Microbiologia degli alimenti parte 2

MPN: Metodo per la stima probabilistica dei microrganismi nelle matrici alimentari

MPN è un metodo utilizzato per le matrici alimentari in cui un gruppo microbico è poco concentrato. MPN (most probable number) è la stima probabilistica dei microrganismi in quella matrice.

Si utilizza per determinare i microrganismi a basse concentrazioni, specialmente i coliformi (organismi di origine fecale in acqua e latte) e clostridi butirrici (matrici lattiero-casearie).

Si prende il campione che può essere liquido (direttamente le diluizioni seriali) o solido (preparazione campione, omogeneizzazione e diluizioni seriali che sono sospensioni microbiche). Si prendono le sospensioni seriali e si inoculano in una terna di tubi che contengono un substrato liquido selettivo per il gruppo microbico che si vuole determinare -1 -2 -3 (10, 10, 10, ognuno messo in 3 tubi).

Per esprimere il valore, la prima cosa che si deve vedere è il luogo dove si trova la 1° negatività (dove non c'è stata crescita), lo si annota -3 (es: nella diluizione 10 si è avuto -3).

2 positività), poi si vede a destra (es: 0 positività) e a sinistra (es: 3 positività). Si usano poi delle tabelle statistiche (la più utilizzata è quella di McCrady), dove si va a vedere a che numero di microrganismi corrisponde il valore che si è trovato (3-2-0), quindi si trova 93 microrganismi in 100 ml (esempio), ma siccome si deve sapere quanti microrganismi ci sono in 1 ml si fa 93/100= 0,93 (in 1 ml). Siccome si è trovata nella diluizione 10 si fa 0,93 ∙ 10 (inverso diluizione) = 9,3 ∙10 UFC/ml.

I vantaggi del MPN sono:

• metodo sensibile per basse C
• è più veloce, i risultati si hanno in poche ore
• è facile da usare con i substrati selettivi (coliformi e clostridi butirrici)

Gli svantaggi del MPN sono:

• meno preciso della conta in piastra (calcoli statistici)
• molto più laborioso e costoso delle conte in piastra

Metodi indiretti

Per determinare la massa cellulare si usano diversi

metodi:Misurazioni torbidimetriche (spettrofotometriche)

Si basano sulla deviazione della luce; è un metodo facile, veloce ma sensibili.

Si basa sulla capacità delle cellule di riflettere la luce; più la luce è riflessa e più la soluzione è torbido (più alto il valore di densità ottica o assorbanza).

Lo strumento usato è lo "spettrofotometro" che determina la capacità che hanno le cellule microbiche di assorbire la luce. Misura la deviazione della luce ed il campione va caricato dentro le cuvette che hanno quattro facce:

• due facce lisce: servono per fare la lettura spettrofotometrica attraverso il fascio di luce; non bisogna prenderle con le mani perché si imbratta la superficie e il fascio di luce non l'attraversa, falsando il risultato;
• 2 facce seghettate: servono all'operatore per prendere la cuvetta e caricarla nello spettrofotometro.

Lo spettrofotometro produce un fascio di luce e

determina le cinetiche di morte dei microrganismi starter, impiegati nella produzione lattiero-casearia.

Se dentro la soluzione liquida non ci sono cellule microbiche, il fascio di luce passerà in modo tranquillo il substrato di crescita;

Se dentro la soluzione liquida vi è un elevato sviluppo di microrganismi, essi assorbiranno la luce;

È importante in laboratorio determinare le cinetiche di morte degli starter, perché in alcuni settori alimentari, soprattutto il lattiero caseario, si fa una distinzione tra:

• batteri lattici starter: sono coinvolti nelle fasi di acidificazione e hanno un ruolo preciso (acidificano il latte in poche ore e vanno in lisi cellulare);
• batteri lattici non starter: coinvolti nelle fasi di maturazione del formaggio; sono responsabili dei sentori aromatici dei prodotti;

Per capire se i batteri lattici sono starter si utilizza il pHmetro per capire la capacità di acidificazione del ceppo, ogni 24-48 ore.

Una volta asserito che è un

buon acidificante, per proporlo come batterio starter per la produzione di un formaggio deve essere molto autolitico (deve morire per lasciare poi spazio agli altri microrganismi). Per vederlo si fanno le misure spettrofotometriche nel tempo, quindi ogni 2 ore nelle prime 8 ore e poi dopo 24 ore e poi 24 ore. Se lo sono fortemente andranno velocemente a lisi cellulare, quindi non sono più in grado di deviare o assorbire la luce, ma essa attraverserà la soluzione, quindi si avranno bassi livelli di densità ottica. Esempio: si prende un tubo sterile e si mette del latte UHT (sterile); dentro di esso viene messo ad inoculare il ceppo che si deve testare (coltura pura) che darà vita ad una popolazione di cloni; si incuba alle condizioni di trasformazione di quel formaggio; a intervalli regolari di 2 ore nelle prime 8 ore e ogni 24 ore si misura il pH, se esso passa da 6,7 a 4-4,5 si può affermare che il ceppo inoculato è un buon acidificante, mabisogna capire pure se è autolitico e si valuta con lo spettrofotometro (cuvette).

Crescita microbica

Si parla di un aumento dei costituenti cellulari che può risultare in:

• aumento del numero di cellule: quando il microrganismo si riproduce o per gemmazione o per scissione binaria.
• aumento della dimensione delle cellule: come accade nei microrganismi cenocitici che hanno delle divisioni nucleari ma esse non sono seguite da divisioni cellulari.

I microbiologi studiano la crescita di popolazioni e non di cellule individuali.

Di solito la divisione di microrganismi coinvolti nella fermentazione alimentare avviene per scissione binaria, cioè da una cellula madre si generano 2 cellule figlie.

Durante il ciclo cellulare avvengono due processi:

1. replicazione e partizione del DNA: con due DNA uguali a quello della madre;
2. divisione cellulare: in cellule figlie identiche alla madre.

Crescita cellulare: aumento ordinato dei costituenti cellulari; crescita della popolazione: aumento

numerico delle cellule di una popolazionemicrobica.L’aumento cellulare è una progressione geometrica in base 2 cioè da 1 cellula a 29cellule, da 2 a 4, da 4 a 8, ecc, fino a non superare di concentrazione di microrganismi i 103UFC/ml/g/m .Durante la riproduzione si considera:- tempo di generazione: tempo necessario (duplicazione) per generare dalla cellulamadre 2 cellule figlie; questo cambia da specie a specie e dipende da diversi fattori come ilsubstrato in cui si trova, il pH, le condizioni di T e può avere durata che va da pochi minutia giorni.Nelle condizioni ottimali (in un sistema chiuso, cioè un terreno di coltura), il tempo digenerazione di un microrganismo sarà più rapido rispetto ad un ambiente naturale (tuttinutrienti che servono).La crescita di un microrganismo (delle cellule) è di tipo esponenziale.

Asse delle ascisse: n° di incubazione (ore)

Asse delle ordinate: n° di cellule (10, 500, 1000)

La conta vitale non

si osserva una crescita significativa delle cellule, ma piuttosto un periodo di adattamento in cui il microrganismo si prepara per la fase successiva. La 2° fase è quella esponenziale, in cui il numero di cellule aumenta in modo rapido e costante. Questa fase è caratterizzata da una crescita ottimale, in cui il microrganismo trova tutte le condizioni favorevoli per la sua riproduzione. La 3° fase è quella stazionaria, in cui il numero di cellule si stabilizza. Questo avviene perché le risorse disponibili si esauriscono o perché si accumulano sostanze di scarto che iniziano a limitare la crescita del microrganismo. Infine, la 4° fase è quella di declino, in cui il numero di cellule diminuisce. Questo avviene quando le condizioni diventano sempre più sfavorevoli e il microrganismo non è più in grado di sopravvivere. La rappresentazione grafica di questa curva di crescita può essere utile per comprendere il comportamento di un microrganismo in diverse condizioni di coltura e per valutare l'efficacia di determinati trattamenti o interventi.crescita disponibili. Inizialmente, le cellule utilizzano una fonte di nutrienti preferenziale, ma quando questa si esaurisce, passano a utilizzare una seconda fonte di nutrienti. Questo tipo di crescita può portare a una fase di stazionamento prima di riprendere la crescita esponenziale. Durante la divisione cellulare, le cellule si dividono in due cellule figlie identiche. Questo processo è essenziale per la riproduzione e la crescita degli organismi. Durante la divisione cellulare, il DNA viene replicato e distribuito equamente tra le due cellule figlie. Durante la crescita esponenziale, le cellule si dividono rapidamente e utilizzano le fonti di carbonio presenti per il loro metabolismo. Questa fase di crescita continua finché non viene raggiunto un numero massimo di colonie, indicato come 10 CFU/ml. Nella fase di stazionamento, le cellule che si riproducono e quelle che muoiono si bilanciano. Questo equilibrio può essere influenzato da vari fattori, come la disponibilità di nutrienti e le condizioni ambientali. Infine, nella fase di morte, le cellule muoiono quando non sono più disponibili sufficienti nutrienti o quando si accumulano troppe sostanze di scarto. Questa fase segna la fine del ciclo di vita delle cellule. È importante notare che la durata di ciascuna fase può variare a seconda della specie microbica e delle condizioni ambientali.C.Es: quando in una matrice alimentare ci sono due fonti di C (glucosio e lattosio). Ci sarà la: - fase stazionaria (lag) e il tempo dipende dalla specie ed altri fattori; - fase esponenziale dove i microrganismi utilizzano lo zucchero, ovvero il glucosio; - fase di latenza (lag) dove i microrganismi produrranno gli enzimi per scindere il lattosio per poterlo utilizzare; - fase di crescita che avviene dopo aver metabolizzato il lattosio; - fase stazionaria dove le cellule che si riproducono e quelle che muoiono sono bilanciate. Alimento L'alimento è qualsiasi sostanza che assunta dall'esterno per via orale assolve 3 funzioni: - energetica: deve fornire energia al metabolismo per regolare la temperatura corporea e permettergli di muoversi; - plastica: deve fornire il materiale cellulare durante lo sviluppo ed il suo ricambio cellulare durante l'età adulta; - protettiva: deve permettere all'organismo di proteggersi dalle infezioni (sistema immunitario). Tuttigli alimenti e possono causare malattie.