Microbiologia II

MICROBIOLOGIA GENERALE

GENETICA BATTERICA

BIOLOGIA MOLECOLARE BATTERICA

Prof. Gianni Proveda

2017/2018

Citoscheletro Batterico

1) Analoghi dei Microfilamenti

Filamenti Actin-like, studiati per aberrazioni di mutanti specifici.

• Coinvolte prot. MreB, MbI e ParM

Strutturalmente simili all'actina, ma scarsa omologia di sequenza.

MreB è disposto ad elicoide lungo l'asse maggiore del bacillo, e ne determina la struttura. Mutazioni di MreB generano mutanti sferici (mreB assente nei cocchi).

* MreB è coinvolto nell'allungamento cellulare.

NB: l'allungamento richiede idrolisi di ATP.

2) Analoghi dei Filamenti Intermedi

Filamenti studiati in Caulobacter crescentus, un batterio curvo.

• Coinvolta CreS (crescentina)

3) Analoghi dei Microtubuli

• Coinvolta FtsZ

Forma l'anello Z durante la divisione cellulare (vedi dopo!).

NB: FtsZ ha omologia strutturale e di sequenza (40%) con la tubulina, e forma cilindri cavi.

FtsZ è ubiquitario (presente anche in mitocondri e cloroplasti).

SISTEMA MinC/D/E

• Mini-cells

Alcune cellule batteriche presentano mutazioni che portano alla formazione di un setto polare.

Il setto polare produce una cellula contenente i due cromosomi duplicati e una mini-cell, nella quale c’è solo una porzione di citoplasma.

NB Le mini-cells sono state a lungo sfruttate per produrre proteine eterologhe: una mutazione condizionale induceva le cellule normali a produrre mini-cells solo a certe temperature (non permissive). Le mini-cells contenevano solo i plasmidi (che dopo la trasformazione si distribuiscono sempre in modo uniforme), per cui potevano essere usate come mini-fabbriche di prot. eterologhe.

• Locus min

Situato a 26,3 minuti: contiene 3 geni

Mutanti minD → setto polare

NB Deleti per locus min → setto polare

Iper-espressione minC e minD → il setto non si forma

Iper-espressione minE → il setto si forma in punti casuali

Si deduce che MinC e MinD (MinCD) hanno un effetto negativo sulla formazione del setto, mentre MinE lo ha positivo.

• Proteine MinC e MinD

MinD ha attività ATPasica. Lega l'ATP, cambia conformazione, si inserisce nella membrana e lega MinC.

Complesso MinCD-ATP → inibisce la formazione dell'anello Z, impedendo la polimerizzazione di FtsZ

NB MinC e MinD sono disposte ad elicoide.

ORIGINE DI REPLICAZIONE DNA BATTERICO

• Individuazione sperimentale dell'origine di replicazione

➡ In E. coli l'origine (oriC) di duplicazione è nota ricercata testando i seguenti approcci:

1. Analisi di delezione
2. Analisi dei siti nei pressi dell'ipotetica regione ori

Si credevano sempre maggiormente portati presenti in diploidia nella bolla replicativa

3. Cloneggio della regione di ipotetica ori in un plasmide privato di ori.

Il plasmide ricevente dove avere amp e non ori ➡ solo i plasmidi che danno batteri vitali e replicanti avranno incorporato la regione ori.

• Unici in grado di replicarsi

• Struttura di oriC

~245 bp

★ GATC → Bersaglio di metilasi Dam

La regione DUE (DNA Unwinding Element) è ricca in AT.

Le regioni R e I sono 8 sequenze proteina DnaA:

[R₁, R₂, R₄] → ALTA AFFINITÀ

[I₁, I₂, I₃] → AFFINITÀ SPECIFICA PER DnaA-ATP

[R₃, R₅] → AFFINITÀ MINORE

→ A menano da legame specifico o I legame

Quindi solo in abbondante presenza di DnaA-ATP si innesca il FIRING (l'inizio della replicazione)

Struttura di Tus

Tus è asimmetrica, e legandosi al DNA (nel sito Ter) presenta una faccia permissiva su un filamento (sul quale può quindi scorrere l'elicasi) e una faccia non permissiva sul filamento complementare (sul quale l'elicasi non può scorrere per impedimento fisico)

faccia non permissiva

faccia permissiva

Struttura e funzionamento di DNA elicasi

DNA elicasi è esamerica. Procede ruotando nel singolo filamento, e cambiando conformazione per 3 volte ad ogni ciclo.

_t

Teoricamente ogni subunità acquisito ATP, lo degrada in ADP+P_i e perde l'ADP.

Per ciò ruotando attorno al DNA e avanzando con la forc.

Tus inativa una delle subunità dell'elicasi.

Nel 99% delle volte ciò blocca l'attività dell'elicasi stessa. Quando non accade (molto raramente) l'elicasi si bloccherà poi certamente alla prossima Tus sul Ter che incontrerà in direzione sfavorevole (con la faccia non permissiva rivolta contro il senso di avanzamento della forc.).

Per la ricombinazione omologa si distinguono due possibili situazioni di partenza:

• Danno a singolo filamento (SSB)
• Danno a doppio filamento (DSB)

• Ricombinazione col taglio a singolo filamento (SSB)

Rec A

Rec Q

Rec J

• Intervengono Rec A (opera la ricombinazione), Rec Q con funzione elicasi (cura il filamento singolo cocomotile a Rec A) e Rec J, con funzione nucleasica. •• Intervengono anche polimerasi e altri fattori ignoti.

Nell'altro caso, invece, quello in cui oltre alla non complementarietà termínale ni ha il frammento centrale non complementare, si ha una INVERSIONE SITO SPECIFICA, e si parla di SEGMENTO G.

Nel caso del prodotto oppáumento, il segmento G non mostra anomalie. A valle del segmento G è posto il gene gri, che codifica per la G invertori, una ricombinasi che escide il frammento G e lo reinserisce invertito. NB qui è sempre presente un Sgi: ricombinanti.

L'inversione del segmento G provoca il posizionamento dei geni V' e S' sotto il promotore di U e S. Questi geni regolano la STRUTTURA DELLE FIBRE CAUDALI DEL FAGO, e il loro ri-arrangiamento varia la specificità d'ospite del fago stesso.

Variazione di fase in Salmonella

Salmonella può modificare periodicamente alcune proteine di superficie, tra le quali quella del flagello (attività ANTIGENICA). Può farlo grazie a un RIARRANGIAMENTO GENETICO DEL LOCUS PER LA SINTESI DELLA FLAGELLINA, operato dall'invertasi H fac.,

FASE 1

B non esprime, (bin ne trans inventori) il promotore, e non esprime, ne utilizza il prod. C, che forma flagellina C.

- Meccanismo di trasposizione replicativa

Le estremità 3'-OH del trasposone congiungono le 5' del DNA ricevente, per un legame e formare l'intermedio di Shapiro.

In ② la trasposone taglia a singolo filamento sfaldando il DNA col trasposone. Anche in ① vi ha un taglio sfaldato dalla sequenze di inserzione.

In ④ interviene ligasi e polimerasi, replicando sia trasposone che sequenze di inserzione. Si forma però un cointegrato che viene risolto in ⑤ dalla RESOLVASI.

Riparo del danno

• Riparazione diretta
• BER
• Riparazione ricombinazionale
• NER
• MMR
• Riparazione SOS

• Riparazione diretta del danno
  • Il esempio tipico è l'azione della fotoliasi (phr), che rompe i dimeri di pirimidina con reazione luce-dipendente.
  • Altro esempio è la riparazione delle basi alchilate: nel caso della 6-O-metilguanina, ad esempio, agisce una 6-O-metilguanina metiltransferasi.

NER - Nucleotide Excision Repair

uvrC sostituisce a uvrA. uvrC (nucleasi) taglia a 4 nt al 3' e a 8 nt al 5' rispetto al danno, rimuovendo un tratto di filamento. Interviene uvrD, che rilascia il filamento danneggiato. DNA pol e DNA ligasi poi riempiono il vuoto creatosi.

Il complesso uvrAB (sub. di uvrA e uno di uvrB) accorre e intercetta una alterazione strutturale, fermandosi.

BER - Base Excision Repair

Questo sistema interviene solo sulle basi; senza coinvolgere lo scheletro zucchero-fosfato.

Interviene, nella base errata, una glicosilasi, che libera la base. Si forma così un sito AP (apurinico/pirimidinico), riconosciuto da una AP endonucleasi, che taglia al 5' del sito AP, formando un nick. Il nick è subito corretto dalla DNA pol I, che aggiunge anche la base corretta sul sito AP.