Microbiologia Industriale con quesiti esame

Microbiologia alimentare e industriale

Unità didattica 2: Microbiologia industriale con domande d'esame

Prof. Manuela Silvia

Corso di Laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari (G29)

Facoltà di Agraria - Università degli Studi di Milano

Biotecnologie classiche

Hanno radici antichissime. Il settore alimentare è uno dei campi di applicazione più vasto e più remoto. Si occupa dell'elaborazione spontanea di materia prima alimentare di microrganismi ambientali. Solo con la comparsa del microscopio si è capito quale fosse l'agente responsabile di tali fenomeni, quindi il loro uso è diventato libero e si è passati ad una trasformazione pilotata e controllata.

Microbiologia industriale

Trasformazione e/o applicazione di agenti specifici per specifiche esigenze di processo.

Primo processo industriale

• 1781: Produzione di lievito da pane (Olanda). S. Cerevisiae
• 1881: Lavoro su acido lattico (batteri lattici)
• 1928-29: Penicillina
• 1972-73: Tecnologie DNA ricombinante

Biotecnologie microbiche

Trovano applicazione nella microbiologia industriale. Si configura come: applicazione deliberata e controllata di agenti biologici semplici, cellule microbiche, vegetali e animali vive e morte, componenti cellulari in operazioni tecnologiche utili. Sono usate nella produzione di:

• Beni (cose)
• Biomasse microbiche per nutrizione umana o animale
• Commodities microbiche (acido citrico, ...)
• Specialità (antibiotici, vitamine B₁₂)
• Starters, enzimi, muffe...
• Probiotici e vaccini (anticolesteroleici)
• Servizi
• Trattamento di rifiuti liquidi e solidi
• Diagnostica mirata (anticorpi) e terapie mirate
• Valorizzazioni agro-industriali

Fermentazione

Definizione storica: processi microbiologici di trasformazione di zuccheri in etanolo e CO₂. Definizione in senso stretto: vera fermentazione (anaerobie). Definizione in senso lato: processo che usa un microrganismo (aerobiosi/anaerobiosi). Fermentazione tradizionale: processo di produzione di lievito da pane, birra e vino.

Equazione in forma semplificata di un processo biotecnologico

Ingegneria di processo

S X P > + (substrato) (cellule microbiche) (prodotto)

Fermentazione + Recupero

X: microrganismo. La fermentazione + Recupero è la parte più importante nella tecnologia alimentare in quanto comprende, appunto, la fermentazione e il recupero del processo in corso.

! ©Toppi Simone – Vietata la Vendita, e la Riproduzione senza il consenso dell’autore!

Fermentazioni tradizionali

Vengono preparate mediante l'uso di popolazioni miste (presenti nella materia prima o in ambienti particolari).

Sviluppo di processi su larga scala

Si basa sull'impiego di una coltura pura a seguito dell'individuazione e isolamento dei responsabili dei processi microbiologici. Sono ottenute dalle collezioni ufficiali, che sono delle istituzioni che costituiscono un punto d’interesse in quanto isolano i microrganismi. Sono fonte di microrganismi di interesse passato, presente e futuro. Il loro compito istituzionale è quello di mantenere i ceppi esistenti, raccoglierne di nuovi, distribuire su richiesta le colture pure. (Il costo delle colture pure varia a seconda dello scopo a cui serve.)

Scegliere il substrato

Nel settore alimentare vengono usati dei microrganismi che rientrano nella classificazione GRAS (generally recognized as safe), sono sicuri e non sono stati riportati come portatori di patologie in uomo o animale.

S: substrato

Sono gli ingredienti che vengono scelti per far crescere il nostro microrganismo (x). Svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di un processo fermentativo in funzione del tipo di microrganismo e di prodotto. In funzione dell'accoppiata microrganismo-substrato, determino la riuscita del processo, ma anche l'economicità del processo intero. Bisogna quindi scegliere dei prodotti che abbiano un costo ragionevole, ma che mi garantiscano la riuscita del processo e l'ottenimento del prodotto. I substrati impiegati su larga scala sono materie prime grezze, costituite da residui agro-industriali o surplus agricoli.

Fattori da considerare nella scelta del substrato

• Costo: devono essere economici, e la disponibilità, bisogna valutare se è o meno disponibile durante l’anno;
• Facilità di trasporto e di stoccaggio;
• Deve essere sterilizzabile, quando devo far crescere il microrganismo devo farlo crescere in solitudine, senza rischi di crescita di altre cose diverse dal mio microrganismo;
• Ininfluente nei riflessi delle variabili di fermentazione (aerazione, agitazione, schiuma, ...);
• Ottenimento di alte rese di conversione e fermentazione;
• Minima formazione di prodotti secondari;
• Assenza di problemi di tipo igienico-sanitario (tossicità) o di sicurezza.

P: prodotto

Il prodotto può essere:

• Cellule microbiche;
• Metaboliti primari (ac. Lattico);
• Metaboliti secondari (antibiotici) vengono prodotti alla fine dello sviluppo microbico (nella fase stazionaria);
• Enzimi;
• Prodotti di biotrasformazione.

Il prodotto che ottengo può avere un ruolo importante nel mercato solo se il processo con cui lo ottengo è efficiente. Non è possibile non considerare quello già presente sul mercato. È quindi necessario fare una ricerca di mercato per valutare ciò che il mercato già offre. Economicità: influenzata dalla resa associata alla procedura di isolamento e purificazione in relazione al valore del prodotto.

! ©Toppi Simone – Vietata la Vendita, e la Riproduzione senza il consenso dell’autore!

Ruolo dei singoli metaboliti nei confronti della cellula

Metaboliti primari: essenziali per la vita e la riproduzione della cellula.

Metaboliti secondari: non essenziali per la vita cellulare (non è chiaro come mai un metabolita secondario venga prodotto).

I prodotti della microbiologia industriale

Per differenziare le biomasse microbiche abbiamo due gruppi:

• Impiego integrale
• In funzione del contenuto:
• Funghi superiori commestibili
• Biomasse per dietetica
• Alghe
• Biomasse proteiche per mangimi
• Lisati di lieviti
• Estratti proteici-vitaminici
• Impiego per estrazione
• Lipidi
• Enzimi
• RNA e derivati
• Substrati o ambienti complessi
• In funzione dell'attività:
• Lieviti per panificazione
• Vaccini
• Starters
• Colture per fanghi attivi
• Fermenti lattici
• Colture insetticide
• Colture azotofissatrici
• Molecole particolari
• Biomasse impiegabili in biotrasformazioni

Metaboliti primari

Metaboliti di degradazione isolabili, prodotti finali o intermedi del metabolismo energetico (fermentativo o ossidativo). Riversati nel terreno colturale, ove si accumulano e da cui vengono estratti. Derivano dalla degradazione del substrato fonte di carbonio ed energia presente in elevata concentrazione.

• Acidi organici (lattico, butirrico, ...)
• Vitamine
• Nucleotidi e acidi nucleici
• AA e loro intermedi (ac. Glutammico, ...)
• Lipidi
• Alcoli (etanolo)
• Polialcoli (glicerolo, ...)
• Proteine
• Carboidrati

Metaboliti secondari

Non sono fatti per la sopravvivenza cellulare, ma ad un certo punto inizia il loro accumulo. Sono anche conosciuti come prodotti di biosintesi. Possono avere un ruolo metabolico definito (o comunque individuabile). I metaboliti secondari vengono generalmente prodotti a partire da quelli primari o loro intermedi, che fungono quindi da precursori. Esempio: acetato che non entra nel ciclo di Krebs, può dare origine a terpeni (limonene, ...) oppure a steroidi (hanno funzione farmaceutiche).

! ©Toppi Simone – Vietata la Vendita, e la Riproduzione senza il consenso dell’autore!

Prodotti complessi

Entrano in larga misura nel settore alimentare. Sono quei prodotti dove inserisco il microrganismo nel substrato e ottengo un prodotto nuovo dove non ha la separazione tra substrato e metabolita --> ho quindi un intero, un prodotto non isolabile.

• Bevande alcoliche, birra
• Tipi di latte fermentato
• Prodotti caseari
• Prodotti orientali fermentati
• Vegetali fermentati (olive, ...)
• Foraggi, insilati
• Stagionatura di carni insaccate
• Macerazioni di fibre tessili
• Trattamento dei rifiuti liquidi e solidi

Prodotti da DNA ricombinante

Sono di difficile classificazione in relazione alla eterogeneità.

Le diverse forme di resa

Per capire se un prodotto sia efficiente, ci sono due parametri:

• Resa di conversione (Y): rapporto tra prodotto formato nel processo fermentativo e substrato che si consuma. È un numero adimensionale in quanto è un rapporto gr/gr e varia tra valori di 0 e poco sopra 1. Se tutto il substrato si consuma dà 100% di prodotto il rapporto è 1. Se il substrato non dà prodotto Y=0/n°=0, di conseguenza con Y=0 il substrato usato è sbagliato. > è Y, più sarà alta l'efficienza.
• Resa di fermentazione: esprime i grammi di prodotto (in peso secco) per litro di brodocoltura. La sua unità di misura è g/L (gL^-1).

Le rese relative alle diverse classi di prodotto

Biomasse microbiche

• Resa di conversione Y= 0,5 per substrati carboidratici. Raggiunge 1 per substrati ridotti (n-paraffine)
• Resa di fermentazione è variabile tra 20 e 40 g/L

Prodotti complessi (appartenenti al settore alimentare)

Generalmente non è possibile determinare resa di conversione (Y) e resa di fermentazione.

Composizione dei terreni colturali

È necessario che siano appositamente studiati. Il terreno colturale deve fornire al microrganismo tutte le sostanze nutritive necessarie: alla crescita, alla produzione di energia, alla biosintesi dei metaboliti desiderati.

Deve contenere fonti di:

• Carbonio
• Azoto (generalmente 10 volte meno di C)
• Sali inorganici
• Vitamine o altri fattori di crescita
• Eventuali precursori (composti che fanno parte della molecola che volevo ottenere)

I terreni colturali li possiamo dividere in:

• Terreni sintetici
• Terreni complessi

! ©Toppi Simone – Vietata la Vendita, e la Riproduzione senza il consenso dell’autore!

Terreni sintetici

Terreni formati da materie prime chimicamente pure (costi elevati). Generalmente sono impiegati a livello di laboratorio, sono facilmente standardizzabili qualitativamente e quantitativamente. Forniscono crescita microbica e produzione di metaboliti limitata.

Terreni complessi

Terreni formati da materie prime grezze (costi limitati, e spesso hanno composizione diversa in funzione dell'origine del prodotto). Vengono usati su larga scala e sono limitatamente standardizzabili. Forniscono crescita microbica e produzione di metaboliti elevata.

Messa a punto di un terreno: come scelgo gli ingredienti

• Attraverso considerazioni legate al metabolismo microbico:
• Deve dare la massima resa di conversione
• Deve dare la massima resa di fermentazione
• Deve avere la massima velocità di formazione del prodotto (a livello industriale far funzionare un impianto per più o meno tempo è fonte di guadagno/dispendio per l'azienda)
• Garantire la minima formazione di prodotti secondari
• Rifornimento costante nel tempo della materie prima
• Standardizzazione delle materie prime
• Inconvenienti tecnologici legati alle materie prime
• Costi

Fonti di carbonio nei terreni colturali

Le fonti di carbonio le possiamo classificare in:

• Fonti rinnovabili (di origine naturale)
• Infatti la CO₂ è la più semplice, rinnovabile e disponibile fonte di carbonio.
• Fonti non rinnovabili (di origine petrolchimica)
• Alcali a corta catena (alcani)
• Fonti carboidratice
• Forma pura
• Forma grezza
• Fonti non carboidratice

Fonti carboidratiche

Forma pura:

• Monosaccaridi (prevalentemente glucosio);
• Disaccaridi (saccarosio e lattosio);
• Oligosaccaridi (maltodestrine), intermedi di degradazione dell’amido;
• Polisaccaridi (amido), maggiormente da mais (cellulosa).

Forma grezza:

• Melasso;
• Liscivo solfitico;
• Siero di latte;
• Corn melasse;
• Orzo maltizzato;
• Residui cellulosici.

Melasso

Residuo del processo di cristallizzazione del saccarosio. È un sottoprodotto dell'industria saccarifera ed è un residuo della cristallizzazione del saccarosio. È ottenibile dalla lavorazione della barbabietola, della canna da zucchero. (Anche residuo del processo da mais). Si presenta come sciroppo viscoso di colore bruno. Quello di barbabietola e di canna presentano composizione diversa:

Bietola Canna
Saccarosio 50 30-35
Zucchero invertito 1 20-22

Schematizzazione del processo di produzione del saccarosio

Barbabietola/canna
H₂O Estrazione Residuo
Purificazione Impurità
Concentrazione H₂O
Cristallizzazione
Saccarosio Melasso cristallizzato

Con il termine melasso identifichiamo il residuo finale della cristallizzazione del saccarosio. In senso lato invece identifica altri sottoprodotti o residui di processi estrattivi per l’ottenimento di zuccheri diversi dal saccarosio.

Corn molasse

Costituito dalle acque del processo di produzione del glucosio da mais. Ha un elevato contenuto di zuccheri, ma anche alte concentrazioni di sali.

High-test molasse

Non è il residuo finale o solito prodotto dell’estrazione del saccarosio, ma il prodotto principale del processo ottenuto per evaporazione con parziale inversione con invertasi. Non è un melasso in senso stretto.

Liscivo solfitico

È il residuo del processo di produzione della cellulosa da legname. Contiene il 20% di zuccheri fermentabili in rapporto dipendente dal tipo di legno impiegato. L’impiego dipende dalla composizione zuccherina.

Estratto di malto

È ottenuto da orzo sottoposto a maltizzazione. È un ottimo substrato per lieviti e muffe.

Siero di latte

È un sottoprodotto del settore lattiero/caseario. Contiene lattosio (4-5%). Forte incidenza dei costi di stoccaggio e trasporto in relazione del limitato contenuto di lattosio.

! ©Toppi Simone – Vietata la Vendita, e la Riproduzione senza il consenso dell’autore!

Amido

Sono disponibili diverse tipologie di amido che a secondo del grado di solubilità si differenziano. La maggior parte dell’amido è ottenuta da mais e patata. È diffuso l’impiego di amido insolubile che viene trattato direttamente in fermentatore con amilasi. [Glu----glu----glu (legami α 1-4)].

Destrine

Sono ottenute per idrolisi acida o enzimatica dell’amido. Sono solubili. Il grado di destrinizzazione è espresso come destrosio equivalente (DE) che è l’indice della percentuale di gruppi riducenti, espressi come glucosio. L’amido non sottoposto a idrolisi ha un DE pari a 0, mentre il glucosio ha un DE pari a 100.

Cellulosa

Rappresenta uno dei polimeri più abbondanti in natura. È associata a lignina ed emicellulosa, è presente nei materiali ligninocellulosici, in residui agricoli e industriali. È utilizzabile da un limitato numero di microrganismi, ed è una potenziale fonte di sciroppi di glucosio. [Glu----glu----glu (legami β 1-4)].

Fonti di carbonio non carboidratiche

Sono generalmente costituite da fonti non rinnovabili (tranne gli oli). Sono ingredienti molto eterogenei, in forma gassosa o liquida. Il loro costo è contenuto. Possiamo così dividerli:

• Idrocarburi gassosi: metano;
• Alcoli: metanolo, etanolo;
• Polialcoli: glicerolo, mannitolo e sorbitolo;
• Alcani: paraffine;
• Oli: vegetali, o animali (poco usati).

Fonti di azoto nei terreni colturali

Possiamo classificare le fonti di azoto in:

• Inorganiche: sali d’ammonio (solfati, cloruri), ammoniaca gassosa o idrato d’ammonio.
• Organiche: amminoacidi, proteine, urea.

Come fonti di azoto possono essere impiegate materie prime grezze:

• Corn steep liquor (acqua di macerazione);
• Farina di semi di soia;
• Farina di semi di cotone;
• Borlande di distilleria.

Corn steep liquor

È un sottoprodotto del processo di estrazione dell’amido di mais. Ha un costo contenuto ed è fonte di sostanze azotate, minerali e vitamine (gruppo B). Ha una composizione sia quantitativa che qualitativa molto variabile, in base:

• Al tipo di mais;
• Al tipo di batteri lattici e intensità di fermentazione;
• Tempo di estrazione;
• Temperatura di estrazione.

Inoltre conferisce (svantaggio) una forte acidità al terreno in quanto si addiziona carbonato di Ca. Il mais subisce un pretrattamento per immersione in acqua a pH 4 e a 45-50 °C, in controcorrente per 48 ore circa, in presenza di anidride solforosa. A questo punto si instaura una fermentazione lattica naturale di tipo termofila. Il mais viene separato dalla fase acquosa che viene concentrata fino ad ottenere un secco al 40-50%. Ottengo corn steep liquor.

! ©Toppi Simone – Vietata la Vendita, e la Riproduzione senza il consenso dell’autore!