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COLTURE LIQUIDE IN LABORATORIO
basso strato: si mette nella beuta un volume di terreno liquido che la riempia per 1/10 del suo volume totale. Questa coltura è idonea a microrganismi aerobi perché c'è una maggiore superficie a contatto con l'aria, quindi l'ossigeno. L'incubazione può essere fatta con il metodo stazionario o con agitazione, in questo caso si utilizza una beuta dotata di frangiflutti: delle rientranze che permettono di interrompere il vortice creato dalla agitazione che spingerebbe tutti i microrganismi contro le pareti della beuta.
alto strato: si mette nella beuta un volume di terreno colturale liquido che la riempia per 1/2 del suo volume totale. Questa coltura è adatta a organismi anaerobi o che non hanno bisogno di grandi quantità di ossigeno perché c'è minore superficie a contatto con l'aria e quindi con l'ossigeno. L'incubazione si fa solo con il metodo stazionario.
FERMENTATORE
Il bioreattore è un contenitore più o meno cilindrico ad asse verticale dotato di ingressi e uscite regolati da valvole che si possono chiudere per evitare il contatto tra coltura e ambiente. Il fermentatore deve essere riempito per i 2/3, la parte vuota si chiama spazio di testa. Esso è composto da:
- A: ingresso aria; l'aria viene rifornita dal basso e viene rotta a singole bollicine dallo sparger.
- C: albero motore; asta con motore che la fa muovere su se stessa.
- D: giranti; generalmente attaccate all'albero motore. Sono palette che servono per creare agitazione come nella beuta.
- E: frangiflutto; lamina che rientra nel fermentatore ai lati e rompe il vortice.
- F: ingressi: uno per ogni tipologia di elemento da inserire.
- G: sfiato dell'aria che entra in A, forma le bollicine, scambia ossigeno e anidride carbonica con la coltura e esce dallo sfiato; senza il fermentatore si spacca per la pressione del gas. Ha una valvola che non lo apre del tutto in modo da creare
Una resistenza all'ingresso di agenti esterni. Lo sfiato è dotato di un manometro: si lascia una sorta di sovrapressione di circa 0,2 atm rispetto alla pressione atmosferica.
I: botola; finestrella per controllare il processo.
L: sistema di termostatazione; un fermentatore è dotato di due pareti, una interna ed una estera tra le quali scorre un liquido che mantiene la temperatura del fermentatore.
M: scarico; permette lo scarico della coltura in un serbatoio al termine del processo. Può servire anche come punto di prelievo per il controllo delle fermentazioni più lunghe.
N: massimo livello di riempimento (⅔ o ¾: non di più perché lo spazio rimanente deve essere libero per l'eventuale sviluppo di schiuma che altrimenti intasa gli sfiati).
Un impianto di fermentazione è strutturato nel modo seguente:
- UPSTREAM:
- serbatoi di stoccaggio degli ingredienti dei terreni colturali.
- serbatoio in cui vengono fatte le
All’interno del fermentatore si trovano inoltre i frangiflutti: delle lamine che rompono ilvortiche creato dal sistema di agitazione e creano turbolenza. Questo fattore è estremamenteimportante per rendere il sistema omogeneo, inoltre è necessario che tutte le cellule entrino acontatto con i nutrienti e l’ossigeno se non ci fosse la coltura si schiaccerebbe tutta contro lepareti del fementatore.
Sistema di aerazione
Il sistema di aerazione è fondamentale in fermentatori per microrgsnismi aerobi i qualiutilizzano l’ossigeno presente nell’aria, che bisogna però disciogliere in un liquido affinchè lopossano utilizzare. L’aria in ingresso in un fermentatore deve inoltre essere sterilizzata perchèentra in un ambiente sterile
L’aria entra attraverso un sistema che si
chiama "sparger" che si trova sotto le giranti e ha il compito di ridurre in piccole bollicine l'aria in ingresso. 9 linea dell'aria: questa è il percorso dell'aria prima che entri nel fermentatore. L'aria entra in un fermentatore sterile, quindi va sterilizzata per filtrazione. come prima cosa l'aria viene compressa in un compressore che la aspira al proprio interno, la comprime a pressioni superiori alla pressione atmosferica di due-tre volte ed, in questo modo, l'aria acquista una forza motrice per essere mandata al fermentatore. Dopodiché entra in una valvola riduttrice che ne riduce la pressione. A questo punto passa prima attraverso un deoliatore che elimina dall'aria i residui di olio che provengono dal compressore e poi in un deumidificatore che elimina la condensa fonte di microrganismi. Ora l'aria subisce una prefiltrazione fatta con un vecchio filtro sterilizzante che elimina le impurità piùgrossolane e poi una filtrazione fatta con un filtro sterilizzante.
Un flussimetro misura e regola il flusso dell'aria, in genere tra 0,2 e 2 litri di aria/litri di coltura al minuto (vvm=volume di aria/volume di coltura al minuto). E' importante che ci sia uno sfiato.
SISTEMI DI CONTROLLO DEL FERMENTATORE
Il processo microbiologico può essere influenzato da diversi fattori che influenzano il metabolismo microbico e di conseguenza il rendimento:
- temperatura.
- pH.
- concentrazione di substrati: ossigeno disciolto, metaboliti, cellule.
Queste variabili possono essere classificate in due categorie: variabili misurate e regolate (es. temperatura) e variabili misurate (es. ossigeno disciolto).
Controllo della schiuma
La schiuma si forma nella nello spazio di testa del reattore che è lasciato libero per 1/3; è importante che essa non superi un certo livello o potrebbe bloccare lo sfiato e le valvole.
All'interno della parte alta del fermentatore si trova un
sensore collegato ad una sonda che si trova nell'aria. Quando la schiuma tocca la sonda si attiva un segnale che provoca l'apertura di una valvola e l'immissione dell'antischiuma dal suo serbatoio di contenimento; non appena la schiuma scende il segnale si ferma e la valvola dell'antischiuma viene chiusa. È un controllo elettronico. Controllo della temperatura L'aumento della temperatura porta ad un aumento della solubilità di componenti come azoto e carbonio, mentre diminuisce quella dell'ossigeno; influisce sulla viscosità della coltura e sulle funzionalità delle membrane cellulari. Di solito a causa del calore generato dalla agitazione meccanica e del metabolismo microbico che è esotermico la temperatura all'interno di un bioreattore tende ad aumentare. È però essenziale mantenere la temperatura all'interno di un range ottimale, questo lo si può fare attraverso 3 sistemi: unacamicia esterna: il bioreattore è fatto da una doppia parete attraverso la quale circola un liquido per la termostatazione, spesso acqua.
serpentino interno: tubo all'interno del quale scorre un liquido refrigerante che non ha alcun contatto con la coltura. In questo modo si riesce a raffreddare la parte centrale della coltura, più lontana dalle pareti del fermentatore è difficile da raffreddare con la camicia.
scambiatore esterno: a intervalli regolari 1/10 del volume della coltura viene pompata fuori dal fermentatore e passa in un sistema refrigerante per poi essere reimmessa.
Sterilizzazione del fermentatore
Può avvenire con due metodi:
sterilizzazione contemporanea del fermentatore e del terreno di coltura si inserisce il terreno di coltura nel fermentatore vuoto e lavato e poi si possono seguire due diverse vie: l'iniezione diretta di vapore, in tal caso si deve tenere conto della diluizione del terreno ad opera della condensa; utilizzo di vapore
Compartimentato tramite il serpentino o la camicia. Durante questo processo si mantiene una leggera agitazione per mantenere l'omogeneità.
Sterilizzazione separata del fermentatore e del terreno colturale: ci vuole meno tempo rispetto al metodo in contemporanea. La sterilizzazione del fermentatore vuoto avviene con vapore e quella del terreno separatamente può essere fatta in continuo attraverso un recipiente separato o in discontinuo tramite uno scambiatore di calore.
Sviluppo dei microrganismi in coltura liquida in fermentatore. I microrganismi unicellulari come lieviti o batteri crescono intorbidendo la coltura; i microrganismi miceliari, invece, hanno uno sviluppo particolare: se non si fornisce agitazione i microrganismi formano uno strato di ife compatte e si vede anche la sporificazione, se invece si trovano in coltura liquida con agitazione le ife non riescono a formarsi nella loro lunghezza e quindi o si disperdono o si avvolgono su se stesse e formano una struttura detta "pellet".
quindi a palline con le ife sulla parte superiore e cavi all’interno. Tecnologie di processo coltura batch: il fermentatore vuoto viene riempito con terreno di coltura e con il microrganismo, durante il processo non vi sono aggiunte di terreno colturale (se non antischiuma o correttore di pH) o prelievi di coltura (se non qualche ml di controllo). Il volume si mantiene costante e la crescita segue il classico andamento sigmoidale; quando il substrato è terminato il processo si spegne e il fermentatore si scarica. coltura fed-batch: il fermentatore vuoto viene riempito con i microrganismi all’interno di una quantità ridotta di terreno di coltura; nel corso del processo si aggiunge il restante terreno senza scarico di coltura: si ha il terreno che aumenta e il microrganismo con sempre nuovo substrato produrrà una grande quantità di biomassa (maggiore rispetto al metodo precedente), si parla di coltura aperta in ingresso perché il volume finale.È maggi
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