Microbiologia degli alimenti parte 2

Ceppi batterici e preparazione del terreno colturale

Il ceppo batterico è la popolazione omogenea che deriva da un singolo isolamento. Tra i diversi ceppi di una specie batterica vi possono essere delle differenze per quanto riguarda la letalità, le funzioni biochimiche o l’esistenza degli antigeni.

Preparazione del terreno colturale

Se gli ingredienti sono disidratati e il terreno è liquido, possono avvenire due tipi di sterilizzazione:

• Sterilizzazione mediante calore: si pesano i vari ingredienti (non termolabili e a C variabile), si sciolgono in acqua tramite agitazione e calore (agitatore magnetico/piastra riscaldante), che permette l’assoluta dissoluzione della polvere in acqua; dopo di ché avviene la sterilizzazione per distruggere del tutto i microrganismi all’interno e le spore. Una volta raffreddato si aggiungono i componenti termolabili (non aggiunti prima perché a 121° x 20 min verrebbero denaturati, enzimi/antibiotici) e la pressione della cisterna deve essere di 1 atm in modo da debellare del tutto le forme microbiche presenti nel mezzo colturale.
• Sterilizzazione mediante filtrazione: si usano delle siringhe piccole per far passare il liquido, appena passa nei filtri (diametro 0,22 µm se si vuole trattenere lieviti e batteri, 0,45 µm se si vuole trattenere solo i lieviti e non i batteri) trattenendo tutte le forme microbiche (lieviti e batteri).

Se il terreno è solido, possono avvenire:

• Sterilizzazione mediante calore: il procedimento è uguale a quello del terreno liquido, ma si aggiunge l’agar alla miscela pronta per renderlo solido; una volta idratato con l’acqua, il terreno viene sciolto con l’agitatore magnetico e si aggiunge l’agar sempre all’1,5% (ogni 100 ml di terreno si aggiunge 1,5 gr di agar), poi si sterilizza e, una volta raffreddato, si aggiungono le componenti termolabili, ma non si deve arrivare sotto i 56° perché l’agar solidifica. All’interno dell’autoclave viene sterilizzato ed è presente 1 atm per debellare del tutto i microrganismi del mezzo colturale. All’interno di esso viene messa l’acqua fino a coprire le resistenze per evitare che la macchina si bruci e quando il campione viene messo dentro per sterilizzarlo viene attaccato un pezzo di scotch, chiamato scotch indicatore, che prima era bianco e solo successivamente spuntano delle strisce nere, che indicano che il processo di sterilizzazione è andato bene e che il substrato può essere utilizzato. Se non spuntano le bande nere, significa che qualcosa è andato storto durante il processo e quindi si dovrà risterilizzare il terreno.
• Sterilizzazione mediante filtrazione: non si può filtrare con la siringa e il filtro il terreno con l’agar perché si otturerebbe, quindi si prepara il terreno con tutti i componenti che servono senza mettere l’agar; si scioglie, si filtra e a parte si fa una soluzione di agar che si sterilizza a parte col calore. Quando le due soluzioni si saranno raffreddate (intorno a 50-55°) si uniscono e si mettono nelle piastre.

I substrati si comprano già pronti nei barattoli, dove la miscela di nutrienti è scritta e di lato c'è scritto anche il modo di preparazione. In commercio vi sono substrati che sono:

• Agar medium: è già presente l’agar nel substrato;
• Broth medium: non è presente l’agar e si può utilizzare per ottenere i terreni liquidi.

Coltura pura

È una popolazione costituita da una singola specie microbica; viene anche definita coltura axenica, cioè costituita da una popolazione di cloni (solo un microrganismo), se invece vi sono altri microrganismi si parla di coltura contaminata, perché vi saranno due tipi diversi di microrganismi. Il metodo sicuro e fondamentale per ottenere le colture pure è la tecnica dello striscio di purificazione.

Per prima cosa, per ottenere la coltura pura, tutte le operazioni necessarie per attuare questa tecnica devono essere fatte in ambiente asettico (sotto K a flusso laminare o becco bunsen che permette di ottenere un cono di sterilità nell'aria attorno alla fiamma). Per fare lo striscio di purificazione si deve avere una brodocoltura e mediante l’uso di un’ansa (sterile o in ferro, ma si deve sterilizzare sopra la fiamma). Una volta caricato l’occhiello con la brodocoltura si fa uno striscio sulla piastra con l’obiettivo principale di ottenere delle colonie batteriche o fungine che siano separate dalle altre (coltura pura o axenica).

Si fa uno striscio fitto nella parte superiore della piastra per scaricare l'ansa, poi si fa una serie di strisci in continuo per scaricare tutta l'ansa e avere nella parte finale dello striscio delle colonie ben separate le une dalle altre, che se prelevate produrrà una popolazione di cloni. Questo è fondamentale nelle fasi di selezione, perché poi si fa sviluppare in brodo e si studiano. Il parafilm si usa per sigillare i microrganismi patogeni perché la piastra potrebbe aprirsi, ma se sono microrganismi protecnologici non è necessario.

La piastra viene messa in un’incubatrice a temperatura controllata e dopo che le colonie crescono si prelevano per separare la popolazione e vengono messe in brodocoltura/piastra/becco di clarino dipende dall’utilizzo.

Lo striscio si può fare in due modi:

• Striscio unico: con l’ansa si parte dalla parte superiore con lo striscio fitto e poi si va allargando verso la fine della piastra.
• 3,4 strisci continui: uno striscio nella parte alta della piastra, si ruota poi di 45° e si riparte dal punto interrotto, poi si ruota ancora di 45°, si riparte dal punto interrotto e si fa un altro striscio, ecc.

Nello studio del microrganismo si deve annotare tutto ciò che si fa, da quando entra in laboratorio (si tolgono i batteri dal campione) fino a quando si ottiene la coltura pura. Una volta fatto lo striscio si inizia a osservare la morfologia (puntiforme, circolare, filamentosa, …), lo spessore (piatto, rialzato, convesso, …) ed il margine (regolare, ondulato, lobato, …) della colonia. La crescita dei microrganismi in piastra è più rapida ai margini (bordi) e la parte vecchia (cellule morte) si trova nella parte centrale della colonia. Una colonia deriva da un’unità formante colonia (UFC o CFU), che è l’unità di misura delle colonie batteriche vitali.

Misurazione della crescita microbica

I metodi di conta si dividono in due e quelli più usati sono:

• Metodi diretti: che permettono di contare le cellule; quella più utilizzata per analizzare le matrici alimentari è:
  • Conta vitale
  • Conta totale che è un metodo di conta che si fa utilizzando delle camere al microscopio, però la conta totale non permette di distinguere tra cellule vitali e no
  • MPN: (most probable number) è una stima probabilistica che permette di andare a rilevare la C di microrganismi nelle matrici in cui sono presenti a basse C
  • Colonie su membrana filtrante: metodo che si utilizza per fare l’analisi delle acque o del ghiaccio sciolto
• Metodi indiretti: che permettono di misurare la massa cellulare, quindi sulla torbidità delle sospensioni cellulari (mezzo in cui si trovano i microrganismi); si fa l’analisi tramite misure spettrofotometriche (fascio di luce che attraversa la torbidità), maggiore sarà la crescita maggiore sarà la torbidità.

Conta vitale

Permette di determinare il numero di cellule di un campione in grado di formare colonie al di sopra del terreno agarizzato (metodo diretto). Il campione da analizzare per il contenuto microbico deve essere diluito affinché un numero appropriato e contabile di colonie sia presente in piastra. Queste serie di diluizioni vengono chiamate diluizioni seriali decimali che permettono di rilevare la piastra contabile, per contare i microrganismi.

Se i campioni sono solidi, l’unità di misura (unità formanti colonie) sarà su grammi (UFC/gr); se il campione è liquido sarà su millilitro (UFC/ml); se si analizza una superficie (biofilm microbici) l’unità di misura sarà cm² (UFC/cm²); se si analizza l’aria l’unità di misura sarà su litro (UFC/L). Per fare questa analisi lo schema operativo si devono preparare le diluizioni seriali, ma questo avviene direttamente se il campione è liquido (si prende 1 ml di campione e si mette nella 1° divisione che è un tubo dove vi sono 9 ml di soluzione isotonica, ecc…), ma se la matrice è solida non si può prendere 1 ml, quindi è fondamentale fare l’omogeneizzazione del campione, dopo di che si preparano le diluizioni seriali, si fa il piastramento, le piastre vengono incubate e dopo vengono contate e numerate.

Si prende quindi un campione solido che abbia un peso che oscilla tra i 10 e 25 gr e ad esso si aggiungono 9 parti di soluzione isotonica. La soluzione isotonica può essere diversa:

• Soluzione fisiologica
• Acqua peptonata
• Soluzione di sodio-citrato (2%): si utilizza per le matrici grasse (olive, formaggio) che dislegano le particelle grasse e fa sì che i microrganismi intrappolati in esse passino in soluzione
• Tampone fosfato
• Soluzione Ringer: si utilizza in sostituzione alla soluzione fisiologica
• Na pirofosfato (0,16% p/v): è l’unica che non si usa per le matrici alimentari, ma per fare l’analisi dei suoli perché dislega le particelle del suolo e fa sì che i microrganismi intrappolati in esse passino in soluzione

La prima diluizione dei campioni solidi avviene mediante omogeneizzazione; i macchinari che si possono utilizzare sono:

• Stomacher: omogeneizzazione a pale, dove all’interno vi sono delle pale che provocano un’agitazione, andando a slegare il campione omogeneizzato, all’interno di una busta chiamata busta da stomacher;
• Beuta frangiflutto: per le matrici solide come il suolo; all’interno della beuta c’è una calamita dove verrà messo il campione di suolo e la soluzione isotonica, andando a metterle sopra un agitatore magnetico, per effetto della forza centripeta le particelle di suolo sbatteranno nei flutti dentro la beuta si disgregheranno;
• Omogeneizzatore a lame: di solito si utilizza per le carni; è una specie di mixer sterile che con il campione e la soluzione isotonica andrà a triturare del tutto la matrice favorendo il passaggio dei microrganismi alla soluzione.

Dopo la 1° diluizione si va a mettere 1 ml di campione in una provetta che contiene 9 parti di soluzione isotonica (2° diluizione); dopo si prende 1 ml e si va a mettere in un altro tubo che contiene 9 parti di sol isotonica (3° diluizione), ecc… Ad ogni diluizione si va a ridurre la C dei microrganismi di un ordine di grandezza, cioè che se nella 1° diluizione 10^-1 vi sono 10.000 cellule microbiche, nella 2° diluizione 10^-3 ce ne saranno 1000, nella diluizione 10^-4 ce ne saranno 100, nella 10^-5 ce ne saranno 10 e nella 10^-6 ce ne sarà 1. Il numero di diluizioni sono variabili, dipende dalla matrice che si sta analizzando (es: latte alla 10^-4, il mostro in fermentazione alla 10^-9).

Dalla seconda diluizione, prima di mettere il campione nella nuova provetta si deve effettuare un’omogeneizzazione, utilizzando il vortex, perché all’interno della provetta appoggiata di sopra si crea un vortice che omogeneizza tutte le cellule in sospensione. Se non si fa, le cellule tenderanno a depositarsi o a rimanere in superficie e l’analisi microbiologica non sarà veritiera.

I trasferimenti delle soluzioni avvengono tramite pipette graduate o puntali sterili e con filtro, importante per impedire le contaminazioni dell’aria (0,22 µm). Fatte le diluizioni seriali si devono seminare in piastra. Le tecniche di semina sono due:

• Semina per spatolamento: si andranno a mettere 0,1 ml di sospensioni (campioni nelle provette) in piastre che già contengono terreno agarizzato; dopo tramite l’uso di una spatola si distribuirà in modo uniforme la sospensione cellulare su tutta la piastra e dopo di ché le piastre vengono messe dentro gli incubatori. A seconda del gruppo microbico che si vuole ricercare (es: batteri alterativi come Pseudomonas si utilizzerà un substrato di crescita selettivo; sapendo che prediligono le basse temperature verranno messi in frigorifero (0-7°) e dopo 48 ore si andranno a contare le colonie); viene fatta per i microrganismi aerobici, perché hanno bisogno di ossigeno e cresceranno in superficie dopo essere spatolati; nelle piastre viene scritto il tipo di substrato che di solito hanno dei codici (nomi abbreviati), quindi da questo si capisce che tipo di microrganismi si stanno andando a ricercare, poi le diluizioni (-3, -4, -5).
• Semina per inclusione: si mette 1 ml della sospensione microbica nella piastra dove non c’è ancora il substrato di crescita, poi si mette il substrato e dopo le piastre vengono messe ad incubare. Prima di essere messe ad incubare e prima che l’agar si solidifichi per far sì che le colonie si distribuiscano in modo uniforme sulla piastra si fanno una serie di rotazioni (10 rotazioni in senso orario, 10 in senso antiorario, 10 dall’alto verso il basso e 10 da sinistra verso destra); viene fatto per i microrganismi anaerobici perché l’agar toglie aria.

Gli incubatori hanno temperature diverse a seconda del tipo di microrganismo e hanno periodi di incubazione diversi, 24-48-72 ore o addirittura 10 giorni (muffe). Dopo l’incubazione si prendono le piastre e se le diluizioni sono state fatte bene, si dovrebbe notare che la concentrazione dei microrganismi va a diminuire a seconda di quante diluizioni sono state fatte (10^-5 e 10^-6).

Per calcolare le colonie si deve prendere la piastra contabile che ha un numero di colonie che oscillano tra 20-200 se è stata fatta una semina per spatolamento, mentre 30-300 se è stata fatta una semina per inclusione. Si capisce che la diluizione è stata fatta bene se all’aumentare delle piastre diminuisce la concentrazione dei microrganismi.

Quando viene fatta un’analisi microbiologica deve essere fatta in triplo (3 piastre della 10^-4, 3 piastre della 10^-5 e 3 piastre della 10^-6), idem la semina. Va fatta perché il risultato deve essere ripetibile, quindi il risultato che viene nelle prime tre piastre dovrà venire anche nella seconda e nella terza, in modo da essere sicuri che l’analisi è stata fatta bene e che si rimane in quel range di concentrazione.

Calcolo della concentrazione per unità di volume o peso

La formula per calcolare la concentrazione per unità di volume (ml) o peso (g) è:

CFU/ml o CFU/g = 1/3(C1 + C2 + C3) / (vol. sosp. sagg. (ml) x diluizione)

Volume di sospensione saggiato che è pari a: 1 se è stata fatta la semina per inclusione (infatti 1/1= 1); 0,1 se è stata fatta la semina per spatolamento (infatti 1/0,10=10).

Monitoraggio microbiologico delle superfici

Se si ha davanti una superficie l’unità di misura sarà il CFU/cm². I tamponi si possono fare sia con lo spazzolino sterile (legno) ma anche con dei semplici cotton fioc sterili, che vanno inseriti all’interno delle provette che contengono un V noto di soluzione isotonica. Per fare il tampone ci vuole sempre un delimitatore d’aria che permette di circoscrivere e conoscere l’aria che si è analizzata. Si va col tampone a raccogliere tutti gli eventuali microrganismi che si trovano su quella superficie, dopo di ché va immerso nella provetta che contiene la soluzione isotonica per preservarle.

A differenza dei campioni liquidi e solidi nella formula va aggiunto un altro parametro, cioè Volume iniziale sospensione (ml) / Area (cm²).

V iniz sosp (ml): dentro la provetta vi sono per esempio 5 ml di soluzione x l’area che si è analizzata (es: delimitatori d’aria 10x10 quindi l’area è 100 cm²).

CFU/ml o CFU/g = 1/3(C1 + C2 + C3) / (0,1 o 1 ml vol. sosp. sagg. x Area (cm²))

Nel caso del biofilm si usa un tampone con un V di 100 ml e si fa ad analizzare un’area di 100 cm² = 1.

Altri metodi della conta diretta

Monitoraggio dell’aria

Nella conta diretta, il monitoraggio dell’aria è importante per le aziende alimentari, perché l’aria è veicolo di microrganismi. Lo strumento più utilizzato è il “campionatore ad impatto” che aspira l’aria in un tempo stabilito e la convoglia in un vetro petri che contiene un substrato selettivo o non. L’aria aspirata è 1 m³ in 10 minuti (1000 litri). Viene poi messa ad incubare e segue lo stesso iter della conta microbica; la differenza sta che il risultato si definisce con CFU/L.

Membrane filtranti

Viene usato nei campioni di acqua per analizzarne la potabilità, ma anche su liquidi non viscosi e in cui ci sono basse concentrazioni di microrganismi (vino). Si utilizzano diversi strumenti come il “supporto di filtrazione”, dove su di esso viene messo un filtro con un cut off di 0,2 µm, poi una pompa ed una beuta da vuoto. Il liquido passa nel filtro che intrappola i microrganismi (batteri e lieviti) e successivamente il filtro viene messo su un terreno agarizzato (generico o selettico) e dopo le piastre vengono incubate. Dopo l’incubazione avviene la conta vitale delle colonie.

La direttiva 98/83/CE per l’analisi dell’acqua dà i parametri microbiologici per l’acqua destinata al consumo umano. Quando si parla di acqua si deve fare una distinzione tra:

• Acqua di fonte/pozzo: i parametri arrivano fino a 100 ml, dove le conte totali delle colonie a 22° 100 colonie/ml acqua analizzato e a 37° 20 colonie/ml acqua analizzato
• Acqua in bottiglia: i parametri arrivano fino a 250 ml, dove Escherichia Coli, Enterococci, Pseudomonas aeruginosa devono essere assenti.