Microbiologia

SPETTROFOTOMETRO

Lo spettrofotometro è uno strumento dotato di una lente, un prisma, che scompone la luce, un filtro che

lascia passare solo la luce di una determinata lunghezza d'onda (normalmente la torbidità dei batteri viene

misurata alla lunghezza d'onda di 600 nm → nel campo del visibile) poi il detectur → cioè la lettura. Il tutto

viene colpito da una sorgente di luce.

Nello spettrofotometro la luce viene diffratta da un prisma e viene selezionato un raggio di una determinata

lunghezza d'onda.

COLORIMETRO

Il colorimetro usa un filtro ad ampia banda e il raggio di luce monocromatica viene creato facendo

passare la luce attraverso un filtro colorato.

Per ottenere un numero che aumenti all'aumentare della massa della coltura si misura la torbidità utilizzando

come unità di misura la densità ottica o assorbanza.

Ottengo un valore che man mano che aumenta la torbidità aumenta.

CURVA DI CRESCITA (coltura in batch)

Posso calcolare una curva di crescita in base alla densità ottica.

La curva verde è la curva di crescita della coltura disegnata allegendo la densità ottica.

La curva in rosso è la curva di crescita della popolazione batterica misurata andando a contare le cellule.

CHEMOSTATO

È possibile avere delle culture continue usando il chemostato. È uno strumento con cui posso regolare la

quantità di terreno fresco che metto e eliminare poi il terreno dove sono cresciuti i batteri quindi posso

regolare una serie di parametri e fare in modo per esempio che le condizioni di coltura siano sempre le

stesse.

Questo permette di far sì che le cellule batteriche crescano sempre in fase esponenziale.

Colture in continuo (sistema aperto)

– Variando la velocità di diluizione e la concentrazione di un nutriente si può controllare la densità di

– popolazione e la velocità di crescita.

Permette di studiare una coltura stabilizzata in una particolare fase di crescita.

– Utilizzato molto per studi di fisiologia microbica perchè permette di ottenere condizioni di crescita

– riproducibili. BIOFILM

In natura i microrganismi vivono in comunità microbiche che prendono il nome di biofilm.

Caratteristiche :

Sono comunità microbiche avvolte da una matrice extracellulare prodotta dai microrganismi

• (protezione ambientale).

Costituite da una stessa specie microbica (es. nei siti di infezione) o da specie diverse (es. in natura).

• In stretto contatto con la superficie colonizzata che può essere biotica (tessuti) o abiotica (plastica,

• metalli)

Formazione

1. La superficie è colonizzata da cellule planctoniche.

Le cellule aderiscono, inizialmente possono aderire in maniera aspecifica poi può diventare

2. irreversibile mediata da fattori di adesione (costitutivi o indotti) → il batterio può indurre la sintesi

delle adesine necessarie all'ancoraggio.

Una volta stabilita l'adesione, il batterio prende contatto con la superficie, il flagello non serve più e

3. quindi avviene la repressione della biosintesi del flagello.

Il batterio inizia a moltiplicarsi formando microcolonie → in questa fase i batteri cominciano a

produrre materiale extracellulare di natura polisaccaridica che va a costituire la matrice nella quale

loro sono immersi (che fa da schermo protettivo).

4. Crescita e formazione del biofilm maturo.

All'interno del biofilm possono formarsi delle rotture meccaniche per produzione di enzimi

5. degradativi o induzione di profagi, che vanno a rompere la matrice che si è formata e quindi

all'interno del biofilm si formano come delle cavità.

! il biofilm non è mai una pellicola compatta ma all'interno della matrice possono esserci delle

aperture/canali.

La placca dentale è un biofilm : la placca dentale si forma per associazione di microrganismi di specie

diverse che vanno a costituire un biofilm.

Generalmente i primi microrganismi che formano la placca dentale sono streptococchi orali : nella saliva

sono presenti delle glicoproteine, gli streptococchi possiedono delle adesine che interagiscono con queste

glicoproteine e permettono di aderire al dentro.

Sopra la superficie di streptococchi orali sono espresse molte altre proteine che vengono riconosciute da

adesine di altre specie microbiche presenti nell'ambiente.

I batteri secernono materiale extracellulare (generalmente di natura polisaccaridica) ma possono anche

secernere DNA.

A questo punto i batteri svolgono il loro metabolismo, consumano ossigeno creando un ambiente anossico

che quindi potrà essere colonizzato anche da batteri con metabolismo anaerobio.

Col tempo la matrice extracellulare può calcificarsi → formazione del tartaro.

! Nell'ambiente anossico vive lo Streptococcus mutans, agente eziologico della carie. Fa venire la carie perché

durante la fermentazione produce acido lattico che va a corrodere la superficie del dente.

Il lisozima della saliva contiene il numero di batteri.

Vantaggi del biofilm

Resistenza ad agenti esterni:

• Essiccamento

◦ Shock termico

◦ Trattamento con detergenti

◦ Trattamento con antimicrobici

◦ Sistemi di difesa dell'ospite

◦ Maggiore frequenza di eventi di scambio genico orizzontale.

◦

Forma di resistenza che consente alla cellula di rimanere in uno stato vegetativo e continuare a

• moltiplicarsi.

Il biofilm è un sistema dinamico, i batteri che ne fanno parte vanno incontro a cambiamenti del loro stato

metabolico.

L'interno del biofilm non è una struttura compatta ma ci sono canali/apertura per favorire l'entrata di

nutrienti e l'uscita di sostanze di scarto.

I biofilm rappresentano un problema in medicina perché tendono a formarsi nei dispositivi medici installati

nei pazienti (cateteri, protesi, pacemakers).

I microrganismi più comunemente associati alla formazione di biofilm nei dispositivi medici sono

stafilococchi (principalmente S. aureus e S. epidermidis, P. aeruginosa).

QUORUM SENSING

E' un meccanismo di comunicazione tre cellule batteriche.

Le cellule batteriche presenti in una comunità riescono a produrre dei segnali, che vengono poi intercettati,

che permettono alla singola cellula batterica di capire che in quell'ambiente ci sono altre cellule.

Generalmente è un sistema di comunicazione tra microrganismi della stessa specie ma anche di specie

diverse.

È un sistema di comunicazione ubiquitario.

Svolge un ruolo fondamentale in importanti processi biologici :

Sviluppo della competenza genetica (sintesi delle proteine per l'uptake del DNA esogeno →

• trasformazione)

Patogenesi (sintesi di proteine che favoriscono la patogenesi)

• Produzione di antibiotici

• Biofilm (sintesi dei polisaccaridi extracellulari.

•

QS (modello Gram -)

I Gram – producono in maniera costitutiva (sempre) delle molecole che prendono il nome di autoinduttori

(molecole segnale) : molecola chimica che viene generata nel citoplasma e secreta all'esterno.

Questa molecola può essere rilasciata nell'ambiente extracellulare ma anche rientrare nella cellula batterica.

Quando le cellule batteriche sono presenti in basso numero, queste molecole (autoinduttori) saranno molto

diluite.

Man mano che le cellule batteriche si moltiplicano, aumentando di numero, aumenterà anche la

concentrazione di autoinduttori che si trovano all'esterno e quindi rientrano nella cellula batterica.

Quando all'interno del citoplasma queste molecole segnale superano una certa concentrazione soglia, queste

interagiranno e si legheranno con proteine (attivatori trascrizionali).

Di solito l'interazione tra attivatore trascrizionale e autoinduttore determina il cambiamento di

conformazione dell'attivatore trascrizionale.

In virtù di questo cambiamento, l'attivatore trascrizionale dimerizza e va a legarsi alla sequenza operatore

del promotore di un gene bersaglio.

Di solito le sequenze operatore sono caratterizzate dalla presenza di sequenze palindromiche che vengono

riconosciute dal dimero.

È un fenomeno che avviene contemporaneamente in tutte le cellule batteriche presenti nella coltura.

QUINDI : il quorum sensing permette di regolare la trascrizione di una serie di geni in maniera dipendente

dalla concentrazione batterica.

! Molti patogeni producono per esempio adesine, tossine solo quando sono presenti in numero elevato.

Natura chimica dell'autoinduttore dei Gram -

Sono acil-omoserin-lattone (perché posseggono un omoserin lattone) e da un acido grasso a cui possono

essere legati eventuali sostituenti chimici.

La loro produzione è finalizzata esclusivamente alla funzione di molecola segnale per la comunicazione

intercellulare.

La porzione idrofobica è necessaria per facilitare la diffusione attraverso la membrana citoplasmatica.

Il gruppo lattonico è coinvolto nell'interazione con il regolatore della risposta.

QS (modello Gram+)

Il meccanismo di QS per i Gram + è leggermente diverso rispetto a quello di Gram +.

Gli autoinduttori possono essere dei:

g - butirrolattoni (streptomiceti).

• Peptidi di dimensioni variabili, chiamati feromoni (nella maggior parte dei Gram +).

• I feromoni sono sintetizzati come precursori che vengono poi modificati.

Questo è il locus del cromosoma di S. aureus in cui sono codificati i geni responsabili del meccanismo QS

denominato AgrD.

Ci sono 4 geni che servono per il processo di QS.

agrD codifica per una piccola proteina, che una volta prodotta viene processata in modo da rilasciare il

peptide. Il peptide va incontro poi a modificazioni post-traduzionali → si viene a creare un ponte tra la

cisteina e la metionina tramite un atomo di zolfo.

Una volta che il peptide è stato modificato, rappresenta l'autoinduttore che viene prodotto e modificato

all'interno della cellula batterica (citoplasma) e poi rilasciato all'esterno.

Man mano che aumenta la densità della popolazione batterica, aumenta la concentrazione di autoinduttore

nello spazio esterno (extracitoplasmatico).

Quando la concentrazione di autoinduttore presente nello spazio extracitoplasmatico supera una certa

concentrazione, si va a legare ad una proteina che è localizzata sulla membrana citoplasmatica del batterio

Gram+.

Questa proteina di membrana è una istidina chinasi (agrC), che in seguito a questa interazione si

autofosforila. Trasferisce poi il fosfato al regolatore della risposta (agrA) che è il fattore trascrizionale che va

ad attivare il gene bersaglio.

In S. aureus i geni bersaglio sono delle proteine (proteasi) che servono per idrolizzare la matrice

extracitoplasmatica sottostante al tessuto epiteliale. Creano un varco nel tessuto attraverso il quale il batterio

passa.

DIFFERENZA TRA IL QS NEI GRAM