Microbiologia Generale: riassunti completi

La cellula microbica

La cellula è l’unità fondamentale della vita. Ogni cellula è un’entità isolata dalle altre per mezzo di una membrana e a volte anche per mezzo di una parete esterna alla membrana. La membrana definisce il compartimento cellulare mentre la parete fornisce sostegno strutturale: la membrana è semipermeabile e la cellula è una struttura dinamica aperta.

Proprietà condivise da tutte le cellule

• Compartimentizzazione e metabolismo: una cellula è un compartimento che assume nutrienti dall’ambiente, li trasforma e rilascia i prodotti di rifiuto nell’ambiente.
• Crescita: le sostanze chimiche assunte dall’ambiente sono utilizzate dalle cellule per fabbricare nuove cellule.
• Evoluzione: le cellule evolvono e acquisiscono nuove proprietà biologiche.
• Motilità: alcune cellule sono capaci di muoversi autonomamente.
• Differenziamento: alcune cellule possono formare nuove strutture cellulari come per esempio una spora generalmente come parte del ciclo di vita cellulare.
• Comunicazione: le cellule comunicano e interagiscono per mezzo di sostanze chimiche rilasciate nell’ambiente. Ad esempio, lo Streptococcus emette delle tossine quando il numero è rilevante e quindi possono contaminare.

Prime cellule e inizio dell’evoluzione biologica

Dato che tutte le cellule sono strutturate in modo simile, è stato ipotizzato che derivino da un antenato comune chiamato LUCA. Dopo che le prime cellule si sono sviluppate da materiale non cellulare, la loro crescita ha dato origine a popolazioni cellulari che hanno iniziato ad interagire e a formare comunità microbiche. L’evoluzione è il processo per cui i cambiamenti che intervengono in una linea di discendenti portano alla formazione di nuove varietà ed eventualmente di nuove specie ed organismi. Le relazioni evolutive tra gli organismi sono oggetto di studio della filogenesi: le relazioni filogenetiche tra cellule possono essere dedotte confrontando l’informazione genetica che esiste nei loro acidi nucleici o nelle proteine, in particolare le macromolecole che formano il ribosoma, in particolare gli rRNA, che sono stati usati da Carl Woese per costruire l’albero filogenetico di tutte le cellule.

Sequenziamento e filogenesi di un gene per l’RNA ribosomiale

• Il DNA viene estratto dalle cellule.
• Mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR) sono prodotte moltissime copie identiche di un gene codificante rRNA.
• Il gene viene sequenziato e la sequenza ottenuta viene allineata al computer con sequenze di rRNA di altri organismi.
• Un algoritmo produce il confronto delle coppie di basi e genera un albero filogenetico che descrive le differenze evolutive.

Dal confronto delle sequenze di rRNA sono state identificate 3 distinte linee evolutive, dette Domini: Bacteria, Archaea, Eukarya.

Diversità microbica in base all’habitat

Si presuppone che la vita abbia avuto inizio dai batteri estremofili:

• Alcuni studiosi suppongono un’origine “calda” perciò sono propensi a pensare che i batteri antogenici siano gli ipertermofili (vivono in ambienti con altissime temperature >60°C).
• Alcuni studiosi invece optano per l’antogenesi in ambiente freddo, durante le glaciazioni sotto gli strati di ghiaccio che proteggevano i microrganismi dalle radiazioni.
• Altri studiosi ritengono che l’antogenesi sia avvenuta in acqua.

I procarioti: i bacteria e gli archea

I Bacteria

• I Proteobacteria: rappresentano il phylum più numeroso tra i bacteria. Essi includono molti chemiorganotrofi, incluso Escherichia coli. A questo phylum appartengono anche molte specie fototrofe e chemiolitotrofe. Ai proteobatteri appartengono alcuni importanti patogeni come Salmonella (malattie gastro-intestinali), Ricketsie (tifo e febbre maculosa delle montagne rocciose).
• I Gram Positivi: comprendono microrganismi che hanno una comune filogenesi e una struttura della parete cellulare molto simile. In questo phylum troviamo batteri che producono endospore appartenenti ai geni Bacillus e Clastridium.
• I cianobatteri: sono batteri fototrofi ossigenici caratterizzati dalla presenza del cloroplasto. I cianobatteri hanno svolto un ruolo determinante nell’evoluzione della vita, in quanto sono stati i primi microrganismi fototrofi ossigenici comparsi sulla Terra (le alghe azzurre).
• Le Chlamidiae: sono batteri patogeni parassiti intracellulari obbligati che causano infezioni respiratorie e veneree nell’uomo.

Gli Archea

• Gli Euryarchaeota: contengono 4 gruppi di organismi diversi dal punto di vista fisiologico: i Metanogeni (anaerobi che ottengono energia mentre producono CH₄), gli Alofili estremi (aerobici che necessitano di grandi dosi di NaCl per il metabolismo e riproduzione), i Termoacidofili (in luoghi con temperature elevate e pH acido) e gli Ipertermofili (in luoghi con temperature superiori agli 80°C).
• I Crenarchaeota: sono sia chemiolitotrofi sia chemiorganotrofi e vivono in ambienti caldi come le sorgenti termali e i comuni idrotermali dei fondali oceanici. Sono prevalentemente anaerobi e molti usano l’H₂ presente nei loro habitat come fonte di energia.
• I Thaumarchaeota: sono un phylum scoperto recentemente e comprendono batteri mesofili, che vivono in condizioni medie di temperatura, pressione e pH.

Gli estremofili

• I Termofili: hanno proteine, composte da amminoacidi polari idrofobici. Gli amminoacidi sono legati nella struttura terziaria della proteina, da un gran numero di ponti zolfuro che stabilizzano la proteina e si denaturano a temperature ancora più elevate rispetto a quelle in cui vivono questi batteri. Nei termofili è presente una particolare curvatura per la trascrizione del gene. I termofili si adattano a varie temperature perché presentano particolari enzimi che si compattano a basse temperature e funzionano allo stesso modo.
• I Barofili: sono batteri che vivono nelle profondità oceaniche. Essi contengono catene di trasporto di protoni e di elettroni modificate. Inizialmente questi batteri possedevano un solo enzima per vie metaboliche che era molto lento, perciò c’è stato un adattamento che ha portato alla sintesi di nuovi enzimi per più vie metaboliche.

Struttura e funzioni cellulari

Morfologia cellulare

Un batterio di forma ovidale o sferica è detto cocco, un batterio di forma cilindrica è detto bastoncello o bacillo (alcuni bastoncelli si avvolgono a spirale e sono detti sperilli). Le cellule di molti procarioti dopo la divisione cellulare restano associate a formare dei gruppi come delle catene (Streptococcus), delle strutture tridimensionali a cubo (Sarcina) o irregolari a grappolo (Staphylococcus). Diversi gruppi di batteri sono facilmente riconoscibili dalla loro forma, ad esempio i batteri pedunzolati, le cui cellule possiedono estusioni a forma di lunghi tubi o peduncoli, i batteri filamentosi, che formano cellule lunghe e sottili o catene di cellule. La morfologia dei batteri è data dalla presenza di particolari proteine citoplasmatiche che costituiscono il citoscheletro del batterio dandogli la forma.

Le cellule procariotiche hanno un diametro variabile da 0,2 um a più di 700 um. È stato ipotizzato che le dimensioni ridotte di queste cellule siano dovute a problemi legati all’assorbimento: poiché il tasso metabolico varia in maniera inversamente proporzionale al quadrato delle sue dimensioni, per cellule molto grandi l’assorbimento dei nutrienti potrebbe rallentare il metabolismo al punto che la cellula, troppo grande, non sia competitiva con le cellule più piccole. Le cellule più piccole hanno una maggiore superficie relativamente al volume cellulare rispetto alle cellule grandi. Con l’aumento delle dimensioni di una cellula il rapporto S/V diminuisce.

Cellule dei procarioti

• Membrana citoplasmatica senza steroli ma con opanoidi
• Parete cellulare di peptidoglicano
• Plasmidi (elementi genetici che si duplicano indipendentemente dalla cellula e sono utili per l’adattamento)
• Ribosomi 70S
• Nucleoide
• Inclusioni citoplasmatiche (granuli di riserva)

Cellule degli eucarioti

• Membrana citoplasmatica con steroli
• Parete cellulare
• Ribosomi 80S
• Nucleo definito da una membrana
• Organuli

E i virus?

I virus sono microrganismi parassiti, vivono in una cellula ospite, sia essa un batterio (batteriofagi) sia essa una cellula eucariotica. Essi non sono cellule, sono semplicemente costituiti da un acido nucleico (RNA e DNA a singola o doppia elica) rivestito da una membrana detta capside.

La membrana cellulare

La membrana citoplasmatica è una barriera sottile che circonda la cellula separando il citoplasma dall’ambiente esterno, però conferisce poca protezione dalla lisi osmotica. Grazie alla sua composizione, la membrana costituisce un'ottima barriera selettiva: infatti è il doppio strato fosfolipidico, che con le sue caratteristiche anfipatiche (componente idrofobica di acidi grassi e componente idrofobica di glicerofosfato) consente il passaggio di acqua e piccole molecole apolari. La membrana citoplasmatica di alcuni batteri è rafforzata da molecole dette opanoidi: queste molecole sono planari rigide e sono analoghi strutturali degli steroli.

Le principali proteine della membrana citoplasmatica hanno regioni idrofobiche nelle parti che attraversano la membrana, e regioni idrofiliche a contatto con l’esterno e col citoplasma. La superficie esterna dei gram negativi interagisce con una varietà di proteine che legano substrati o processano grandi molecole per il loro trasporto nelle cellule. In base a come si legano alla membrana si distinguono: proteine integrali (inserite saldamente nella membrana), proteine periferiche (non si inseriscono nella membrana ma restano associate alla superficie). In genere le proteine periferiche interagiscono con quelle integrali per svolgere processi cellulari importanti, quali il metabolismo energetico ed il trasporto.

Particolarità degli Archaea

Al contrario delle cellule eucariotiche e delle cellule degli eubatteri, nella membrana degli Archaea i lipidi sono legati al glicerolo mediante un legame etere. I lipidi degli Archaea non hanno delle vere catene laterali di acidi grassi ma le catene laterali sono costituite da unità ripetute di isoprene, un idrocarburo idrofobico a 5 atomi di carbonio. La membrana citoplasmatica degli Archaea può essere costituita di dieteri di glicerolo con catene laterali di 20 atomi di carbonio, oppure di tetraeteri di diglicerolo con catene laterali di 40 atomi di carbonio.

Le funzioni della membrana plasmatica

• Barriera di permeabilità: previene la dispersione di sostanze e funziona come una porta di controllo per il trasporto di nutrienti verso l’interno e di sostanze di scarto verso l’esterno della cellula.
• Sito di ancoraggio: funziona come sito di ancoraggio per molte proteine coinvolte nel trasporto, sulla bioenergetica e nella chemiotassi.
• Conservazione dell’energia.

I sistemi di trasporto

Perché la cellula ha bisogno di proteine di trasporto anziché far passare tutti i soluti mediante diffusione semplice? Perché se passasse tutto per diffusione semplice, la cellula non potrebbe mai raggiungere le concentrazioni intracellulari per svolgere reazioni biochimiche, pertanto la cellula deve disporre di meccanismi per accumulare soluti fino a livelli superiori a quelli che si ritrovano nei loro habitat.

Quali sono le caratteristiche di un buon trasportatore?

• Effetto di saturazione: se la concentrazione del substrato è abbastanza alta da saturare il trasportatore, il tasso di captazione è massimo e non aumenta ulteriormente se si aumenta la concentrazione del substrato.
• Elevata specificità: molte proteine trasportatrici reagiscono solo con una singola molecola.

Quali sono i meccanismi di trasporto?

• Uniporto: il trasporto di una sostanza è monodirezionale verso l’interno e l’esterno della cellula.
• Simporto: il trasporto è di due sostanze e monodirezionale.
• Antiporto: il trasporto è di due sostanze che si muovono in direzioni opposte.

La parete cellulare

A causa dell’attività dei sistemi di trasporto, il citoplasma delle cellule batteriche mantiene un’alta concentrazione di soluti disciolti: ciò provoca una notevole pressione osmotica. Per evitare che avvenga la lisi cellulare a causa di questa forte pressione, i batteri sono dotati di parete cellulare che conferisce ad essi forma e rigidità. Esistono tuttavia dei batteri che non sono provvisti di parete, infatti si sono adattati alla vita intracellulare (non vivono fuori dalla cellula ospite).

In base al tipo di parete e di colorazione si distinguono due tipi di batteri:

• Gram Positivi: hanno una parete spessa costituita prevalentemente da un tipo di molecola.
• Gram Negativi: hanno una parete chimicamente complessa formata da almeno due strati.

Cosa accomuna le pareti dei Gram Positivi e dei Gram Negativi?

La struttura che li accomuna è il peptidoglicano, un polisaccaride costituito da due carboidrati azotati uniti da un legame B=1,4 che sono l’N-acetilglucosamina e l’acido N-acetilmuramico. Il gruppo carbossilico –COOH dell’acido N-acetilmuramico è legato ad un tetrapeptide costituito da L-alanina, acido D-glutamico, L-lisina e D-alanina. Nella catena di peptidoglicano il quarto aminoacido si lega al terzo della catena adiacente (legami intercatena che stabilizzano la parete). Le lunghe catene di peptidoglicano sono sintetizzate adiacenti le une alle altre in modo da formare una lamina che circonda la cellula.

Nei batteri Gram Negativi i legami crociati si formano mediante il legame peptidico diretto tra il gruppo amminico dell’acido diaminopimelico di una cellula glicanica e il gruppo carbossilico della D-alanina terminale della catena glicanica adiacente. Nei batteri Gram Positivi i legami crociati si possono formare attraverso un corto ponte peptidico e il tipo e il numero di amminoacidi che costituiscono il ponte variano da specie a specie. Il peptidoglicano può essere distrutto dal lisozima, una proteina (enzima) che spezza il legame B=1,4 tra le componenti glucidiche del peptidoglicano, indebolendo così la parete e permettendo all’acqua di entrare e provocare la lisi cellulare. Per questo motivo il lisozima funziona come una linea primaria di difesa contro le infezioni batteriche.

Quali sono le differenze tra la parete dei Gram Positivi e quella dei Gram Negativi?

Nei Gram Positivi il peptidoglicano rappresenta il 90% della parete cellulare ed è presente in vari strati (anche 50) per conferire spessore e rigidità. È spessa circa 200-800 A. molti batteri Gram Positivi hanno componenti acidici, detti acidi teicoici: tale termine include tutti i polimeri della parete cellulare, della membrana e della capsula costituiti da glicerolfosfato o ribisolfosfato. Questi polialcoli sono legati da esteri fosfato e di solito contengono zuccheri o D-alanina. Dato che i fosfati sono carichi negativamente, gli acidi teicoici, sono almeno in parte responsabili della carica elettrica negativa complessiva della superfiie cellulare.

Nei batteri Gram Negativi il peptidoglicano costituisce solo 4-10 strati di parete perché la cellula riceve sostegno strutturale da una membrana esterna alla parete: tale membrana è costituita da un doppio strato fosfolipidico, proteine e polisaccaridi e questo complesso è definito strato Lipopolisaccaridico. La porzione lipidica del lipolisaccaride è detta lipide A ed è costituita glucosamina fosforilata esterificata con acidi grassi. La membrana esterna non ha solo valore strutturale ma una sua importante attività biologica è la tossicità per gli animali: tale tossicità è data dal lipide A, che è definito come Endotossina.

Come è fatta la parete negli Archaeabacteria?

Nella loro parete cellulare è presente una molecola simile al peptidoglicano, detta pseudomureina o pseudopeptidoglicano, costituita da ripetizioni alternate di N-acetilglucasamina e acido N-acetilalosamuranico. Lo pseudopeptidoglicano differisce dal peptidoglicano anche dal fatto che i legami glicosidici tra i derivati degli zuccheri sono di tipo B-1,3 e non B-1,4.

Differenza di colorazione nei batteri dovuta alla struttura della parete

Colorazione dei Gram

• Fase 1: colorare uno striscio di cellule fissate al colore con cristal-violetto per 1 minuto. Tutte le cellule così si colorano di viola.
• Fase 2: aggiungere una soluzione iodata per 1 minuto. Così tutte le cellule restano colorate di viola.
• Fase 3: decolorare con alcol per circa 20 secondi. Così le cellule gram positive rimangono viola mentre quelle gram negative risultano incolori.
• Fase 4: controcolorare con safranina per 1-2 minuti. Così le cellule gram negative prenderanno la colorazione rosa o rosse.

La spiegazione la si trova nella diversa composizione della parete. Nei gram positivi è molto spessa e costituita principalmente da peptidoglicano: la parete viene disidratata dall’azione dell’alcol provocando la chiusura dei pori nella parete e impedendo così l’uscita del complesso insolubile di cristal-violetto e iodio. Al contrario, nei gram negativi l’alcol penetra facilmente nella membrana esterna ricca di lipidi ed estrae il complesso cristal-violetto e iodio dalla cellula, lasciandola incolore e visibile solo se controcolorante con un secondo colorante.

Colorazione per micobatteri

• Fase 1: utilizzare il fenolo per far entrare a caldo la carbolfuxina. Così le cellule si colorano di fuxia.
• Fase 2: decolorare con un alcol acido. Così tutti i batteri vengono decolorati tranne i micobatteri.
• Fase 3: aggiungere blu di metilene. Così tutti i batteri si colorano di blu e i micobatteri restano fuxia.

Ciò avviene perché i micobatteri hanno una parete particolare, ossia presentano il peptidoglicano e la membrana esterna, ma sono presenti anche glicani, acidi micolici e LPS modificato, e sono queste le caratteristiche che consentono al colorante carbolfuxina di permanere nella cellula e non essere espulsi.