Microbiologia dei probiotici

Microbiologia dei probiotici

venerdì 25 maggio 2018 16:02

Microbiologia dei probiotici

Il microbioma umano è la collezione di tutti i microrganismi viventi in associazione con il corpo

umano, a cui appartengono eucarioti, archea, batteri e virus. Le comunità microbiche ospite-

associate spesso sembrano suddividersi in base a tratti funzionali unici per ciascuna nicchia: per

esempio nella cavità orale avviene la produzione di composti volatili a partire da spermidina e

putrescina con l’ottenimento di energia dalla degradazione di aminoacidi e zuccheri semplici; nella

pelle avviene il rilascio di composti antimicrobici e odore dalla trasformazione i steroidi in sudore;

nell’intestino avviene la fermentazione e la degradazione di polisaccaridi, immuno-stimolazione e

produzione di acidi grassi a corta catena e nutrienti; nella vagina il mantenimento del pH dipende

dalla produzione di acido lattico da glicogeno e produzione di perossido di H, sintesi di batteriocine,

produzione di ammine odorifere. Oltre alle attività microbiche nicchia specifiche esistono altre vie

microbiche presenti nei vari siti del corpo non tipiche dei meta genomi microbici non ospite-associati

come la biosintesi di AA essenziali per l’ospite, di cofattori e lipidi, sintesi di immunostimolanti.

Per Simbiosi si intendono le varie interazioni biologiche di diversi microrganismi che vivono insieme

e che possono essere:

● mutualismo, interazione che comporta benefici per tutti i microrganismi coinvolti;

● commensalismo, interazione che beneficia un solo microrganismo;

● parassitismo, in cui il parassita beneficia a spese del parassitato.

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E’ stimato che un corpo adulto contenga circa 10 microbi, con più di 1000 geni microbici presenti

nel genoma umano. I microrganismi sono responsabili di una grande quantità di reazioni

metaboliche che non sono codificate nel genoma umano ma sono necessarie per la salute umana.

Quando parliamo di genoma umano dovremmo perciò pensare ad esso come ad un insieme di geni

umani e microbici.

Studi metagenomici

Gli consistono appunto nello studio del microbioma radunando DNA e

sequenziandoli.

In base all’approccio applicato otterremo diverse informazioni:

➔ ricaviamo il microbiota dalle indagini sul 16S rRNA così da identificare tassonomicamente i

microrganismi nell’ambiente;

➔ il metagenoma ovvero geni e genomi del microbiota, inclusi i plasmidi, mettendo in luce il

potenziale genetico della popolazione;

➔ il microbioma, ovvero geni e genomi del microbiota così come i prodotti del microbiota e

l’ambiente dell’ospite.

metagenomica

La (al di là del genoma) permette di avere informazioni riguardo le comunità

microbiche presenti in un habitat senza coltivarle: mentre la genomica analizza il DNA genomico da

un singolo organismo o cellula, la metagenomica è l’analisi del DNA genomico da una intera

comunità.

Possono quindi essere effettuate due analisi con due diversi obiettivi:

→

1. Studi su una sola specifica regione target in cui singoli geni bersaglio (generalmente il

singolo gene target selezionato è il 16S rRNA) vengono amplificati usando la reazione a

catena della polimerasi (PCR) e poi i prodotti sono sequenziati provvedendo ad un’analisi

dei geni ortologhi (di diverse specie ma che codificano proteine simili) o paraloghi (geni

del genoma che codificano per prodotti diversi) per quel gene entro una data comunità.

→

2. Sequenziamento shotgun di tutti i geni estratti da una comunità in cui viene isolato

totalmente il DNA da un campione e poi sequenziato con il risultato di un profilo di tutti i

geni nella comunità.

Dagli studi effettuati per esaminare la composizione del normale microbiota di un adulto sano, è

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Dagli studi effettuati per esaminare la composizione del normale microbiota di un adulto sano, è

stato riscontrato come il tratto gastrointestinale, pelle, cavità orale, tratto urogenitale, cavità nasale

hanno comunità microbiche uniche, sulla cui composizione non hanno effetto razza, peso ed età;

inoltre nessun genere è universalmente presente su tutti gli habitat corporei e su tutti gli individui,

anche se ciascun habitat corporeo in quasi ogni soggetto è caratterizzato da uno o alcuni generi

(colon proteo batteri, stomaco attino batteri e firmicutes ecc.).

La variabilità inter-individuale anche tra individui strettamente correlati preclude l’esistenza di un

significativo “core microbiome” in termini di specie microbiche. Anche se gli stessi pochi phyla sono

tipicamente presenti in ciascun sito del corpo umano, la loro relativa abbondanza può variare di 10

volte o più tra gli individui. Il nucleo del microbioma umano consiste di famiglie di geni e di vie

metaboliche comuni piuttosto che di singoli microrganismi comuni.

tratto gastrointestinale,

L’organo maggiormente colonizzato è il caratterizzato da un’enorme

superficie e ricco in nutrienti per i microrganismi. Il solo colon si stima contenga più del 70% di tutti i

microbi del corpo umano. I principali phyla sono i Firmicutes (classi Bacilli e Clostridi), Bacteroidetes

(classe Bacteroidetes), Actinobacteria (classe Bifidobacterium). L’ecosistema intestinale è molto

dinamico: alcuni microrganismi sono residenti e quindi autoctoni, altri sono alloctoni e provengono

da cibo, acqua e vari componenti del nostro ambiente. Le popolazioni possono avere un impatto

significativo sulla salute dell’ospite attraverso immunomodulazione, sviluppo intestinale, protezione

da patogeni e fermentazione substrati dalla dieta.

Diverse nicchie microbiche in base alla regione gastrointestinale considerata:

★ esofago: il normale microbiota dell'esofago è relativamente semplice nella composizione, con

microrganismi predominanti quali anaerobi facoltativi che derivano dalla cavità orale

(streptococchi e lattobacilli)

★ stomaco: il tempo breve di residenza e l’acidità del contenuto gastrico sono i fattori che fanno

dello stomaco una barriera che non permette il raggiungimento della parte distale del sistema

gastrointestinale e determinano una ristretta colonizzazione microbica. La comunità

predominante consiste nei Firmicutes e Actinobacteria.

★ intestino tenue: il rapido scorrimento del materiale attraverso l’intestino tenue previene una

colonizzazione microbica permanente; il numero di batteri aumenta progressivamente lungo

l’intestino con il diminuire del potenziale redox: infatti la maggioranza dei m.o. sono anaerobi

obbligati e vengono inattivati da O2. Solo a livello dell’ileo/ceco si raggiunge una significativa

popolazione di batteri. Nel duodeno l’acido gastrico è neutralizzato e gli acidi biliari aumento la

driving force della modulazione del microbiota nell’intestino tenue. I polisaccaridi sono stati

digeriti in mono e disaccaridi che contribuiscono alla crescita dei Proteobatteri, Firmicutes e

Lattobacilli. Diversità e carica batterica bassa.

★ intestino crasso: è il sito con il maggior numero di batteri e la più grande diversità: colonizzato

da batteri anaerobi obbligati, spesso non-sporigeni, 54-75% gram+. Nel colon il microbiota

occupa diversi micro-habitat come biofilm associati alla mucosa, allo strato di muco che copre

il colon o alla superficie dei residui digestivi presenti nel lume intestinale, con una carica

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batterica di 10 batteri/g. I polisaccaridi indigeribili promuovono la crescita di Batteroidi e

Firmicutes.

Oltre all'eterogeneità longitudinale, c’è una grande variabilità latitudinale nella composizione del

microbiota. L’epitelio intestinale è separato dal lume da una complessa mucosa, con microbiota

diversi tra i due spazi: molte specie batteriche presenti nel lume intestinale non hanno accesso allo

strato di muco e all’epitelio. La diversità microbica nell’intestino è il risultato della coevoluzione tra

comunità microbiche e i loro ospiti e quindi deriva dalla selezione naturale che opera a due livelli:

1. Top-Down avviene a livello dell’ospite e favorisce una comunità microbica stabile con un

alto livello di sovrabbondanza funzionale. Il risultato è una comunità microbica composta

da diverse divisioni, con genomi contenenti geni che codificano per proteine con funzioni

omologhe. La sovrabbondanza funzionale evita la presenza di specie chiave (con ruolo

centrale nel sistema e la cui perdita causa un drammatico cambiamento nei processi e

nella diversità).

2. Per Bottom-Up si intende la pressione di selezione, dovuta alla competizione microbica,

che guida le cellule microbiche con tratti distintivi dal punto di vista funzionale dei geni

(tratti metabolici) che diventano funzionalmente specializzati.

diversità microbica

Le forze che modellano la nell’intestino umano sono:

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diversità microbica

Le forze che modellano la nell’intestino umano sono:

■ l’ambiente chimico poiché l’intestino offre meno nicchie chimiche rispetto ad altri habitat ed

è grazie all’ambiente chimico che i m.o. possono ottenere energia dal trasferimento di

elettroni dal carbonio organico:

○ al carbonio organico nel caso della fermentazione;

○ al carbonio inorganico nel caso della metanogenesi;

○ al solfato per la riduzione del solfato.

Inoltre la riduzione del numero di nicchie può derivare dalle peristalsi.

■ la modificazione del genoma consiste nell’acquisizione di un gene da trasferimento laterale

di gene che è stato recentemente dimostrato essere indotto dall’interazione tra il cibo e il

microbiota intestinale.

La crescita di batteri dipende da

➢ fattori dell’ospite genetici, dietetici, malattie;

➢ fattori ambientali come il tipo di substrato disponibile, pH e potenziale redox;

➢ fattori batterici come la capacità di adesione, enzimi, capacità metabolica e interazioni

microbiche.

Il Ruolo del microbiota nell’intestino comprende diverse funzioni:

❏ funzioni metaboliche (fermentazione di substrati disponibili), la principale è collegata alla

fermentazione di carboidrati indigesti con produzione di acidi grassi a corta catena e gas;

❏ funzioni trofiche (acidi grassi a corta catena stimolano in vivo la proliferazione e

differenziazione di cellule epiteliali nel tenue e crasso e la stabilità del sistema immunitario);

❏ funzioni protettive (prevenzione da colonizzazione intestinale di patogeni);

❏ I batteri intestinali hanno un ruolo anche nella sintesi di vit B e K, metabolismo di acidi biliari e

colesterolo, metabolismo di tossine e sostanze carcinogene nella dieta.

Lo stomaco e l’intestino tenue sono responsabili della digestione e assorbimento della maggior parte

dei nutrienti mentre il crasso ha limitate capacità digestive.

colon

I carboidrati non digeriti che arrivano al giornalmente sono 10-60 g più 2-3 g di carboidrati

endogeni. Nel colon i m.o. fermentano amido resistente, zuccheri non assorbiti, polisaccaridi

cellulosici e non, mucine negli acidi grassi a corta catena e gas (CO2, CH4 e H2).

L’amido resistente è quella frazione di amido che non viene idrolizzato da parte di enzimi nel tenue.

Può essere fermentato completamente o parzialmente nel colon e rappresenta circa il 10%

dell’amido assunto con la dieta occidentale. L’amido resistente è composto per il 100% da amilosio,

la frazione lineare dell’amido, che risulta più difficilmente attaccabile dagli enzimi digestivi.

Metabolismo del microbiota intestinale I microrganismi nell’ intestino possono ricavare energia da

diverse vie metaboliche:

➔ fermentazione è la via di produzione di energia dominante per il microbiota;

➔ metanogenesi (Archea) o acetogenesi (batteri);

➔ respirazione anaerobia riduzione di solfato con produzione di S o H2S.

La fermentazione di fibre produce acidi grassi a corta catena ma anche CO2 e H2. L’H prodotto viene

eliminato attraverso 3 vie: flatulenza, assorbimento nel sistema circolatorio ed escrezione

respiratoria, metabolismo del microbiota del colon.

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Per quanto riguarda la fermentazione diversi substrati subiscono una diversa fermentazione con

→

diversi prodotti finali. (Carboidrati acidi grassi a corta catena, acetato, propionato e butirrato;

→

Proteine differenti metaboliti di cui alcuni tossici, ammoniaca, ammine, acidi organici, composti

solforati, composti fenolici e indolici).

L’attività saccarolitica è di grande importanza nel crasso in quanto la maggior parte dei m.o. sono

saccarolitici. Nella dieta i carboidrati digeribili sono amidi e zuccheri, quelli non digeribili fibre, amidi

resistenti e oligosaccaridi. La maggior parte degli zuccheri semplici sono assorbiti nel tenue, ma la

mancanza di enzimi che scindano i carboidrati non digeribili fa in modo che non vengano assorbiti,

ma fermentati nel colon dal microbiota anaerobio con produzione principalmente di acidi grassi a

corta catena.

Le principali specie saccarolitiche appartengono ai Bacteroides, Bifidobatteri, Ruminococcus,

Lactobacillus e Clostridium. I batteri saccarolitici sono altamente adattati per la crescita in presenza

di carboidrati complessi attraverso la loro capacità di produrre una varietà di polidrolasi e glicosidasi.

In molti casi l’acetato è il più abbondante acido grasso a corta catena seguito da propionato e

butirrato. In particolare Firmicutes producono prevalentemente butirrato mentre Bacteroidetes

acetato e propionato.

La fermentazione avviene nel colon prossimale soprattutto e nel crasso circa il 95% degli acidi grassi

a corta catena prodotti vengono rapidamente assorbiti dai colonociti mentre il 5% viene escreto con

le feci.

Anche nel metabolismo delle proteine vengono prodotti acidi a corta catena (acetato poi butirrato e

propionato ed una varietà di acidi grassi a corta catena ramificati). Dalla dieta infatti al colon

giungono 3-9g al giorno di proteine esogene e 4-6g endogene.

La fermentazione proteica avviene nella regione distale del colon dove le fonti di carboidrati sono

esaurite e il pH è prossimo alla neutralità. I batteri proteolitici dominanti nel colon sono Bacteroides

→ possiedono un’attività delle peptidasi molto forte e predominano a pH 6,5 e Clostridium.

La degradazione di proteine e AA è accompagnata da metaboliti potenzialmente tossici come

ammine, composti fenolici e composti solforati volatili. La principale via del metabolismo proteico

nel colon è la deamminazione che porta alla produzione di acidi a corta catena e ammoniaca, ma

anche acidi grassi a catena ramificata come isobutirrato e 2-metilbutirrato. Questi acidi grassi a

catena ramificata sono prodotti prevalentemente da AA ramificati quali valina, isoleucina e leucina e

sono spesso usati come marker fecali della fermentazione proteica.

La deaminazione di AA aromatici porta a composti fenolici; i batteri coinvolti sono Clostridium,

Bacteroidetes, Enterobacter, Bifidobacterium, Lactobacillus.

La decarbossilazione di AA e peptidi porta alla formazione di una larga varietà di amine. I batteri

coinvolti sono della classe Clostridia.

Molti composti rilasciati dalla fermentazione delle proteine sono considerati citotossici e vengono

rilasciate sostanze mutagene con danneggiamento dell'epitelio intestinale.

Gli Acidi grassi a corta catena sono rapidamente assorbiti dalla mucosa intestinale e nel colon

prossimale per diffusione passiva. Acetato, propionato, butirrato sono ossidati dalle cellule mucosali

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prossimale per diffusione passiva. Acetato, propionato, butirrato sono ossidati dalle cellule mucosali

per ottenere energia:

⇒ il butirrato è la principale fonte di energia per le cellule epiteliali, contribuisce a regolare

l’espressione genica dell’ospite, gioca un ruolo chiave nell’infiammazione ed è coinvolto nella

differenziazione delle cellule nell’intestino;

⇒ l’acetato viene usato dai muscoli periferici e per la sintesi di acidi grassi o colesterolo nel

fegato;

⇒ il propionato arriva al fegato. L'acetato e il propionato modulano il metabolismo del glucosio

poiché il loro assorbimento induce una risposta glicemica più bassa post prandiale.

Il microbiota intestinale svolge funzione protettiva nella prevenzione dell’adesione e penetrazione

dei patogeni mediante esclusione competitiva (occupando i siti di adesione), consumo di nutrienti,

produzione di sostanze antimicrobiche e stimolo produzione dei vari composti antimicrobici.

Differenti studi dimostrano che la composizione del microbiota colonico può essere suddiviso in tre

sezioni:

A. l’intestino di un bambino ancora non nato è considerato sterile e la

Periodo neonatale:

colonizzazione batterica avviene durante la nascita per inoculazione da:

Microbiota materno:

1. il microbiota della prole è molto simile a quello della madre (è

stato visto che il microbiota di gemelli adulti mono e dizigoti erano simili a quelli

dell’altro gemello suggerendo che la colonizzazione del microbiota da una madre

condivisa è più importante nel determinare il loro microbiota da adulti); durante il parto

naturale il bambino è esposto alla complessa popolazione microbica del canale vaginale,

cosa che influisce sullo sviluppo del microbiota intestinale tanto che il microbiota

intestinale del bambino è simile a quello vaginale della madre. Nel primo trimestre di

gravidanza la diversità dei batteri vaginale cambia, specie abbondanti diventano rare e

viceversa. Una specie dominante nella vagina di una donna gravida è Lactobacillus

johnsonii, solitamente presente nell’intestino dove produce proteasi che degradano la

caseina in oligopeptidi. Durante il parto il bambino lo ingerirà e ne sarà coperto;

probabilmente questo inoculo prepara il neonato a digerire il latte materno.

Ambiente:

2. i bambini partoriti con parto cesareo hanno una differente composizione

microbica se comparata con q