• Shift della dimensione cellulare nelle popolazioni superstiti, perché viene consumata soprattutto la taglia media di comunità
• Calo della produttività, perché viene colpita la popolazione più grande e numerosa che è anche quella più produttiva
• Shift nella diversità della comunità, la cui stabilità dipende dal rapporto tra tasso di mortalità e tasso di crescita

➢ Strategie anti-grazing dei batteri:

• Riduzione delle dimensioni
• Produzione di sostanze esocellulari per inglobare più cellule: BIOFILM
• Elevata motilità
• Formazione di aggregati
• Produzione di tossine
• Modificazione della superficie (es. idrofobicità)

Il neuston

Può essere considerato un microambiente, spesso 1-10 μm (alcuni dicono 50). Sulla superficie dell’acqua il numero di microrganismi può essere fino a 100 volte superiore che in altri punti della colonna (10⁸-10⁹ cells/ml). Nel 2008 Wurl & Holmes parlarono per primi di particelle gelatinose polisaccaridiche.