Microbiologia - Appunti

Metodologie per l'identificazione dei batteri

Partendo da un campione possiamo quantificare il numero di organismi totali o gruppi specifici. Si possono poi selezionare i microrganismi di interesse, isolare i ceppi in coltura pura, identificare i ceppi isolati e verificare la presenza di determinati organismi. Soprattutto possiamo isolarli e identificarli non solo dal punto di vista tassonomico ma anche dal punto di vista fenotipico. È importante isolare alcuni ceppi patogeni, o microrganismi contaminanti. Devo quindi verificare la presenza dei microrganismi contaminanti ad esempio come si fa nelle acque potabili. È utile identificare il tipo di batterio e in alcuni casi è utile vedere la presenza o assenza di alcuni organismi (es. batteri fecali).

1) Coltivare microrganismi: Riusciamo a verificare la presenza di batteri in una coltura liquida attraverso l'intorbidimento del terreno di coltura. Quando c'è crescita microbica aumenta la torbidità.

Con tecniche spettrofotometriche riusciamo anche a vedere di quanto cresce la coltura. Possiamo vedere la crescita delle cellule batteriche anche in un terreno solido. In questo caso partiamo da preparati in polvere a cui poi aggiungiamo l'agar che lo rende solido nella piastra di petri. Con l'incremento dello sviluppo di colonie nella piastra, colonie diverse implicano una coltura eterogenea. Nella piastra una sola cellula per duplicazione va a dare una vera e propria colonia batterica. Ogni colonia indica la presenza di una singola cellula, è rappresentativa di una sola cellula batterica. Quindi si contano le unità formanti colonia. Non vuol dire che colonie simili indicino batteri uguali. Colonie diverse indicano per forza batteri diversi. Quando le colonie danno una crescita confluente si crea uno striscio in cui le singole colonie formano la patina microbica. Per far crescere il microrganismo dobbiamo usare terreni di coltura (complessi o definiti). Tramite iltipo di terreno usato, possiamo selezionare alcune forme microbiche rispetto ad altre. I terreni completi sono costituiti da idrolizzati proteici in cui non sono definite le sostanze, ma sono sostanze in grado di far crescere qualsiasi organismo. Però non permette la selezione di alcuni batteri specifici. Mentre il terreno definito è in grado di selezionare i batteri, ne conosciamo la composizione chimica. Se ad esempio i batteri interessati usano specifiche fonti di carbonio, le posso aggiungere io nella coltura per favorirli. Per coltivare Escherichia coli posso usare un terreno complesso di coltura perché non è molto esigente. Posso far crescere Escherichia coli con un terreno definito detto minimo minerale. Ad esso si aggiunge solo glucosio come fonte di nutrimento. Se devo coltivare Leuconostoc devo avere un terreno definito con amminoacidi, acetato, alcune vitamine. Quindi il terreno definito può essere visto come un terreno selettivo. Ad esempio ilterreno MRSA è selettivo e definito perché contiene sostanze che permettono la crescita di batteri come Staphylococcus aureus. Solo questo batterio può crescere su questo terreno. Per differenziare i batteri possiamo usare i terreni differenziali, che ci permettono di vedere i microrganismi che noi selezioniamo. Il differenziamento si può avere grazie alla colorazione del terreno o della singola colonia (se data da una reazione). Il terreno di MacConkey è di colore rossastro, contiene sostanze cromogeniche che cambiano colore a seconda del pH e del lattosio. I batteri che si nutrono di lattosio acidificano il mezzo. Mantiene il colore se cresce il batterio inoculato. Se cambia colore diventando giallo-verde, abbiamo un batterio che usa il lattosio ma non riesce ad acidificare il mezzo. Batteri come Escherichia fanno fermentazione acido-mista, l'indicatore di pH registra il colore rosso. Invece, con Salmonella che fanno fermentazione 2,3-butandiolica, il mezzo...di coltura liquido. In questo caso, utilizziamo un metodo chiamato conta cellulare diretta. Questo metodo coinvolge l'uso di un microscopio per contare direttamente le cellule presenti in un campione. Per fare ciò, prendiamo un campione di coltura e lo diluiamo in un mezzo di conteggio specifico. Quindi, prendiamo una piccola quantità di questa soluzione diluita e la mettiamo su un vetrino per il microscopio. Con l'aiuto del microscopio, contiamo il numero di cellule presenti in un determinato volume di soluzione. Moltiplicando questo numero per il fattore di diluizione, otteniamo il numero di cellule per mL del campione di partenza. Entrambi i metodi, la conta vitale in piastra e la conta cellulare diretta, sono ampiamente utilizzati nel campo della microbiologia per quantificare i microrganismi presenti in un campione.

acquoso. In campioni di acque si usa il metodo delle membrane filtranti. Il sistema raccoglie e concentra batteri su un supporto su cui crescono. Si usa un filtro quadrettato che è posto nell'unità filtrante. C'è un bicchiere soprastante che contiene l'acqua e una beuta sottostante che permette il risucchio dell'acqua. Il passaggio per il sistema di unità filtrante fa sì che l'acqua venga filtrata e raccolta nella beuta sotto, mentre dopo avere applicato il vuoto vengono conservati sul filtro. I batteri nei quadratini riescono a crescere e quindi posso contare le varie colonie formate sul filtro.

Un altro metodo è quello della most probable number (MPN). È molto usato nell'analisi batterica nelle acque e anche per tanti campioni. Si chiama così perché da un numero più probabile. Nel campione si fa una diluizione seriale con 3 o 5 repliche di ogni diluizione. Metto a incubare e dopo crescita

vedo se c'è omeno torbidità. Vedo fin dove ho crescita nellaprovetta. Attraverso le tabelle di McCrady posso cercare le possibilicombinazioni di diluizioni e repliche. Cerco la combinazione del mio risultato. Perogni terna vedo quante ne ho positive per il mio risultato. Se la combinazione è 3 positive nella primadiluizione, 1 nella seconda e 0 nella terza, il numero di batteri più probabili per l'acqua analizzata è 43.Questo è il valore più probabile, ma è posto in un ampio range perché il limite inferiore è 7 e quellosuperiore 210. Con tantissimi campioni da analizzare riesco a vede quali campioni sono più ricchi di batteririspetto ad altri. Posso anche vedere se i batteri possono fare delle fermentazioni, mettendo la campanelladi Douram sul fondo del terreno e se producono idrogeno essa sale. Posso vedere se sono in presenza dibatteri gasolio-degradanti, mettendo gasolio in coltura.Il metodo

alternativo è la conta del microscopio anche a fluorescenza. È utile per contare il numero di batteri oppure per analizzare il numero totale di batteri (vivi e morti). Per contare si usa un supporto, cioè la camera di Burker, oppure si possono usare fluorocromi come il sybr green (batteri vitali) o ioduro dipropidio (cellule danneggiate o morte, non replicano più). Il campione trattato con i fluorofori viene messo nella camera di Burker composta da dei sottoriquadri, quindi al microscopio posso contare il numero di batteri nel quadratino. Poi moltiplico il numero di celle per il numero di quadratini per il volume. Le cellule vitali risultano verdi per l'applicazione di sybr green, mentre quelle non vitali rosse per lo ioduro dipropidio.

2) Selezione e isolamento di microrganismi:

Gli habitat naturali dei microrganismi possono essere straordinariamente diversi e molto estremi. Il microambiente è il luogo in cui un microrganismo vive. I microambienti sono

eterogenei e le condizioni possono variare rapidamente. L'analisi e l'isolamento di diversi gruppi fisiologici parte da uno stesso campione (acqua, suolo, ecc). quindi si modulano e regolano le condizioni di isolamento per dare una preferenza ai batteri di interesse rispetto agli altri.

Il metodo più usato è la tecnica delle colture di arricchimento. Si ha l'impiego di un terreno specifico e di condizioni selettive (es. temperatura, luce, O2) per i microrganismi desiderati. Selezioniamo ciò che cerchiamo. Dobbiamo quindi imporre delle condizioni per isolare determinati batteri. Ad esempio per batteri fotoautotrofi serve la luce. Quindi il terreno deve essere specifico anche dal punto di vista chimico-fisico. Ad esempio usando bottiglie che chiuse creano un ambiente anaerobico, posso isolare forme microbiche favorendo una determinata condizione di crescita in questo caso l'anaerobiosi. Oppure dei batteri che si nutrono di forme gassose.

necessitano un luogo adatto in cui si possa avere il sistema chiuso. Esistono anche le giare dell'anaerobiosi. La temperatura riesce di solito a discriminare tra enterobacter (inacque) rispetto a batteri escherichia coli che derivano dalle feci umane, vivono a 37 gradi. Innalzando la temperatura favorisco la crescita di escherichia coli rispetto a enterobacter. Questa tecnica è fondamentale per l'isolamento della coltura pura. L'arricchimento favorisce la crescita di specifici batteri poi isolabili in piastra e ottengo le singole colonie che posso studiare. Con un isolato, controllo che le singole colonie sono simili tra loro attraverso passaggi di purificazione. L'isolato ci permette di sapere quali batteri abbiamo e quindi come potremmo combatterli in caso di infezioni. 3) Classificare e identificare: I metodi devono essere specifici, sensibili alla discriminazione, riproducibili, rapidi, semplici e a basso costo. Classificare i batteri è importante dal punto di

vista medico, diagnostico, veterinaria, microbiologia, farmaceutica, alimentare ecc. Ad esempio è importante analizzare le acque per vedere se non contaminateda alcuni batteri che sono indicatori della qualità delle acque e se possono essere batteri patogeni da eliminare. La regolamentazione è obbligatoria per le acque potabili in cui è necessario determinare il numero di coliformi totali, coliformi fecali, streptococchi fecali e salmonella (zero). Le metodiche usate sono MPN e le membrane filtranti. Il trattamento A1 prevede un trattamento fisico semplice e disinfezione. A2 è un trattamento fisico e chimico normale e disinfezione. A3 è un trattamento fisico e chimico spinto con affinazione e disinfezione.

Le metodiche classiche iniziano con una analisi fenotipica dei batteri. Posso vedere dalla forma della colonia. Possiamo osservare al microscopio la morfologia di un singolo batterio. Un altro step è effettuare la colorazione di gram.

Cioè classificare se il batterio è positivo o negativo. Solo quelli che trattengono il colore viola sono gram positivi, gli altri sono gram negativi (perdono componente lipidica). Successivamente continuiamo i test.