Microbiologia

Introduzione allo studio della microbiologia medica

La microbiologia studia i microorganismi invisibili a occhio nudo (<0,1 mm). Il potere di risoluzione dell’occhio umano è superiore a 0,1 mm. I microorganismi hanno dimensioni molto più piccole:

• L’ordine di grandezza di un batterio è il μm (micrometro), la millesima parte del millimetro (1/1000 mm). I batteri sono osservabili con la microscopia ottica.
• L’ordine di grandezza di un virus è in nm (nanometro), la millesima parte del micrometro (1/1000 μm). I virus sono studiabili con la microscopia elettronica.

La microbiologia è una scienza recente perché ha aspettato gli strumenti che le permettessero di operare. Nella microbiologia sono studiati:

Batteri e archei

1. I batteri

2. Gli archei, che sono una via di mezzo tra gli eucarioti e i procarioti. Sono organismi unicellulari, assomigliano ai batteri ma hanno caratteristiche che li fanno assomigliare anche agli eucarioti. Popolano diversi ambienti della Terra, si abituano a stare in ambienti estremi (pH acido, alte temperature). Sono microrganismi molto affascinanti, sono unicellulari, assomigliano molto ai batteri. Archea sta per archeobatteri, pur essendo molto semplici strutturalmente hanno caratteristiche comuni agli eucarioti. Sono ibridi, hanno aspetti tipici dei procarioti ma anche aspetti tipici degli eucarioti. Ad esempio, sono unicellulari come i procarioti, hanno i plasmidi come i procarioti, hanno un DNA circolare come i procarioti, ma hanno gli istoni nel DNA, cosa che i batteri non hanno ed è una cosa proprio tipica degli eucarioti. Questi organismi sono prevalentemente ambientali, non ci sono archea che interessano la patologia umana, non toccano l’uomo e vivono in ambienti estremi e si dice che gli archea siano estremofili (è una strategia evolutiva per sopravvivere e sostanzialmente per non avere concorrenza con altri microrganismi). Gli archea vivono per esempio nelle acque anche molto calde, acque termali, geyser (anche quindi intorno ai 100°C), o anche in acque particolarmente salate. Quindi gli archea sono ipertermofili (apprezzano le alte temperature) e alofili (amano il sale). Ciò significa che hanno anche delle configurazioni biologiche particolari, perché avere delle proteine che resistono a 100°C è molto affascinante.

Miceti e altri organismi

3. I miceti microscopici, ovvero i funghi. Tra i miceti microscopici sono presenti: muffe e lieviti. I miceti microscopici si presentano o in forma allungata (muffe) oppure a corpo tondeggiante (lieviti). Hanno una grande importanza per alcuni aspetti legati alla produzione di cibo e soprattutto in ambito clinico (causano il mughetto, le infezioni alle unghie, nel cuoio capelluto…). Esempi di muffe ne abbiamo ad esempio anche quelle che crescono sugli alimenti. Per quanto riguarda i lieviti, il Saccharomyces cerevisiae, è il lievito che usiamo per la pizza (lievito animale). I miceti ci interessano per la patologia, per gli aspetti dannosi che essi hanno. Uno dei principali miceti, importante per l’uomo è il genere Candida (Candida albicans, ma meritano una segnalazione anche Candida tropicalis, Candida Krusei, Candida guilliermondi, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea e Candida glabrata) che fanno parte della popolazione batterica normale ma possono comunque diventare germi opportunisti, ossia causare problemi nell’ospite. La candida è un lievito. Ci sono quindi diverse patologie causate dai miceti, ad esempio tra le dita dei piedi (dermatofiti), il mughetto (candida) e onicomicosi.

4. Le alghe, organismi eucarioti.

5. I protozoi, importanti per i cicli di replicazione. Sono affascinanti soprattutto per le forme che assumono, per i cicli di replicazione che hanno (prevedono un ospite intermedio – esempio zanzara) molto complessi. Tra i quali:

• Ameba (Entamoeba histolytica)
• Trypanosoma (T. Cruzi malattia di Chagas, T. Gambiense e T. Rhodesiense malattia del sonno)
• Leishmania, Trichomonas (T. Vaginalis e T. Intestinalis)
• Plasmodium falciparum (agente della malaria), Toxoplasma gondii

Virus

6. I virus, forse i più recenti ad essere studiati:

• Ortomixovirus, a questa famiglia appartiene il virus dell’influenza. Ha un genoma a RNA segmentato (è un virus che muta tantissimo perché non ha un solo filamento di RNA).
• HIV (retrovirus) è un virus che retro-trascrive (non si riesce ad avere un vaccino), ha una trascrittasi inversa, enzima che retro trascrive DNA a partire da RNA, cosa mai vista perché la cellula ha DNA nel nucleo e trascrive l’RNA, RNA messaggero che poi viene tradotto in proteine e nessuna delle nostre cellule a partire da un filamento di RNA creare il DNA. Tale virus quando ci infetta non se ne va più, non c’è ancora una cura ma si può rallentare.
• Rhinovirus, virus del raffreddore.
• Virus del vaiolo (Poxvirus), uno dei virus più grandi. Le campagne vaccinali sono state così efficaci che dal 1979 il virus non circola più è stato eliminato dalla faccia della Terra. E. Jenner ha avuto per primo l’idea del vaccino. Virus a DNA che oggi però non esiste più grazie a una importante campagna vaccinale, si dice che la “Terra è vaiolo free”. È il primo caso in cui ci sono state delle vaccinazioni. Jenner aveva visto che le persone che stavano a contatto con i bovini che avevano il vaiolo bovino, se si infettavano con il vaiolo umano avevano una malattia molto più lieve perché erano già stati a contatto con un virus simile della vacca, da cui ha preso proprio il termine vaccino, vaccinare. Quindi è stata l’idea di Jenner di inoculare il virus vaccino (della vacca) alle persone per allertare il sistema immunitario a un virus molto molto più aggressivo.

La microbiologia e i suoi ambiti di applicazione

La microbiologia è una disciplina molto vasta ed esercita una enorme influenza sugli altri campi della biologia. Ha settori di impiego in diversi ambiti: in ambito agricolo, in ambito alimentare (sia per la conservazione del cibo sia per la formazione di cibi fermentati), in ambito medico (cura e farmaci), in ambito ambientale (ricerca di biocarburanti, estrazione di minerali) e nel settore delle biotecnologie.

Appunti presi io: la microbiologia studia gli organismi invisibili ad occhio nudo, cioè quelli che sono più piccoli di 0,1 mm. Le dimensioni della microbiologia sono molto, molto piccole e se partiamo dal batterio che è il primo gruppo di microorganismi che vediamo, il batterio è una cellula procariotica e viene misurato in micron (μm), un cocco è più o meno 0.5/0.8 μm di diametro, un bastoncino invece 1/1.2 μm, qualche spirocheta è più lungo ma siamo lì. Il micron è la millesima parte del millimetro (1 μm = 1/1000 mm). Tuttavia, per vederli utilizziamo il microscopio ottico. Ancora più piccoli sono i virus, che si misurano in nanometri (nm) e il nanometro è la millesima parte del micron (1 nm = 1/1000 μm). Il virus più piccolo è il Picornavirus, un virus a RNA, 26/27 nm e il più grande è ad esempio il virus del vaiolo (Poxvirus) che misura circa 250 nm. Questi virus non si vedono con il microscopio ottico ma invece vanno visti con tecniche di microscopia elettronica. La microbiologia include anche cellule eucariotiche che sono molto più grandi (10/100 μm), e le cellule eucariotiche sono molte, a partire dai miceti.

Settori della microbiologia

• Virologia = che studia i virus
• Batteriologia
• Micologia = studia i miceti
• Ficologia = studia le alghe
• Protozoologia = studia i protozoi
• Poi tutti gli ambiti in cui la microbiologia vede applicazione non soltanto medica.

Cenni storici

Antony van Leeuwenhoek

Antony van Leeuwenhoek è considerato uno dei primi microbiologi. Viaggiando ha trovato lenti particolari che gli hanno permesso di costruire uno dei primi microscopi. È il primo che ha osservato gli invisibili e ha scoperto gli “animacules”, ma non li associò a nessun tipo di malattia. Si era costruito una sorta di microscopio e disegnava ciò che vedeva, quindi abbiamo questi disegni di corpi che lui chiama “animalcules” = animaletti, cioè qualcosa di invisibile ma non li ha associati a nulla. (questi microrganismi che sono stati visti certamente non erano batteri sarà stato qualche fungo, ma lui gli ha osservati ma non li ha assolutamente associati a nulla, ma è stato così per secoli basta pensare alla teoria della generazione spontanea, si credeva che la vita nascesse dalla non vita.

Louis Pasteur

Le persone più significative in questo percorso di nascita della microbiologia sono state sicuramente Pasteur e Koch perché effettivamente hanno lavorato diversamente, ragionavano diversamente).

Louis Pasteur è considerato il fondatore della microbiologia moderna. Dovette lottare per confutare le teorie radicate della generazione spontanea, che prevedevano che la vita nascesse dalla non vita. Con esperimenti rigorosi, portò avanti la teoria generale dei germi patogeni, contrapponendosi alle teorie della generazione spontanea. È uno dei primi che ha associato un gene a una malattia. Portò avanti studi sulla fermentazione della birra, del vino e dell’aceto, sulla pastorizzazione del latte, sul colera dei polli (per questo è considerato il fondatore della moderna immunologia), sul carbonchio di bovini, ovini, equini (e prevenzione). È considerato il fondatore della moderna microbiologia, è colui che scientificamente confuta la teoria della generazione spontanea, lui chiarisce, attraverso l’esperimento dei palloni, se un brodo imputridisce non è perché a caso lì dentro nascono microrganismi ma imputridisce perché i microrganismi già presenti hanno modo di lavorare e decomporre il brodo. Confuta la teoria della generazione spontanea, “la vita non può nascere dalla non vita”, a partire dal batterio fino ad arrivare all’uomo. Elabora anche la teoria generale dei germi patogeni e quindi capisce che questi microrganismi sono responsabili di un danno, una patologia (patos). Compie poi studi sulla fermentazione della birra, del vino e dell’aceto, ipotizza la pastorizzazione del latte, studia il colera dei polli, il carbonchio, associa una malattia a un microrganismo, studia la rabbia e come prevenirla, insomma lavora sulla microbiologia clinica.

Robert Koch

Robert Koch è considerato il padre della medicina, ricevette il premio Nobel per la medicina nel 1905. Scoprì l’agente eziologico, ovvero l’agente causativo della TBC (bacillo di Koch). L’agente eziologico scoperto era un micobatterio. Introdusse quindi il concetto di agente eziologico e formulò dei postulati conosciuti come i postulati di Koch. Egli lavorò con il bacillo anthracis, che agisce prevalentemente sugli animali, ma può anche infettare l’uomo. Egli prese un topo malato di carbonchio (agente anthracis). E affermò che:

• L’agente casuale deve essere presente in tutti i casi della malattia di cui è ritenuto responsabile e deve essere invece assente negli individui sani.
• L’agente casuale deve essere isolato dall’individuo infetto e, posto in coltura, deve dare origine ad una popolazione cellulare omogenea (una sola specie).
• L’inoculo di una coltura pura dell’agente casuale in individui sani deve dare luogo alla comparsa della malattia di cui si ritiene responsabile.
• L’agente casuale deve essere re-isolato dall’individuo infettato sperimentalmente.

Egli tuttavia non ha ipotizzato che:

• Non è detto che un quadro clinico sia sostenuto da un solo agente eziologico.
• Non tutti i microorganismi sono isolabili in questo modo.
• Vige l’ipotesi del portatore sano (persone sane ma che sono portatori dell’agente patogeno, non hanno segni clinici).

Classificazione degli esseri viventi

Tutti gli esseri viventi sono classificati in tre domini: Eubacteria, Archea ed Eucarya. Gli ultimi due domini includono gli organismi procarioti, mentre il primo dominio include gli eucarioti. Nell’ambito della stessa specie possono esistere ceppi o stipiti diversi, anche molto, tra loro. Un ceppo è un individuo batterico, è un singolo batterio. I ceppi si possono distinguere per la produzione di una tossina (alcuni ceppi batterici la producono altri no). Una specie batterica è anche studiata in relazione alla sensibilità di un farmaco. Alcuni ceppi batterici sensibili ad un farmaco sono inibiti da esso, mentre altri ceppi batterici che non sono inibiti dal farmaco e che quindi non ne risultano sensibili si dicono resistenti.

Appunti in più: Robert Koch (1843-1910) ottenne il premio Nobel per la medicina nel 1905, rimane famoso soprattutto perché identifica dei microrganismi molto particolari che sono i micobatteri che in suo onore prendono il nome di bacillo di Koch. I micobatteri causano la TBC, la tubercolosi. Un altro micobatterio è il mycobacterium leprae che causa la lebbra. I micobatteri sono batteri e con questo prefisso mico- assomigliano ai miceti solo perché hanno quest’aspetto allungato. I micobatteri sono particolarissimi perché hanno dei rivestimenti, una parete molto cerosa, il che vuol dire una crescita molto lenta di questi microrganismi, una sonnolenza durante la loro vita e un’enorme difficoltà per il trattamento con i farmaci, perché è difficilissimo che i farmaci riescano a penetrare questi rivestimenti molto cerosi (acidi grassi a 60/80 atomi di carbonio). Questi micobatteri si replicano in molto tempo, devono stare in coltura molto tempo, a differenza di batteri che ad esempio, l’escherichia coli in 50 minuti si raddoppia, quindi tali micobatteri ci mettono molto a crescere, sono difficili da trattare, malattie lunghe e lunghi trattamenti. È lui che introduce il concetto di eziologia e di agente eziologico (= agente causativo, causale). Inoltre formula i “postulati di Koch”.

I postulati di Koch sono formulati nel 1876, studiando il bacillus anthracis, che causa il carbonchio negli animali. I micobatteri causano un danno:

1. L’agente causale (microrganismo patogeno) deve essere presente in tutti i casi della malattia di cui è ritenuto responsabile e deve essere invece assente negli individui sani.
2. L’agente causale deve essere isolato dall’individuo infetto e, posto in coltura, deve dare origine ad una popolazione cellulare omogenea (una sola specie).
3. Se prendo questo microrganismo che ho tirato fuori dal topo malato e lo rimetto in un topo sano, devo produrre la stessa malattia che aveva il primo topo malato (l’inoculo di una coltura pura dell’agente causale in individui sani deve dare luogo alla comparsa della malattia di cui si ritiene responsabile).
4. L’agente causale deve essere re-isolato dall’individuo infettato sperimentalmente.

Questi postulati sono veri ma ci sono stati comunque degli aspetti che non ha potuto ipotizzare:

• Il fatto che una malattia sia sempre mono microbica (l’agente eziologico di un quadro clinico che osserviamo sia solo uno), malattia poli microbica può essere ad esempio una cistite (spesso c’è il solito microrganismo l’escherichia coli e poi un altro microorganismo).
• Concetto di germe opportunista = germe opportunista è quel germe (batterio) che fa già parte dell’ospite, normalmente non causano danno ma in alcune condizioni, invece, possono causare danno.
• Concetto di portatore sano = ci sono portatori sani di patogeni e chi ce li ha, ha una vita normalissima, li porta al 99% nel naso, nelle narici anteriori in modo che dal naso vadano in giro molto facilmente. E quindi il portatore ha un equilibrio molto particolare tra germe-patogeno ma il germe è già presente nel naso.

Tutti gli esseri viventi sono stati classificati in base a sequenziamenti e a confronto di sequenze di geni molto conservati. Ci sono tre principali domini: tra cui due sono principalmente i procarioti e uno di eucarioti. Nell’ambito dei domini, per tutti gli esseri viventi, avviene una classificazione sempre più fine fino ad arrivare al genere e alla specie (NOMENCLATURA BINOMIALE DI LINNEO).

Genere: Escherichia, Staphylococcus

Specie: Escherichia coli, Staphylococcus aureus

Nell’ambito della stessa specie possono esistere ceppi (= popolazione batterica omogenea che deriva da un singolo isolamento) o stipiti diversi, anche molto, tra loro. Per esempio per la produzione di una tossina (Corynebacterium diphtheriae che è l’agente eziologico della difterite, ciò significa che possono causare la difterite solo quei ceppi che possiedono una tossina responsabile della difterite. Altri ceppi che però non contendono quella determinata tossina non potranno causare la difterite). Questa differenza tra ceppi e ceppi è importante (virulenza) e anche per la sensibilità ad un farmaco perché nell’ambito di una stessa specie non tutti i ceppi sono ugualmente sensibili al farmaco.

Distribuzione di un campione di ceppi di Escherichia coli che sono stati messi a contatto con l'antibiotico ampicillina. Nell'asse delle ascisse è riportata la concentrazione dell'antibiotico, nell'asse delle ordinate la frequenza percentuale di ceppi sensibili. FARMACO RESISTENZA molto importante.

Le colorazioni batteriche usate per la microscopia ottica

Le colorazioni batteriche sono usate molto e permettono di differenziare i batteri. Le colorazioni batteriche si usano per:

• Dare contrasto ai microorganismi. Grazie alle colorazioni batteriche è possibile differenziare i diversi tipi morfologici (la forma del batterio ha valore tassonomico).
• Osservare la forma, la struttura e l’organizzazione dei batteri.
• Evidenziare alcune strutture (flagelli, capsule, endospore).

Si usano coloranti basici e coloranti acidi. I coloranti basici sono carichi positivamente, hanno affinità per le strutture acide della cellula (superficie cellulare, proteine, acidi nucleici). Alcuni esempi sono il blu di metilene, la fucsina basica, il cristalvioletto. I coloranti acidi sono carichi negativamente, hanno affinità per le strutture basiche della cellula.