Microbiologia generale

OPERONE

insieme di geni adiacenti con espressione coordinata da un solo promotore - un solo trascritto policistronico - regioni di inizio della traduzione interne al messaggero - 5'-UTR = regione leader - NON tradotta - alla fine: terminatori trascrizionali

APPARATO TRASCRIZIONALE

Bacteria - 1 sola RNA pol:

• relativamente semplice
• sensibile a Rifampicina (antibiotico) - inibisce inizio della trascrizione
• Streptolidigina - inibisce allungamento

Archaea - 1 sola RNA pol:

• più complessa - simile a RNApol II degli Eukarya (3 pol)
• insensibile a Rifampicina

RNA pol batterica - 5 subunità (450 kDa):

• β + β' - grandi - sito catalitico
• α - αCTD + αNTD unita da linker flessibile
• αCTD - lega DNA
• ω - lega DNA
• σ - lega promotore

OLOENZIMA

1. legame oloenzima-promotore
2. rilascio fattore σ

INIZIO TRASCRIZIONE

1. legame oloenzima-promotore
2. rilascio fattore σ

• FATTORI σ PRINCIPALI = controllo di geni housekeeping (per la sopravvivenza)
  • σ70/D → batteri Gram- es: E. coli* 70 = peso molecolare: 70 kDa* chiamato anche RPOD → riferito al gene
• σA → batteri Gram +
  • FATTORI σ ALTERNATIVI = controllo di geni specifici per determinati stimoli ambientali
  • σ32 → geni heat shock
  • σ54/N → geni per utilizzo di N
  • σ38/S → geni per la fase stazionaria (= NO crescita)
• Micoplasmi (= parassiti obbligati) → 1 solo fattore σ
• alcuni Streptomiceti: 60+ fattori σ alternativi
• alcuni fattori σ sono molto specifici
• associandosi con RNA pol → cambiamento di specificità per uno specifico promotore
• sequenze consenso per σ70:
  • -35 : TTGACA
  • -10: TATAAT
  • 15-17 bp tra le 2 sequenze
• sequenze consenso diverse per fattori

σ alternativi→ stessa posizione→ eccezione: σ54/N → sequenze consenso a -24 e- 12• ha anche struttura diversa

ALLUNGAMENTO= copia del filamento stampo * velocità media = 50 nt/s

TERMINAZIONE

TERMINATORI INTRINSECI = trascritti che si ripiegano a forcina seguiti da serie di U1. trascrizione del terminatore

2. trascrizione U → rallentamento

3. ripiegamento a forcina → ibrido DNA-RNA si accorcia

4. rilascio del messaggero e distacco RNA pol

TERMINAZIONE RHO-DIPENDENTE

FATTORE RHO = proteina esamerica es senziale per la cellula che si associa al trascritto nascente * attivitàelicasica↳ nei siti di pausa (poli U) Rho scorre sul trascritto, raggiunge RNA Pol e determina distacco

REGOLAZIONE DELL' ESPRESSIONE GENICA

MECCANISMI DI REGOLAZIONE NEGATIVI= elemento regolatore reprime espressione genica> REPRESSORE

MECCANISMI DI REGOLAZIONE POSITIVI= elemento regolatore attiva espressione genica> ATTIVATORE

GENI REGOLATI IN RISPOSTA A

SEGNALI AMBIENTALI

• SISTEMI INDUCIBILI = segnale attiva espressione genica (INDUZIONE)
• SISTEMI REPRIMIBILI = segnale reprime espressione genica (REPRESSIONE)
• SISTEMI COSTITUTIVI = sempre espressi

FATTORI COINVOLTI NELLA REGOLAZIONE

• FATTORI TRANS (PROTEINE) → ELEMENTI IN CIS (DNA)
• RNA pol + σ → promotore
• repressore → operatore
• attivatore → sito attivatore

REGOLAZIONE PROTEINE REGOLATRICI

Piccole molecole che legano NON covalentemente le proteine regolatrici

• INDUTTORI → inattivano repressore
• CO-REPRESSORI → attivano apo-repressore (= forma inattiva di un repressore) che diventa repressore
• CO-ATTIVATORI → attivano apo-attivatore

Questi ligandi possono:

• provenire dall'esterno della cellula
• essere sintetizzati all'interno

Modificazioni covalenti delle proteine regolatrici → FOSFORILAZIONE (soprattutto)

SISTEMA A DUE COMPONENTI:

1. proteina chinasi transmembrana
2. dominio esterno capta segnale →

autofosforilazione del dominio interno tramite ATP

fosforilazione di una proteina regolatrice Response regolatori→ attivazione

induzione/repressione dell'espressione genica

fosfatasi rimuove P da proteina regolatrice

Procarioti: fosforilazione a livello di His e Asp

Eucarioti: fosforilazione di Ser/Thr/Tyr→ processi in cui sono coinvolti sistemi a 2 componenti

utilizzo elementi necessari alla crescita es: N

degradazione di sostanze organiche

resistenza a metalli pesanti

resistenza ad antibiotici

adesione a substrati solidi es: biofilm

chemiotassi

virulenza

Regolazione spaziale e temporale:

compartimentalizzazione

gradienti di concentrazione

espressione a cascata di regolatori

OPERONE LAC E.coli> operone catabolico = contiene geni coinvolti nella degradazione del lattosio> β-galattosidasi = enzima che scinde il lattosio in galattosio e glucosio o lo trasforma in 1,6-allolattosio → vero induttore

dell'operone

Crescita batterica in coltura con:

• glucosio 0.2 g/L → limitante
• lattosio 2 g/L → batteri utilizzano glucosio fino ad esaurirlo (fonte preferenziale) poi utilizzano lattosio → β-galattosidasi NON è espressa costitutivamente

P = promotore → si lega RNA pol * NO alta affinità → necessità di un attivatore per legame RNA pol * attivatore = proteina CRP: apoattivatore → necessita co-attivatore per legame ad A* co-attivatore: cAMP → prodotto quando non c'è glucosio da adenilato ciclasi* adenilato ciclasi: attivato da EIIa-P = proteina della fosfotransferasi che non può dare P a EIIb perché senza glucosio la catena si ferma; se c'è glucosio: EIIa inibisce lattosiopermeasi

O = operatore → si lega repressore* repressore = tetramero che lega uno a valle e uno amonte di P → piegamento del DNA* inattivato da allolattosio → possibile trascrizione

lacZ = gene per B- galattosidasi

lacY = gene per proteine coinvolte nel trasporto del lattosio

lacA = gene per transacetilasi

Meccanismi di regolazione:

• negativo → repressore
• positivo → CRP-cAMP: CCR = Carbon Catabolite Repression

REGOLAZIONE GLOBALE DELL'UTILIZZAZIONE DI FONTI DI CARBONIO

* altri operoni sono regolati da cAMP

REGULONE = insieme ai geni che vengono co-regolati e rispondono alle variazioni di cAMP → 150 geni in E.coli

* cAMP = ALLARMONE → segnale di cambio fonte di C

Gerarchia degli zuccheri in E. coli:

Zuccheri di classe A → usati preferenzialmente:

1. fruttosio
2. mannosio
3. mannitolo

Zuccheri di classe B:

1. arabinosio
2. maltosio
3. ramnosio
4. lattosio
5. xylosio
6. galattosio

* Glucosio NON è la fonte preferita di C in tutti i batteri:

es: Pseudomonas aeruginosa → composti C4 (es: succinato) come fonte preferita; Glucosio: fonte di classe B

* omologo di CRP → Vfr: controlla geni legati alla virulenza

REGOLAZIONE

DI OPERONI CATABOLICI> spesso sistemi indicibili regolati dal substratoes: lattosio induce operone lac> network di regolazione globale: REGULONE → gerarchie nell'utilizzo delle fonti di C> sistemi di smistamento del glucosio tra vie cataboliche e di storage↳ regolati da proteine e/o small RNAes: in E. coli, proteina CsrA regola il flusso di C ed è regolata RNA non codificanti

REGOLAZIONE SISTEMI ANABOLICIBIOSINTESI AA> vie biosintetiche intrecciate tra loro> regolate da:

• meccanismi sensore dei livelli dell'aa
• meccanismi effettori che modula espressione e attività degli enzimi coinvolti
• regolazione a diversi livelli

spesso RETROINIBIZIONE (o REGOLAZIONE A FEEDBACK) = prodotto finale inibisce il primo enzimadel pathway

• non competitiva → sito dell'inibitore ≠ sito di legame del substrato
• reversibile

es: regolazione della Glutammina Sintasi (GS):

• importante nell'assimilazione di N

sintesi di Glutammina da Glutammato

• ~ 600 kDa
• 2 anelli da 6 subunità ciascuno
• lega ATP, NH4+ e Acido Glutammico
• reazione catalizzata:

attività regolata da:

• quantità di N → se troppo: ADP ribosilazione da Adenil Transferasi (AT) → inibizione
• tutte le subunità possono essere adenilate → più sensibili a feedback inhibition da parte di derivati della Gln
• AT può funzionare al contrario se poco N attivando GS
• quantità di Glutammina (Gln) → derivati della Gln inibiscono GS con effetto cumulativo: Trp, His, Ala, Gly, Glucosammina-6P, Carbamoil-P, CTP, AMP
• legame nel sito del substrato → al posto di Glu

BIOSINTESI AA AROMATICI

precursori:

• PEP
• eritrosio-UP (via dei pentosi-P)

prima parte in comune, poi 2 rami:

• Trp → operone Trp
• Tyr e Phe

ogni aa inibisce il 1° enzima specifico per la sua via biosintetica

tutti e 3 inibiscono produzione di

Corismato = ultimointermedio comune alle 3 vieOperone Trp> in E. coli: 5 geni: trpA, trpB, trpC, trpD, trpE> Trp inibisce Antranilato Sintetasi tramite retroinibizione* NON cambia i livelli di espressione genica> sistema reprimibile:Aporepressore + Trp (co-repressore) → Repressore completo → inibisce trascrizione> ATTENUAZIONE = se mutazione inattiva aporepressore, NON abbiamo trascrizione continua, MA lamaggior parte dei trascritti si ferma prima: a livello della regione leader* REGIONE LEADER = regione tra operatore e 1° gene↳ nell' operone Trp: contiene regione codificante per 2 codoni per Trp consecutivi + 4regioni complementari a 2 a 2 che si appaiano nel trascritto a RNA → formazionedi: • sito di pausa (regione 1 e 2) → codoni Trp nella regione 1• sito di terminazione (regione 3 e 4)• sito di antiterminazione (regione 2 e 3) → sequestro regione 3 che non puòappaiarsi con 4• struttura che si forma dipende

da disponibilità regione 1 di appaiarsi con la2 → dipende da presenza di Trp:+Trp

appaiamento ragione 3-4: terminazione trascrizione-Trp → traduzione bloccata ai codoni Trp

appaiamento regione 2-3> 2 meccanismi di controllo:

• presenza di Trp → blocco inizio trascrizione
• presenza di tRNA-Trp → blocco allungamento

molti operoni biosintetici funzionano così