Microbiologia industriale

Significato e applicazioni dei processi biotecnologici

Significa che svolgo un processo biotecnologico se prendo ad esempio una cellula (di qualsiasi tipo) per svolgere un processo che mi serva a ottenere oggetti o svolgere servizi, quali:

Beni

• Biomasse per nutrizione animale o umana.
• Produrre acido citrico o glutammico.
• Specialità (antibiotici o vitamine).
• Starter (es. batteri che vengono messi nel latte per fare lo yogurt) o enzimi.
• Probiotici (se ingeriti aiutano la popolazione microbica intestinale) e vaccini.
• Biomasse per la lotta biologica.

Servizi

• Trattamento di rifiuti solidi e liquidi urbani (alcuni organismi si nutrono di inquinanti delle acque).
• Valorizzazione dei residui agroindustriali (es. per fare il lievito da pane uno degli "ingredienti è il melasso che è un residuo della preparazione del saccarosio che si sfrutta per far crescere i lieviti).
• Diagnostica e terapia mirata (esula dal nostro corso di laurea).

Uso della fermentazione

Il termine fermentazione verrà spesso usato in maniera inappropriata: noi abbiamo imparato a conoscerlo collegato a un metabolismo microbico che viene condotto in assenza di ossigeno (es. fermentazione lattica, butirrica, propionica o, come resa famosa storicamente, alcolica); nel caso specifico verrà usato per intendere un'applicazione della tecnologia in senso lato: si intende un processo che sfrutta un microrganismo indipendentemente che ci si trovi in una condizione anaerobia o meno; quindi quando il microrganismo viene usato in scala industriale in un fermentatore.

Prodotti della microbiologia industriale

Biomasse microbiche

Produzione di cellule per essere vendute in funzione della loro attività o del loro contenuto. Sono starters o per esempio lievito per il pane. Resa di conversione in media 0,5, resa di fermentazione tra 20 e 40 g/l, ma si può arrivare anche oltre come, per esempio, nel processo della produzione di lievito da pane che è 60 g/l.

Metaboliti primari

Prodotti finali o intermedi del metabolismo microbico. Possono essere aminoacidi (acido glutammmico come insaporitore), acidi organici: lattico, butirrico, etanolo, glicerolo, acidi nucleici. Resa di conversione 0,5, resa di fermentazione 150-200 g/l per gli acidi organici.

Metaboliti secondari

Prodotti di biosintesi, sono fatti quando il microrganismo entra nella fase stazionaria di crescita. Sono composti dai metaboliti primari, che fungono come mattoncini coi quali vengono formati composti di struttura chimica complessa. Non sempre si è capito la motivazione per cui il microrganismo li produce. Resa di conversione difficile da calcolare perché ci sono troppe vie. Resa di fermentazione molto varia, in alcuni casi mg di prodotto per litro kg di substrato consumato, solitamente sono di alto valore economico, per esempio un antitumorale, antibiotici, vitamine, enzimi, ecc.

Prodotti complessi

Prodotti alimentari in cui non si distinguono più microrganismo e prodotto. Sono infatti formati dal microrganismo insieme al substrato che esso stesso ha trasformato in prodotto. Per esempio, il formaggio in cui non si distinguono più batteri lattici e latte, oppure le conserve vegetali. Risulta impossibile calcolare resa di conversione e di fermentazione.

Prodotti da DNA ricombinante

Sono ottenuti da microrganismi che hanno subito una modifica del loro patrimonio genetico.

Le diverse forme di resa

Resa di conversione

Y = prodotto formato (g) / prodotto consumato (g). La Y è un valore adimensionale che può andare da 0 a 1:

• 0: non c'è stato prodotto indipendentemente dal substrato consumato; il substrato è sbagliato.
• 1: massimo della produzione.

Resa di fermentazione

Si ottiene indicando quanti grammi di prodotto ottengo per ogni litro di coltura. Resa di fermentazione = g/L.

Composizione terreni colturali

Equazione di un processo biotecnologico: S (substrato) + X (microrganismo) = > P (prodotto). Naturalmente sia il substrato, sia il prodotto devono essere adeguati per avere un prodotto che è lo scopo della microbiologia industriale.

Microrganismo

Nelle fermentazioni tradizionali, di solito si ha una popolazione microbica mista, spesso facente già parte del substrato. Nella microbiologia industriale si usano colture pure che vengono selezionate e vengono scelte ogni qual volta si ha necessità di uno specifico processo o di un prodotto che deve avere sempre le stesse caratteristiche (stabilità di prodotto).

In azienda non c'è la possibilità di avere variabilità di processo: questa può trasformarsi in variabilità di resa ed eventualmente in minor produzione di prodotto, con conseguente danno economico. Nel settore farmaceutico soprattutto possono essere usati microrganismi ricombinanti, cioè che hanno subito modificazioni del genoma che consente loro di produrre un dato composto. Esistono delle collezioni ufficiali mondiali; sono istituzioni o enti che hanno il compito di ricercare e mantenere dei ceppi e, all'occorrenza, distribuire colture pure a chi le richiede.

Substrato

Insieme degli ingredienti su cui il MO cresce. È fondamentale sceglierlo in funzione del MO e del processo che si deve svolgere. Il costo del terreno colturale può influire economicamente dal 40 fino al 60% sull'intero processo, per questo motivo spesso si scelgono materie prime grezze costituite da residui di diversi settori produttivi, per esempio quello agricolo. Dall'accoppiata microrganismo-substrato dipende tutta l'economicità del processo. I fattori da considerare per la scelta di un substrato sono:

• Costo che deve essere minore possibile e disponibilità, gli ingredienti devono poter essere disponibili tutto l'anno oppure si deve avere la possibilità di stoccarli.
• Facilità nel trasporto, devono produrre il minor numero di prodotti secondari indesiderati e devono essere di facile gestibilità, quindi non tossici o infiammabili possibilmente.
• Non devono influenzare le variabili della fermentazione (per esempio non produrre schiuma), devono essere standardizzabili e sterilizzabili e portare a una velocità massima di produzione del prodotto di interesse. Devo poter ottenere massima resa di conversione e di fermentazione.

Terreno colturale

Miscela di ingredienti per la crescita del microrganismo, biosintesi dei composti di interesse. Può essere complesso: utilizzato solitamente negli impianti è costituito da materie prime grezze, spesso sottoprodotti dell'industria agricola, perché meno costose. Per questo motivo è più difficile da standardizzare. Dall'altro lato però porta ad una maggiore crescita microbica rispetto a quelli sintetici perché contengono componenti secondarie; o di sintesi: composto da materie prime chimicamente pure, per questo motivo è standardizzabile, viene usato principalmente nei laboratori perché ne bastano quantità minori, visto che i costi delle materie prime sono elevati. Minore crescita microbica rispetto a quello complesso.

Il microrganismo per crescere ha bisogno del terreno colturale che è una miscela che non solo gli permette di crescere ma di produrre ATP e di biosintetizzare il prodotto che mi interessa. Contiene assolutamente:

• Fonte di carbonio.
• Fonte di azoto.
• Sali inorganici.
• Vitamine, detti anche fattori di crescita.
• Precursori (eventualmente).

Fonti di carbonio

Possono essere classificate dal punto di vista delle fonti: rinnovabili se ottenibili in natura, non rinnovabili se hanno origine petrolchimica. Dal punto di vista dell'origine distinguiamo quelle carboidratiche che possono essere in:

• Forma pura: monosaccaridi (glucosio), disaccaridi (lattosio), oligosaccaridi, polisaccaridi (amido).
• Forma grezza: il melasso, sottoprodotto dell'industria del saccarosio, può essere ottenuto dalla barbabietola contiene 50% saccarosio, dalla canna da zucchero che contiene biotina, saccarosio al 30% zucchero invertito al 30%.
• Sciroppo di canna da zucchero: si ottiene dalla evaporazione del succo di canna da zucchero fino a 80% circa di solidi.
• Corn molasses deriva dalla idrolisi dell'amido di mais, contiene alta concentrazione di sali che possono dare fastidio ad alcuni microrganismi, contiene fino al 60% di glucosio.
• Estratto di malto contiene maltosio e glucosio, costa molto poco, adatto a lieviti e muffe.
• Siero di latte che residua dalla produzione del formaggio contiene il 5% di lattosio ma non è adatto a tutti i MO (S. Cerevisiae no).
• Liscivo solfitico è il residuo della produzione di cellulosa dal legname contiene il 20% di zuccheri esosi e pentosi, questi ultimi non sono utilizzabili da tutti i MO.
• Amido, è composto da molecole di glucosio legate con legami alfa 1-4, raggiunge costi elevati se è solubile, spesso viene acquistato insolubile e si effettua un pretrattamento con alfa amilasi.
• Cellulosa glucosio legame beta 1-4, un legame che è difficile da rompere e pochi MO ci riescono.

Fonti non carboidratiche: derivano dalla estrazione di gas naturale o da residui petroliferi.

• Metano: è un gas e dunque necessita continuo rifornimento, ha elevato grado di purezza, non lascia residui. È usato da poche specie microbiche e può formare una miscela esplosiva se entra a contatto con l'ossigeno, dunque bisogna prevedere elevati sistemi di sicurezza.
• Alcoli: metanolo, è solubile in acqua ma deve essere fornito in feed perché è un solvente delle membrane cellulari, dunque a elevata concentrazione risulta tossico per i microrganismi. È usato da più microrganismi rispetto al metano alcol che deriva dal metano, inoltre richiede grandi quantità di ossigeno.
• Etanolo: è meno tossico del metanolo ma molto più costoso.
• Polialcoli: es. glicerolo, o sorbitolo per produrre la vit. C.
• Alcani: sono componenti di solo carbonio e idrogeno, per questo motivo nella coltura serve molto ossigeno.
• Oli: sono le uniche fonti non carboidratiche rinnovabili: possono avere origine animale o vegetale, di solito sono utilizzati insieme ad altre fonti. Costano poco ma soprattutto quelli di origine animale possono lasciare residui dagli odori molto forti.

Fonti di azoto

Le fonti di azoto possono essere classificate in:

• Organiche: urea, proteine, aminoacidi.
• Inorganiche: sali d'ammonio, idrato d'ammonio, ammoniaca.

Quelle che derivano da materie prime grezze sono:

• Farine vegetali di semi di cotone o di soia: residui dell'estrazione di olio per solvente.
• Borlanda di distilleria: residui di estrazione dell'etanolo per fermentazione. Contengono fino al 25% di proteine e vitamine del gruppo B.
• Corn steep liquor: sottoprodotto della estrazione dell'amido dal mais. Contiene buone quantità di azoto insieme a vitamine del gruppo B.

Fonti di vitamine o fattori di crescita

Dato il loro costo molto elevato questi ingredienti non possono essere utilizzati come fonte di azoto, ma aggiunte in piccole concentrazioni fungono da supporto per lo sviluppo microbico. Sono per esempio idrolizzati di caseina ed estratti di lievito.

Sali minerali

Di solito si trovano già nell'acqua utilizzata per sciogliere tutti gli ingredienti del terreno di coltura, in alternativa vengono aggiunti come sali inorganici. Sono per esempio rame, ferro, zinco,...

Antischiuma

Ancora si aggiungono sostanze antischiuma: il terreno colturale viene, infatti, messo in un fermentatore che è aerato e agitato e ciò fa sì che le formulazioni anche molto ricche dei terreni di coltura possano formare schiuma e intasare il fermentatore.

Le caratteristiche dell'antischiuma ideale sono:

• Rapida dispersione nella coltura.
• Buona attività anche a bassa concentrazione e prolungata nel tempo.
• Non tossico.
• Buona termostabilità.
• Costi contenuti.
• Compatibile con processi fermentativi.

Gli antischiuma disponibili sul mercato non possiedono tutte le caratteristiche sopra elencate ma si fa un compromesso in funzione delle esigenze.

• Oli naturali: sono di origine vegetale; sono ingredienti e quindi a un certo punto il microrganismo li metabolizza: questo è contemporaneamente un pro ed un contro.
• Pro: non residuano.
• Contro: c'è la possibilità che si debbano aggiungere durante il processo.
• Antischiuma sintetici: sono sintetizzati in laboratorio tipo il silicone, non vengono metabolizzati dai microrganismi e ne va messo pochissimo per evitare il residuo.

Correttore di pH

Il pH solitamente tende ad abbassarsi durante il processo di fermentazione sino a diventare inadatto allo sviluppo del microrganismo, con importanti ripercussioni sulla resa. Si possono utilizzare sistemi tamponanti, per esempio sali inorganici per alzare il pH o carbonati di calcio per abbassare il pH, vengono aggiunti preventivamente al terreno colturale. Oppure acidi o basi che vengono aggiunti dal fermentatore se il valore del pH supera o scende sotto il valore di set point impostato.

Precursori

I precursori sono sostanze che poi vengono incorporate dal microrganismo nel composto che vogliamo ottenere. Se li forniamo al microrganismo già pronti, esso non deve fare altro che attaccarli aumentando la velocità di produzione del prodotto e riducendo le spese energetiche.

• Acido fenilacetico nel processo di produzione della penicillina G: questo viene incorporato nella molecola se il microrganismo (che è una muffa) lo trova già pronto, impiega meno energia nel dare vita al prodotto finito.
• Cobalto nella produzione di vitamina B12.
• Cloro nella produzione di clorotetraciclina.

Acqua

Non è mai acqua distillata perché all'interno del fermentatore ci vanno volumi anche di centinaia di litri e questo sarebbe un costo insostenibile, perciò si utilizza acqua di rete che in alcuni casi necessita di correzioni che in alcuni casi può essere riciclata. È di fondamentale importanza perché gli ingredienti del terreno colturale vengono sciolti in essa, permette il mantenimento della temperatura e apporta microelementi.

Selezione dei terreni di coltura

Per scegliere i terreni di coltura devo seguire determinati parametri:

• Tipo di cellula: microrganismi, cellule animali o vegetali,...
• Richiesta di ossigeno:
  • Aerobi.
  • Anaerobi.
• Substrato:
  • Gassoso.
  • Liquido.
  • Solido.
• Sterilità:
  • Assoluta.
  • Non necessaria.
• Dimensione del fermentatore:
  • Di laboratorio: 10L.
  • Pilota: 100-300 L.
  • Produzione: 600-700000 L.
• Tecnologia:
  • Batch.
  • Fed-batch.
  • Continua.

Noi ci concentreremo sulle colture di microrganismi (quindi: batteri, lieviti, funghi, muffe).

Colture industriali e bioreattori

Terminologia

Terreno colturale: soluzione o sospensione che contiene tutti gli ingredienti che sono necessari allo sviluppo microbico.

Inoculo: sospensione di natura liquida che contiene i microrganismi da impiegare in processo. Quando inoculo in un terreno di coltura devo incubare per un tempo specifico ed a una certa temperatura in modo che il microrganismo si sviluppi e produca quello di cui ho bisogno.

Brodo coltura: soluzione in cui l’organismo è cresciuto e ha consumato parte degli ingredienti del terreno colturale dalla sua divisione si ottengono:

• Biomassa: fase solida (microrganismo).
• Filtrato colturale: fase liquida ottenuta separando la biomassa, contiene tutto ciò che il MO non ha consumato e ha prodotto.

Colture liquide in laboratorio

Basso strato: si mette nella beuta un volume di terreno liquido che la riempia per 1/10 del suo volume totale. Questa coltura è idonea a microrganismi aerobi perché c’è una maggiore superficie a contatto con l’aria, quindi l’ossigeno. L’incubazione può essere fatta con il metodo stazionario o con agitazione, in questo caso si utilizza una beuta dotata di frangiflutti: delle rientranze che permettono di interrompere il vortice creato dall’agitazione che spingerebbe tutti i microrganismi contro le pareti della beuta.

Alto strato: si mette nella beuta un volume di terreno colturale liquido che la riempia per 1/2 del suo volume totale. Questa coltura è adatta a organismi anaerobi o che non hanno bisogno di grandi quantità di ossigeno perché c’è minore superficie a contatto con l’aria e quindi con l’ossigeno. L’incubazione si fa solo con il metodo stazionario.

Fermentatore o bioreattore

È un contenitore più o meno cilindrico ad asse verticale dotato di ingressi e uscite regolati da valvole che si possono chiudere per evitare il contatto tra coltura e ambiente. Il fermentatore deve essere riempito per i 2/3, la parte vuota si chiama spazio di testa. Esso è composto da:

• A: ingresso aria; l’aria viene rifornita dal basso e viene rotta a singole bollicine dallo sparger.
• C: albero motore; asta con motore che la fa muovere su se stessa.
• D: giranti; generalmente attaccate all’albero motore. Sono palette che servono per creare agitazione come nella beuta.
• E: frangiflutto; lamina che rientra nel fermentatore ai lati e rompe il vortice.
• F: ingressi: uno per ogni tipologia di elemento da inserire.
• G: sfiato dell'aria che entra in A, forma le bollicine, scambia ossigeno e anidride carbonica con la coltura e esce dallo sfiato; senza il fermentatore si spacca per la pressione del gas. Ha una valvola che non lo apre del tutto in modo da creare una resistenza all'ingresso di agenti esterni. Lo sfiato è dotato di un manometro: si lascia una sorta di sovrapressione di circa 0,2 atm rispetto alla pressione atmosferica.
• I: botola; finestrella per controllare il processo.
• L: sistema di termostatazione; un fermentatore è dotato di due pareti, una interna ed una esterna tra le quali scorre un liquido che mantiene la temperatura del fermentatore.
• M: scarico; permette lo scarico della coltura in un serbatoio al termine del processo.