Microbiologia dei probiotici

Microbiologia dei probiotici

Il microbioma umano

Il microbioma umano è la collezione di tutti i microrganismi viventi in associazione con il corpo umano, a cui appartengono eucarioti, archea, batteri e virus. Le comunità microbiche ospite-associate spesso sembrano suddividersi in base a tratti funzionali unici per ciascuna nicchia:

• Per esempio, nella cavità orale avviene la produzione di composti volatili a partire da spermidina e putrescina con l’ottenimento di energia dalla degradazione di aminoacidi e zuccheri semplici.
• Nella pelle avviene il rilascio di composti antimicrobici e odore dalla trasformazione di steroidi in sudore.
• Nell’intestino avviene la fermentazione e la degradazione di polisaccaridi, immuno-stimolazione e produzione di acidi grassi a corta catena e nutrienti.
• Nella vagina il mantenimento del pH dipende dalla produzione di acido lattico da glicogeno e produzione di perossido di H, sintesi di batteriocine, produzione di ammine odorifere.

Oltre alle attività microbiche nicchia-specifiche esistono altre vie microbiche presenti nei vari siti del corpo non tipiche dei meta genomi microbici non ospite-associati come la biosintesi di AA essenziali per l’ospite, di cofattori e lipidi, sintesi di immunostimolanti.

Simbiosi

Per simbiosi si intendono le varie interazioni biologiche di diversi microrganismi che vivono insieme e che possono essere:

• Mutualismo, interazione che comporta benefici per tutti i microrganismi coinvolti.
• Commensalismo, interazione che beneficia un solo microrganismo.
• Parassitismo, in cui il parassita beneficia a spese del parassitato.

È stimato che un corpo adulto contenga circa 10¹⁴ microbi, con più di 1000 geni microbici presenti nel genoma umano. I microrganismi sono responsabili di una grande quantità di reazioni metaboliche che non sono codificate nel genoma umano ma sono necessarie per la salute umana. Quando parliamo di genoma umano dovremmo perciò pensare ad esso come a un insieme di geni umani e microbici.

Studi metagenomici

Gli studi metagenomici consistono nello studio del microbioma radunando DNA e sequenziandoli. In base all’approccio applicato si ottengono diverse informazioni:

• Ricaviamo il microbiota dalle indagini sul 16S rRNA così da identificare tassonomicamente i microrganismi nell’ambiente.
• Il metagenoma, ovvero geni e genomi del microbiota, inclusi i plasmidi, mettendo in luce il potenziale genetico della popolazione.
• Il microbioma, ovvero geni e genomi del microbiota così come i prodotti del microbiota e l’ambiente dell’ospite.

La metagenomica (al di là del genoma) permette di avere informazioni riguardo le comunità microbiche presenti in un habitat senza coltivarle: mentre la genomica analizza il DNA genomico da un singolo organismo o cellula, la metagenomica è l’analisi del DNA genomico da un'intera comunità.

Analisi metagenomiche

Possono quindi essere effettuate due analisi con due diversi obiettivi:

• Studi su una sola specifica regione target in cui singoli geni bersaglio (generalmente il singolo gene target selezionato è il 16S rRNA) vengono amplificati usando la reazione a catena della polimerasi (PCR) e poi i prodotti sono sequenziati provvedendo a un’analisi dei geni ortologhi o paraloghi per quel gene entro una data comunità.
• Sequenziamento shotgun di tutti i geni estratti da una comunità in cui viene isolato totalmente il DNA da un campione e poi sequenziato con il risultato di un profilo di tutti i geni nella comunità.

Microbiota del corpo umano

Dagli studi effettuati per esaminare la composizione del normale microbiota di un adulto sano, è stato riscontrato come il tratto gastrointestinale, pelle, cavità orale, tratto urogenitale e cavità nasale abbiano comunità microbiche uniche, sulla cui composizione non hanno effetto razza, peso ed età. Inoltre, nessun genere è universalmente presente su tutti gli habitat corporei e su tutti gli individui, anche se ciascun habitat corporeo in quasi ogni soggetto è caratterizzato da uno o alcuni generi (colon proteo batteri, stomaco attino batteri e firmicutes ecc.).

La variabilità inter-individuale anche tra individui strettamente correlati preclude l’esistenza di un significativo “core microbiome” in termini di specie microbiche. Anche se gli stessi pochi phyla sono tipicamente presenti in ciascun sito del corpo umano, la loro relativa abbondanza può variare di 10 volte o più tra gli individui. Il nucleo del microbioma umano consiste di famiglie di geni e di vie metaboliche comuni piuttosto che di singoli microrganismi comuni.

L'ecosistema intestinale

L’organo maggiormente colonizzato è il tratto gastrointestinale, caratterizzato da un’enorme superficie e ricco in nutrienti per i microrganismi. Il solo colon si stima contenga più del 70% di tutti i microbi del corpo umano. I principali phyla sono i Firmicutes (classi Bacilli e Clostridi), Bacteroidetes (classe Bacteroidetes), Actinobacteria (classe Bifidobacterium). L’ecosistema intestinale è molto dinamico: alcuni microrganismi sono residenti e quindi autoctoni, altri sono alloctoni e provengono da cibo, acqua e vari componenti del nostro ambiente. Le popolazioni possono avere un impatto significativo sulla salute dell’ospite attraverso immunomodulazione, sviluppo intestinale, protezione da patogeni e fermentazione substrati dalla dieta.

Diverse nicchie microbiche

• Esofago: Il normale microbiota dell'esofago è relativamente semplice nella composizione, con microrganismi predominanti quali anaerobi facoltativi che derivano dalla cavità orale (streptococchi e lattobacilli).
• Stomaco: Il tempo breve di residenza e l’acidità del contenuto gastrico sono i fattori che fanno dello stomaco una barriera che non permette il raggiungimento della parte distale del sistema gastrointestinale e determinano una ristretta colonizzazione microbica. La comunità predominante consiste nei Firmicutes e Actinobacteria.
• Intestino tenue: Il rapido scorrimento del materiale attraverso l’intestino tenue previene una colonizzazione microbica permanente; il numero di batteri aumenta progressivamente lungo l’intestino con il diminuire del potenziale redox: infatti la maggioranza dei m.o. sono anaerobi obbligati e vengono inattivati da O₂. Solo a livello dell’ileo/ceco si raggiunge una significativa popolazione di batteri. Nel duodeno l’acido gastrico è neutralizzato e gli acidi biliari aumentano la driving force della modulazione del microbiota nell’intestino tenue. I polisaccaridi sono stati digeriti in mono e disaccaridi che contribuiscono alla crescita dei Proteobatteri, Firmicutes e Lattobacilli. Diversità e carica batterica bassa.
• Intestino crasso: È il sito con il maggior numero di batteri e la più grande diversità: colonizzato da batteri anaerobi obbligati, spesso non-sporigeni, 54-75% gram+. Nel colon il microbiota occupa diversi micro-habitat come biofilm associati alla mucosa, allo strato di muco che copre il colon o alla superficie dei residui digestivi presenti nel lume intestinale, con una carica batterica di 10¹² batteri/g. I polisaccaridi indigeribili promuovono la crescita di Batteroidi e Firmicutes.

Variabilità microbica nell'intestino

Oltre all'eterogeneità longitudinale, c’è una grande variabilità latitudinale nella composizione del microbiota. L’epitelio intestinale è separato dal lume da una complessa mucosa, con microbiota diversi tra i due spazi: molte specie batteriche presenti nel lume intestinale non hanno accesso allo strato di muco e all’epitelio. La diversità microbica nell’intestino è il risultato della coevoluzione tra comunità microbiche e i loro ospiti e quindi deriva dalla selezione naturale che opera a due livelli:

• Top-Down avviene a livello dell’ospite e favorisce una comunità microbica stabile con un alto livello di sovrabbondanza funzionale. Il risultato è una comunità microbica composta da diverse divisioni, con genomi contenenti geni che codificano per proteine con funzioni omologhe. La sovrabbondanza funzionale evita la presenza di specie chiave (con ruolo centrale nel sistema e la cui perdita causa un drammatico cambiamento nei processi e nella diversità).
• Per Bottom-Up si intende la pressione di selezione, dovuta alla competizione microbica, che guida le cellule microbiche con tratti distintivi dal punto di vista funzionale dei geni (tratti metabolici) che diventano funzionalmente specializzati.

Le forze che modellano la diversità microbica

Le forze che modellano la diversità microbica nell’intestino umano sono:

• L’ambiente chimico poiché l’intestino offre meno nicchie chimiche rispetto ad altri habitat ed è grazie all’ambiente chimico che i m.o. possono ottenere energia dal trasferimento di elettroni dal carbonio organico:
  • Al carbonio organico nel caso della fermentazione;
  • Al carbonio inorganico nel caso della metanogenesi;
  • Al solfato per la riduzione del solfato. Inoltre la riduzione del numero di nicchie può derivare dalle peristalsi.
• La modificazione del genoma consiste nell’acquisizione di un gene da trasferimento laterale di gene che è stato recentemente dimostrato essere indotto dall’interazione tra il cibo e il microbiota intestinale.

Crescita dei batteri

La crescita di batteri dipende da:

• Fattori dell’ospite genetici, dietetici, malattie;
• Fattori ambientali come il tipo di substrato disponibile, pH e potenziale redox;
• Fattori batterici come la capacità di adesione, enzimi, capacità metabolica e interazioni microbiche.

Ruolo del microbiota nell'intestino

Il ruolo del microbiota nell’intestino comprende diverse funzioni:

• Funzioni metaboliche (fermentazione di substrati disponibili), la principale è collegata alla fermentazione di carboidrati indigesti con produzione di acidi grassi a corta catena e gas.
• Funzioni trofiche (acidi grassi a corta catena stimolano in vivo la proliferazione e differenziazione di cellule epiteliali nel tenue e crasso e la stabilità del sistema immunitario).
• Funzioni protettive (prevenzione da colonizzazione intestinale di patogeni).
• I batteri intestinali hanno un ruolo anche nella sintesi di vit B e K, metabolismo di acidi biliari e colesterolo, metabolismo di tossine e sostanze carcinogene nella dieta.

Lo stomaco e l’intestino tenue sono responsabili della digestione e assorbimento della maggior parte dei nutrienti mentre il crasso ha limitate capacità digestive. I carboidrati non digeriti che arrivano al colon giornalmente sono 10-60 g più 2-3 g di carboidrati endogeni. Nel colon i m.o. fermentano amido resistente, zuccheri non assorbiti, polisaccaridi cellulosici e non, mucine negli acidi grassi a corta catena e gas (CO₂, CH₄ e H₂).

Metabolismo del microbiota intestinale

L’amido resistente è quella frazione di amido che non viene idrolizzato da parte di enzimi nel tenue. Può essere fermentato completamente o parzialmente nel colon e rappresenta circa il 10% dell’amido assunto con la dieta occidentale. L’amido resistente è composto per il 100% da amilosio, la frazione lineare dell’amido, che risulta più difficilmente attaccabile dagli enzimi digestivi.

I microrganismi nell’intestino possono ricavare energia da diverse vie metaboliche:

• Fermentazione è la via di produzione di energia dominante per il microbiota.
• Metanogenesi (Archea) o acetogenesi (batteri).
• Respirazione anaerobia riduzione di solfato con produzione di S o H₂S.

La fermentazione di fibre produce acidi grassi a corta catena ma anche CO₂ e H₂. L’H prodotto viene eliminato attraverso 3 vie: flatulenza, assorbimento nel sistema circolatorio ed escrezione respiratoria, metabolismo del microbiota del colon.

Per quanto riguarda la fermentazione diversi substrati subiscono una diversa fermentazione con diversi prodotti finali: carboidrati acidi grassi a corta catena, acetato, propionato e butirrato; Proteine differenti metaboliti di cui alcuni tossici, ammoniaca, ammine, acidi organici, composti solforati, composti fenolici e indolici.

L’attività saccarolitica è di grande importanza nel crasso in quanto la maggior parte dei m.o. sono saccarolitici. Nella dieta i carboidrati digeribili sono amidi e zuccheri, quelli non digeribili fibre, amidi resistenti e oligosaccaridi. La maggior parte degli zuccheri semplici sono assorbiti nel tenue, ma la mancanza di enzimi che scindano i carboidrati non digeribili fa in modo che non vengano assorbiti, ma fermentati nel colon dal microbiota anaerobio con produzione principalmente di acidi grassi a corta catena.

Le principali specie saccarolitiche appartengono ai Bacteroides, Bifidobatteri, Ruminococcus, Lactobacillus e Clostridium. I batteri saccarolitici sono altamente adattati per la crescita in presenza di carboidrati complessi attraverso la loro capacità di produrre una varietà di polidrolasi e glicosidasi. In molti casi l’acetato è il più abbondante acido grasso a corta catena seguito da propionato e butirrato. In particolare Firmicutes producono prevalentemente butirrato mentre Bacteroidetes acetato e propionato.

La fermentazione avviene nel colon prossimale soprattutto e nel crasso circa il 95% degli acidi grassi a corta catena prodotti vengono rapidamente assorbiti dai colonociti mentre il 5% viene escreto con le feci.

Metabolismo delle proteine

Anche nel metabolismo delle proteine vengono prodotti acidi a corta catena (acetato poi butirrato e propionato ed una varietà di acidi grassi a corta catena ramificati). Dalla dieta infatti al colon giungono 3-9g al giorno di proteine esogene e 4-6g endogene.

La fermentazione proteica avviene nella regione distale del colon dove le fonti di carboidrati sono esaurite e il pH è prossimo alla neutralità. I batteri proteolitici dominanti nel colon sono Bacteroides che possiedono un’attività delle peptidasi molto forte e predominano a pH 6,5 e Clostridium.

La degradazione di proteine e AA è accompagnata da metaboliti potenzialmente tossici come ammine, composti fenolici e composti solforati volatili. La principale via del metabolismo proteico nel colon è la deaminazione che porta alla produzione di acidi a corta catena e ammoniaca, ma anche acidi grassi a catena ramificata come isobutirrato e 2-metilbutirrato. Questi acidi grassi a catena ramificata sono prodotti prevalentemente da AA ramificati quali valina, isoleucina e leucina e sono spesso usati come marker fecali della fermentazione proteica.

La deaminazione di AA aromatici porta a composti fenolici; i batteri coinvolti sono Clostridium, Bacteroidetes, Enterobacter, Bifidobacterium, Lactobacillus. La decarbossilazione di AA e peptidi porta alla formazione di una larga varietà di amine. I batteri coinvolti sono della classe Clostridia.

Molti composti rilasciati dalla fermentazione delle proteine sono considerati citotossici e vengono rilasciate sostanze mutagene con danneggiamento dell'epitelio intestinale.

Assorbimento degli acidi grassi

Gli acidi grassi a corta catena sono rapidamente assorbiti dalla mucosa intestinale e nel colon prossimale per diffusione passiva. Acetato, propionato, butirrato sono ossidati dalle cellule mucosali per ottenere energia:

• Il butirrato è la principale fonte di energia per le cellule epiteliali, contribuisce a regolare l’espressione genica dell’ospite, gioca un ruolo chiave nell’infiammazione ed è coinvolto nella differenziazione delle cellule nell’intestino.
• L’acetato viene usato dai muscoli periferici e per la sintesi di acidi grassi o colesterolo nel fegato.
• Il propionato arriva al fegato. L'acetato e il propionato modulano il metabolismo del glucosio poiché il loro assorbimento induce una risposta glicemica più bassa post prandiale.

Funzione protettiva del microbiota

Il microbiota intestinale svolge funzione protettiva nella prevenzione dell’adesione e penetrazione dei patogeni mediante esclusione competitiva (occupando i siti di adesione), consumo di nutrienti, produzione di sostanze antimicrobiche e stimolo produzione dei vari composti antimicrobici.

Composizione del microbiota colonico

Differenti studi dimostrano che la composizione del microbiota colonico può essere suddiviso in tre sezioni:

• Periodo neonatale: L’intestino di un bambino ancora non nato è considerato sterile e la colonizzazione batterica avviene durante la nascita per inoculazione da:
• Microbiota materno: Il microbiota della prole è molto simile a quello della madre (è stato visto che il microbiota di gemelli adulti mono e dizigoti erano simili a quelli dell’altro gemello, suggerendo che la colonizzazione del microbiota da una madre condivisa è più importante nel determinare il loro microbiota da adulti); durante il parto naturale il bambino è esposto alla complessa popolazione microbica del canale vaginale, cosa che influisce sullo sviluppo del microbiota intestinale tanto che il microbiota intestinale del bambino è simile a quello vaginale della madre. Nel primo trimestre di gravidanza la diversità dei batteri vaginale cambia, specie abbondanti diventano rare e viceversa. Una specie dominante nella vagina di una donna gravida è Lactobacillus johnsonii, solitamente presente nell’intestino dove produce proteasi che degradano la caseina in oligopeptidi. Durante il parto il bambino lo ingerirà e ne sarà coperto; probabilmente questo inoculo prepara il neonato a digerire il latte materno.
• Ambiente: I bambini partoriti con parto cesareo hanno una differente composizione microbica se comparata con quelli nati da parto naturale.