Microbiologia degli alimenti fermentati - punti chiave

Microbiologia degli alimenti fermentati

Alimenti trasformati

Gli alimenti trasformati vengono principalmente realizzati per aumentare la shelf-life evitando alterazioni di natura chimica e microbiologica. Le alterazioni microbiche viste da un altro punto di vista: quelle da microrganismi utili portano a trasformazione per via fermentativa dell'alimento con incremento della qualità organolettica-nutrizionale e effetti probiotici verso il consumatore. Questi microrganismi devono essere in una concentrazione di circa 10^7-8-9 ufc/g o ufc/ml.

La produzione ha grande importanza economica, industriale nonché consente la preservazione della tradizione, ma l'aspetto più importante è quello della stabilizzazione di nuovi prodotti. Gran parte della produzione industriale non prevede alcun disciplinare di produzione. Le nuove innovazioni nella tecnologia consentono una produzione più controllata che garantisce un'elevata qualità al prodotto finale. Nei paesi sviluppati gli alimenti fermentati costituiscono il 20% della dieta mentre in quelli in via di sviluppo ne costituiscono il 50%, questo perché la trasformazione per via fermentativa garantisce la stabilità al prodotto, inoltre è un sistema di conservazione a basso costo. In ogni caso deve essere sempre garantita la stabilità e la sicurezza.

L'origine dei prodotti fermentati è quella di prevenire il deterioramento degli alimenti e il loro conseguente avvelenamento. Tra la fine del 1600 e metà 1800 i fenomeni di alterazione e fermentazione erano dibattito tra alchimisti e filosofi, non di biologi. In questi anni avvengono due eventi: con l'avvento della rivoluzione francese vi è una maggiore disponibilità di energia, inoltre c'è una ridistribuzione della popolazione dalle città alle campagne; questa ridistribuzione comporta l'aumento di produzione dei prodotti alimentari nelle campagne per soddisfare le esigenze nutritive delle città. Inoltre, vi è la scoperta della pastorizzazione da parte di Pasteur, il quale lo applicò per la prima volta su birra e vino "per eliminare tutti i problemi".

La trasformazione per via fermentativa

La trasformazione per via fermentativa ha una visione biunivoca:

• Da un lato, aumentare la produzione di prodotti fermentati su scala industriale.
• Dall'altro, conoscere le cause della produzione di sapori e aromi dei prodotti artigianali affinché possano essere conservati e riprodotti.

Concetti fondamentali

• Gli alimenti sono contaminati.
• L'alimento è un ecosistema nel quale fattori impliciti, intrinseci ed estrinseci regolano lo sviluppo microbico.
• Le interazioni dei fattori ambientali determinano che un microrganismo si possa o meno sviluppare in quell'ecosistema.

Regole base della regolazione del metabolismo: in condizioni ottimali, un microrganismo non produce metaboliti in eccesso. Di fondamentale rilievo sono quei microrganismi in grado di adattarsi a condizioni non ottimali che oltre a produrre l'effetto diretto della trasformazione per via fermentativa, sono in grado di effettuare un metabolismo secondario che porta alla produzione di metaboliti condizionanti la qualità del prodotto.

I microrganismi negli alimenti cercano nutrimento, in particolare:

• Glucidi e grassi come riserve di energia.
• Proteine per il contenuto di amminoacidi essenziali che loro non sono in grado di sintetizzare da sé.
• Minerali, vitamine, urea ed enzimi.
• Acqua, fondamentale per lo sviluppo microbico → Aw alimento.

Cosa comporta la trasformazione per via fermentativa negli alimenti?

Favorisce la conservazione: la fermentazione è un processo biochimico che si basa sulla degradazione degli zuccheri portando alla produzione di alcoli, acidi e CO₂. Questi metaboliti fungono da antimicrobici in quanto abbassano il pH, inibendo i microrganismi indesiderati causa di alterazioni e inoltre si consuma l'ossigeno con formazione di anidride carbonica. Per quanto riguarda la competizione nutrizionale, all'inizio tra MF e NMF vi è una competizione per i nutrienti; con la produzione di alcoli, acidi e CO₂, i NMF non si trovano più nelle condizioni ideali di sviluppo.

Modifica il valore nutrizionale: questo perché vengono degradati gli zuccheri e si producono nuovi metaboliti.

Arricchisce le proprietà sensoriali: sempre dato dalla degradazione degli zuccheri, i metaboliti prodotti hanno sapori diversi dallo zucchero di partenza. Oltre agli zuccheri vengono degradati ulteriori composti come grassi e proteine. Quello che maggiormente arricchisce le proprietà sensoriali è l'effetto della conservazione ottenuto mediante la fermentazione che dà stabilità al prodotto finale il quale può maturare/stagionare. Con la maturazione si ha ulteriori metaboliti (secondari) che arricchiscono aromi e sapori.

Modifica proprietà reologiche: si ha la produzione di esopolisaccaridi, che sono catenelle extracellulari che fungono da addensanti.

Favorisce detossificazione: cassava normalmente produce da glucosidi cianogenici acido citrico che è tossico e porta a una neuropatologia (Konzo). Mediante polverizzazione e fermentazione da parte di S. cerevisiae si ha la produzione di HCN gassoso che ad alte temperature volatilizza, lasciando un residuo blando nel prodotto finale. Raro caso della farina di cocco: Burkholderia gladioli produce acido bongkrek che ha effetto tossico sul meccanismo di trasformazione ATP-ADP, quindi sul meccanismo di liberazione di energia, impedendo all'ATP di uscire dai mitocondri.

Microrganismi fermentanti

I microrganismi che fermentano sono quelli in grado di ricavare energia in assenza di O₂. I principali sono:

• LAB → fermentazione lattica
• Batteri acetici → "fermentazione acetica": non si tratta di una vera fermentazione in quanto essi sono microrganismi aerobi → si tratta di una trasformazione ossidativa: in pratica consiste in una parziale ossidazione dell'Et-OH.
• Batteri propionici → producono occhiature in certi formaggi
• Lieviti → S. cerevisiae per bevande alcoliche e prodotti da forno
• No muffe

Molti altri microrganismi anche non fermentati vengono coinvolti prima o dopo il processo fermentativo. Prima per preparare la materia prima, mentre dopo sono coinvolti nei processi di stagionatura e maturazione. Non tutte le materie prime possono fermentare. Vi sono tre condizioni necessarie:

• La materia prima deve possedere degli zuccheri fermentescibili come glucosio, fruttosio, maltosio, lattosio.
• La materia prima deve contenere una concentrazione di zuccheri tale da consentire uno sviluppo microbico abbondante.
• Se la materia prima non dispone direttamente di zuccheri fermentescibili essa deve subire un processo tecnologico in grado di renderli disponibili, come pigiatura dell'uva, precipitazione della caseina, germinazione delle cariossidi.

Fermentazione

• Spontanea: creazione di un ambiente selettivo che favorisce lo sviluppo di microrganismi utili naturalmente presenti nella materia prima; è caratterizzata da una velocità lenta perché a inizio processo la concentrazione di microrganismi è bassa. Inoltre, gli alimenti che subiscono questo tipo di trasformazione non devono subire trattamenti quali pastorizzazione, in quanto destabilizzerebbe ulteriormente il prodotto, portandolo a una fermentazione incompleta.
• Guidata: mediante l'aggiunta deliberata di microrganismi starter che diventeranno dominanti nelle fasi iniziali del processo. Questo tipo di fermentazione provoca:
  • Accelerazione dell'inizio della fermentazione
  • Produzione di metaboliti desiderati
  • Standardizzazione del processo che diventa riproducibile

Tipi di starter

Due tipi di starter:

• Naturale: sviluppati artigianalmente in conseguenza ad osservazioni empiriche. Si basa sul concetto del back-slopping (reinoculo): una parte di prodotto ben riuscito viene utilizzato come inoculo per un nuovo batch della materia prima. Microflora ignota e non controllabile.
  • Vantaggi: basso costo, legame con il territorio, resistenza al batteriofago, variabilità microbiologica → avere una composizione biodiversa significa che in caso di complicazioni durante il processo qualche microrganismo prenderà il sopravvento e continuerà il processo.
  • Svantaggi: variabilità fenotipica e di performance.
• Selezionati: colture note mantenute in sterilità.
  • Vantaggi: standardizzazione del processo.
  • Svantaggi: costo e sensibilità al batteriofago.

Batteri lattici

I batteri lattici (LAB) sono un gruppo eterogeneo di batteri caratterizzati dalla produzione di acido lattico attraverso la fermentazione degli zuccheri. Sono ubiquitari, origine principalmente vegetale ma anche animale (carne e latte), inoltre naturalmente presenti nel tratto intestinale umano (e isolati anche nei fiori).

Gram +, asporigeni, non mobili, morfologia: coccica o bastoncellare. In passato, la tassonomia ideata da Sigurt Orla-Jensen li divideva a seconda della morfologia e del metabolismo. I metabolismi principali dei LAB possono essere due:

• Omofermentanti → acido lattico
• Eterofermentanti → acido lattico, etanolo/ac. acetico + CO₂

Il metodo attuale di identificazione si basa sull'utilizzo di un gene universale: il 16sRNA, il quale è un gene necessario alla sopravvivenza in quanto codifica la subunità 16s dell'RNA ribosomiale implicato nella sintesi proteica. Gene stabile con basso tasso di mutazione. Vengono riconosciute le prime 500 pb. Il risultato dell'identificazione viene confrontato con le banche dati e l'omologia dà il risultato dell'identificazione.

I LAB si dividono in due classi:

• Cocchi → fam. Streptococcaceae → generi: Streptococcus e Lactococcus
• Bacilli → fam. Lactobacillales → 45 generi

Nota: bifidobacteria non appartiene ai LAB ma è presente nel tratto intestinale insieme ai LAB.

Nei alimenti

• Lactococcus → lactis nei formaggi
• Lactobacillus
• Leuconostoc
• Oenococcus
• Weisella
• Streptococcus
• Enterococcus

L'aspetto tecnologico non si basa tanto sulla tassonomia ma soprattutto sulla biodiversità fenotipica: ceppi della stessa specie hanno caratteristiche fenotipiche diverse, le quali si basano su:

• Capacità di usare differenti zuccheri: glucosio e fruttosio
• Resistenza all'acidità: vi sono microrganismi che si sviluppano più lentamente ma producono più acido lattico di altri microrganismi che si sviluppano più velocemente; questo perché alcuni man mano che producono l'acido lattico vengono inibiti dallo stesso → è il caso di Lactobacillus delbrueckii vs Streptococcus thermophilus (yogurt)
• Resistenza a NaCl
• Resistenza alla temperatura
• Attitudine alla proteolisi
• Autolisi → intesa come la capacità delle cellule di autolisarsi durante la maturazione di un prodotto fermentato e che portano alla fuoriuscita di enzimi in grado di continuare a degradare composti → formazione composti a impatto aromatico
• Produzione di sostanze aromatiche → in alimenti stagionati
• Resistenza/sensibilità al batteriofago
• Produzione di addensanti (esopolisaccaridi) → es. kefirano nel kefir (bevanda latto-alcolica) prodotto da Lactobacillus kefiranofaciens

Negli alimenti i LAB si possono trovare come normali contaminanti della materia prima oppure si possono trovare in seguito al processo di fermentazione. Essi vengono aggiunti per diversi scopi: avere alimenti funzionali → aggiunti di batteri lattici probiotici e di LAB che liberano peptidi bioattivi. Oppure avere bioprotezione → aggiunti perché in grado di produrre molecole come batteriocine o proteine killer. In ogni caso già l'acido lattico ha azione antimicrobica verso gli acido tolleranti.

Attività fenotipiche nella trasformazione

Vi sono aspetti fenotipici importanti nella trasformazione, questi sono basati sulle capacità cataboliche → degradazione di molecole complesse in molecole semplici con liberazione di ATP.

Metabolismi

• Primari: fermentazione
• Secondari: proteolisi, lipolisi e in risposta allo stress

Questi pathway metabolici si esprimono in base alle necessità nutrizionali → i LAB richiedono i composti organici specifici in quanto non hanno una via biosintetica e nemmeno sono dotati di sistemi enzimatici per la sintesi. I composti sono: zuccheri fermentescibili, amminoacidi (a scopo biosintetico).

Importante: la membrana batterica svolge un ruolo centrale selettivo sui nutrienti e sull'osmaltimento di composti tossici → fondamentale mantenere il citoplasma nelle condizioni idonee.

Metabolismo fermentativo

• Fermentazione lattica di differenti monosaccaridi:
  • Esosi → omofermentanti ed eterofermentanti
  • Pentosi → solo eterofermentanti senza produzione di CO₂
• Fermentazione lattica disaccaridi: lattosio → attraverso un sistema PTS-PEP il lattosio viene fosforilato a lattosio-6P, successivamente idrolizzato da una β-fosfogalattosidasi che libera glucosio e galattosio-6P. Glucosio → via omofermentante o eterof. Galattosio-6P → via Tagatosio-6P
• Degradazione acidi organici (metabolismo secondario) → non si tratta di una fermentazione ma è molto importante, infatti la degradazione di questi porta alla produzione di sostanze a impatto aromatico.

Citrato → ossalacetato → ac. piruvico + CO₂ → diacetile.

Citrato → ossalacetato → ac. piruvico + CO₂ → acetoino.

Ac. malico (enologia) → ac. piruvico + CO₂ (enzima malico) → ac. lattico (enzima LDH).

Ac. malico → ossalacetato (enzima MDH) → ac. piruvico + CO₂ → ac. lattico (enzima LDH).

Attività proteolitica

LAB esigenti di composti azotati a basso PM → non hanno via biosintetica. La proteolisi è un fenomeno che prevede l'intervento di differenti enzimi in successione che degradano proteine in peptidi più semplici (max 10 aa) in grado di permeare nella membrana arrivando al citoplasma dove avviene ulteriore degradazione → aa utilizzati per la costruzione delle proteine a loro necessarie. Alternativamente alla via biosintetica, se presenti in eccesso possono essere ulteriormente degradati per decarbossilazione (-) o transamminazione (+) con produzione di molecole ad impatto aromatico.

• Decarbossilazione → libera amine biogene, a parte serotonina le altre sono negative.
• Transamminazione → liberazione α-chetoacido poi ulteriore degradazione porta a composti con valenza aromatica nei prodotti stagionati (esteri e alcoli superiori).

Sistema proteolitico

1. Proteasi: enzimi extracellulari localizzati sulla parete che hanno attività specifica → idrolizzano (idrolisi endopeptidasica) il legame peptidico nella proteina (esterna). Le proteasi vengono sintetizzate all'interno della cellula e poi trasportate sulla parte tramite un peptide segnale. Le proteasi si differenziano per specificità di taglio, geni codificanti in plasmidi (PrtP- caseina), presenza di una o più CEP.
2. Sistema di trasporto: consentono il passaggio di peptidi e aa liberi. Può avvenire con dispendio di ATP o attraverso la forza proton-motrice dovuta a gradiente elettrochimico. Si differenziano a seconda del consumo energetico: più grande peptide più energia spesa.
3. Peptidasi: citoplasmatiche/parete, si differenziano per la struttura (da monomero fino ad ottamero), natura (metallo dipendenti, cisteina dipendenti) e specificità.
   • Tripeptidasi: riconoscono il primo aa e rilasciano il dipeptide. PepT (metallopeptidasi).
   • Dipeptidasic
   • Aminopeptidasi più frequenti: riconoscono l'aa con N-term libero.
   • Pep che coinvolgono Pro.
   • Carbossipeptidasi NO nei LAB: riconoscono aa con C-term libero.

Attività lipolitica

La attività lipolitica è un fenomeno contenuto. In alimenti stagionati questa attività è fortemente associata alla presenza di lieviti e muffe. Si ha attività esterasica da parte di enzimi che degradano l'acido grasso con liberazione di composti a impatto aromatico (pungente, piccante).

Muffe e lieviti

Nella fermentazione soltanto alcuni lieviti vengono coinvolti direttamente, mentre le muffe non sono mai coinvolte direttamente (agiscono prima o dopo la fermentazione).

Lieviti

I lieviti sono microrganismi eucarioti unicellulari capaci di dar luogo a fermentazione alcolica. Negli alimenti, la forma ovale di alcuni lieviti ha un vantaggio rispetto alla forma bastoncellare dei batteri; a parità di numero di cellule, il volume dei lieviti è maggiore rispetto al volume occupato dallo stesso numero di batteri.

Caratteristiche:

• Resistenti all'acidità
• Mesofili, psicrotrofi
• Alofili e osmofili
• Necessitano di Aw inferiore ai batteri ma superiori alle muffe
• Non resistono alla pastorizzazione → una riduzione logaritmica ogni minuto a valori di 60-65°C. Questi valori diminuiscono se sono in ambiente acido, aumentano (> termoresistenza) se vi è alta concentrazione di sali e zuccheri, aumentano se stress idrico.

Metabolismo lieviti

Sono organismi chemiorganotrofi che ricavano ATP dalla degradazione di diversi composti organici; la modalità di degradazione del glucosio avviene in modo diverso in funzione dell'ossigeno:

• Metabolismo respiratorio
• Metabolismo fermentativo

Entrambi iniziano con la glicolisi → da una molecola di glucosio si formano 2 moli di piruvato e 2 ATP. Nella fermentazione, il piruvato è trasformato in etanolo, questo processo non produce ulteriore ATP. Mentre nella respirazione, il piruvato è completamente ossidato a CO₂ con produzione di ATP.

Effetto Pasteur: quando il lievito cresceva in aerobiosi consumava molto meno glucosio di quando cresceva in anaerobiosi. Quando cresceva in anaerobiosi produceva gas.