Microbiologia clinica

Microbiologia clinica: la diagnosi di infezione

Lo scopo della diagnosi di infezione è la corretta inquadratura clinico-epidemiologica dell'infezione con l'individuazione dell'organo o degli organi interessati in modo da permettere la formulazione di un'ipotesi diagnostica che può essere confermata attraverso il prelievo di un campione di materiale patologico (in modo corretto) che è inviato rapidamente al laboratorio.

Il microbiologo è il medico che provvede alla scelta del campione, alla giusta modalità del prelievo e all'esecuzione degli accertamenti dei sospetti del medico clinico sul paziente per poi comunicare gli esiti degli esami laboratoristici al clinico stesso in modo che egli possa somministrare la corretta terapia al paziente.

Il campione patologico deve essere raccolto prima dell'inizio della terapia antibiotica o antivirale durante la fase acuta della malattia in quantità sufficiente ed in un eventuale terreno di trasporto che permetta il mantenimento di un pH idoneo e che prevenga la disidratazione e l'autodigestione enzimatica; è importante anche rispettare i tempi di prelievo secondo le esigenze mediche specifiche, ad esempio le urine e gli escreati sono raccolti solitamente al mattino perché sono più concentrati mentre per la diagnosi di setticemia devono essere prelevati tre campioni di sangue nelle 24 ore.

Approcci diagnostici

La diagnosi microbiologica e virologica può basarsi su un approccio diretto volto alla ricerca diretta del microrganismo, del virus o dei suoi componenti (proteine, carboidrati e genoma) all'interno dei materiali patologici oppure su un approccio indiretto volto alla ricerca dell'immunità specifica all'interno del siero del paziente (è detta anche indagine sierologica).

Esame microbiologico-virologico diretto

• Esame microscopico per l'identificazione morfologica del microrganismo, in particolare è possibile utilizzare il microscopio ottico, il microscopio elettronico, il microscopio in campo scuro, il microscopio a contrasto di fase ed il microscopio a fluorescenza.

  Il microscopio ottico è il primo strumento utilizzato dal microbiologo in quanto permette di analizzare le dimensioni dei microrganismi e la loro morfologia (forma e margini della colonia) sia a fresco che in seguito all'esecuzione di una colorazione semplice (utilizzo di un solo colorante come il blu di metilene) o di una colorazione differenziale (utilizzo di più coloranti); le principali colorazioni utilizzate in microbiologia sono la colorazione di Gram che permette di distinguere i batteri Gram positivi dai batteri Gram negativi e la colorazione di Ziehl-Neelsen che colora i batteri alcol-acido resistenti, mentre l'ingrandimento più utilizzato è il 1.000x (100x di obiettivo e 10x di oculare). Altre caratteristiche che possono essere apprezzate al microscopio ottico sono il colore dovuto alla produzione di endopigmenti (come nel caso dello Staphylococcus aureus) o di esopigmenti (come nel caso di Pseudomonas aeruginosa), l'emolisi su agar sangue che può essere completa (come nel caso di Streptococcus pyogenes) o parziale (come nel caso di Streptococcus viridans) e la crescita sul terreno MacConkey's che diventa di colore rosa intenso se i batteri fermentano il lattosio o pallido se non fermentano il lattosio.

  Nota Bene: I batteri Gram positivi resistono alla decolorazione in alcool e appaiono di colore violetto dato dal violetto di genziana (il trattenimento del colorante è permesso dalla parete batterica formata da peptidoglicano), mentre i batteri Gram negativi sono decolorati dall'alcool ed assumono un colore rosso dato dalla safranina.

  [I batteri presentano delle dimensioni nell'ordine delle centinaia di nanometri (ad esempio Escherichia coli è uno dei batteri più grandi e misura 3.000x1.000 nm), mentre i virus hanno dimensioni variabili da centinaia di nm fino a poche decine di nm (ad esempio, il virus dell'ebola misura 970 nm mentre i Rhinovirus solo 30 nm)].

• Esame colturale prevede la crescita in vitro dell'agente infettante in specifici terreni, ad esempio sono generalmente utilizzati dei terreni artificiali abiotici (ad eccezione di Treponema pallidum che cresce solo nel testicolo di coniglio), ma per i batteri intracellulari obbligati come le Clamidiae e le Rickettsiae e per i virus è necessario utilizzare delle colture cellulari sia primarie che linee continue; in particolare, per i virus è possibile valutare l'effetto citopatico che si può manifestare con l'arrotondamento delle cellule conseguente alla rottura del citoscheletro (come nel caso di Citomegalovirus), con la formazione di sincizi e di cellule giganti contenenti diversi nuclei (come nel caso del morbillo, del virus respiratorio sinciziale, della parotite e di HIV), con l'arrotondamento delle cellule che si aggregano in grappoli (come nel caso degli Adenovirus e degli Herpes Simplex) oppure con la formazione di inclusioni acidofile o basofile apprezzabili dopo un'opportuna colorazione.

  La semina nei terreni di coltura solidi prevede l'inoculo di 0.1 ml della sospensione che è distribuita in quattro settori della piastra Petri tramite un'ansa e poi incubata in un termostato (nei laboratori questa tecnica è completamente automatizzata).

• Ricerca di macromolecole mediante l'utilizzo di tecniche immunologiche per identificare e quantificare le componenti proteiche e polisaccaridiche dei microrganismi, in particolare è possibile utilizzare degli anticorpi monoclonali specifici fluorescenti coniugati con isotiocianato di fluoresceina oppure anticorpi legati ad enzimi come la perossidasi.

  Attualmente, esiste una tecnica automatizzata per l'identificazione dei microrganismi basata sulla spettrometria di massa detta MALDI-TOF.

• Esame molecolare permette di identificare e quantificare i genomi specifici dei microrganismi nei vari materiali patologici; sono presenti alcune tecniche di ibridazione con sonde di acidi nucleici ma la tecnica con la maggiore sensibilità e specificità è la PCR (Polymerase Chain Reaction), inventata da Kary Mullis nel 1983, che permette di misurare la quantità di acidi nucleici sia alla fine della reazione sia durante ogni diverso ciclo di amplificazione.

  Nota Bene: L'evoluzione degli esami molecolari ha permesso l'automatizzazione e la miniaturizzazione dei test rapidi che permettono di eseguire velocemente, con facilità e a basso costo dei test di identificazione microbiologica, ma anche l'integrazione con nuove tecnologie che permettono la tipizzazione dei ceppi, l'analisi del resistoma e del microbioma.

• Saggio di sensibilità ai principali farmaci antibatterici.

Esame microbiologico-virologico indiretto

L'esame microbiologico-virologico indiretto o sierologico permette di misurare la risposta anticorpale nel siero del paziente in seguito ad un'infezione anche se risulta molto difficile diagnosticare un’infezione in atto con questa metodica in quanto potrebbero non essere ancora presenti gli anticorpi per cui è necessario effettuare due prelievi ematici per valutare la presenza di IgM specifiche ed un aumento del titolo anticorpale di almeno 4 volte.

Test di prima generazione

• Reazione di precipitazione su gel o mediante l'utilizzo di anticorpi radio-marcati in cui gli anticorpi si legano all'antigene solubile formando un precipitato insolubile che può essere quantificato sulla base della quantità di proteine o della radioattività.

• Reazione di agglutinazione diretta in cui si aggiunge al campione degli anticorpi specifici che riconoscono delle molecole di superficie dei microrganismi permettendo la formazione di aggregati.

• Reazione di agglutinazione passiva in cui determinati antigeni sono adesi su particelle inerti (colloide o lattice) che tendono ad agglutinarsi in seguito all'aggiunta di un siero contenente gli anticorpi specifici; ne sono esempio il VDRL (Venereal Disease Research Laboratory), il RPR (Rapid Plasma Reagin) ed il TPPA (Treponema Pallidum Particle agglutination Assay) che sono utilizzati per la diagnosi della sifilide.

• Reazione di emoagglutinazione passiva in cui determinati antigeni sono fissati sulla superficie dei globuli rossi che tendono ad agglutinarsi in seguito all'aggiunta di un siero contenente gli anticorpi specifici; ne è esempio il TPHA (Treponema Pallidum Haemagglutination Assay) utilizzato per la diagnosi della sifilide.

• Reazione di immobilizzazione in cui il siero del paziente è messo a contatto con una sospensione del microrganismo e con il complemento in modo che in presenza degli anticorpi specifici si verifichi la fissazione del microrganismo.

• Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione è utilizzata per identificare alcuni virus in grado di provocare l'agglutinazione del sangue grazie alla presenza di recettori capaci di legarsi alla superficie dei globuli rossi, quindi aggiungendo al campione degli anticorpi specifici per le emoagglutinine è possibile indurre l'inibizione dell'emoagglutinazione se tali proteine sono presenti sul virus.

• Reazione di fissazione del complemento in cui le proteine del complemento sono eliminate dal siero del paziente mediante un riscaldamento a bagnomaria a 58°C per 30 minuti, poi si aggiunge al campione l'antigene ed il complemento che sono incubati overnight a 4°C per permettere l'attivazione del complemento e la sua fissazione nel caso in cui siano presenti gli anticorpi di interesse; il giorno successivo si aggiungono i globuli rossi (solitamente di montone) e degli anticorpi anti-globuli rossi in modo che se nel siero non sono presenti gli anticorpi di interesse il complemento è utilizzato per la lisi dei globuli rossi, mentre se nel siero sono presenti gli anticorpi di interesse le proteine del complemento sono già state utilizzate per la lisi delle cellule presentanti l'antigene e non si verifica la lisi eritrocitaria.

• Metodi radioimmunologici in cui si utilizzano degli anticorpi specifici per un antigene marcati con sostanze radioattive.

Test di seconda generazione

• Test immunometrici come EIA (Enzyme ImmunoAssay), ELISA (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay) e MEIA (Microparticle Enzyme ImmunoAssay) che utilizzano un anticorpo legato ad un tracciante enzimatico, CMIA (Chemioluminescent Microparticle ImmunoAssay) e CLIA (Chemioluminescence ImmunoAssay) che utilizzano un anticorpo legato ad un tracciante chemioluminescente ed ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay) che utilizza un anticorpo legato ad un tracciante fluorescente; tali test sono utilizzati per lo screening delle patologie.

• Immunoblot o Western blot è un test utilizzato come conferma della diagnosi in cui si esegue una corsa elettroforetica delle proteine derivanti da una sospensione del microrganismo che sono trasferite su un foglio di nitrocellulosa che è esposto ad una serie di anticorpi marcati specifici per evidenziare l'eventuale presenza della proteina di interesse.

• Test di avidità delle immunoglobuline è un test utilizzato come conferma della diagnosi che si basa sul principio secondo cui le immunoglobuline subiscono un aumento dell'affinità di legame per l'antigene durante l'evoluzione della risposta immunitaria, infatti le immunoglobuline prodotte nella fase acuta presentano una minore forza di legame all'antigene (cioè una minore avidità), mentre le immunoglobuline prodotte da molto tempo presentano una maggiore forza di legame (cioè una maggiore avidità).

Le infezioni delle vie respiratorie

Le vie respiratorie possono infettarsi frequentemente a causa di patogeni specializzati che presentano capacità adesive, capacità di interferire con il moto delle ciglia, di resistere ai macrofagi alveolari e di indurre un danno tissutale locale a livello della mucosa o dei tessuti mucosali tramite la produzione di tossine come lo Streptococcus pneumoniae, il Mycoplasma pneumoniae, la Chlamydia pneumoniae, la Bordetella pertussis, la Legionella Pneumophila, il Mycobacterium tubercolosis ed il Corynebacterium diphteriae oppure a causa di patogeni opportunisti che presentano caratteri di patogenicità solo in caso di immunocompromissione come lo Staphylococcus aureus, lo Pseudomonas aeruginosa, l'Haemophilus influenzae, il Citomegalovirus, il Cryptococcus neoformans e l'Aspergillus.

Le infezioni respiratorie sono possibili ad ogni livello, in particolare le infezioni delle alte vie comprendendo anche l'orecchio medio ed i seni paranasali e riguardano nel 75% dei casi delle faringiti da virus ma sono presenti anche delle otiti, sinusiti ed epiglottiditi da batteri, mentre le infezioni delle basse vie aeree riguardano principalmente bronchiti e polmoniti di origine batterica e delle polmoniti fungine (soprattutto nei pazienti immunocompromessi).

Inoltre, le infezioni delle vie respiratorie presentano un pattern stagionale a seconda del microrganismo che le causa, ad esempio nel periodo invernale sono frequenti delle infezioni da Haemophilus, da Morexella, da Pneumococco, da Staphylococcus, da Virus dell'Influenza A e B, da Virus Respiratorio Sinciziale (RSV) e dai Virus Parainfluenzali di tipo 1 e 2, mentre nel periodo estivo sono maggiormente presenti le infezioni da Legionella, da Enterovirus e da Virus Parainfluenzale di tipo 3.

Principali quadri patologici delle vie respiratorie superiori

• Rinite (noto come raffreddore) è il più comune processo infettivo a carico della cavità nasale e presenta nel 90% dei casi un'eziologia virale dovuta a Rhinovirus e Coronavirus ma anche da Adenovirus, Virus parainfluenzali, Virus influenzali, Virus respiratorio sinciziale e Coxsackie A, mentre sono rare le riniti ad eziologia batterica.

• Faringite (noto come mal di gola) è un processo infiammatorio a carico della faringe, dell'ipofaringe, dell'ugola e delle tonsille e presenta nell'80% dei casi un'eziologia virale dovuta a Adenovirus, Virus Parainfluenzali, Virus Influenzali, Rhinovirus, Coxsackie A e B, Herpes Simplex Virus ed Epstein-Barr Virus, ma sono presenti anche delle infezioni ad eziologia batterica dovute a Streptococcus pyogenes ed a Corynebacterium diphteriae.

• Laringite è un processo infettivo a carico della laringe con frequente coinvolgimento della trachea e dell'area sub-glottidea (associata anche ad abbassamento della voce, bruciore, afonia e febbre) ed il Croup è un'ostruzione delle vie aeree a livello faringeo dovuto ad un edema infiammatorio (tipico dei bambini in cui le vie aeree sono più strette) e presentano nel 90% dei casi un'eziologia virale dovuta a Virus Parainfluenzali di tipo 1, 2 e 3, a Virus Influenzali, Adenovirus, Rhinovirus, Coronavirus ed occasionalmente a Virus Respiratorio Sinciziale, mentre sono rare le laringiti ad eziologia batterica.

• Epiglottidite è un processo infettivo che causa l'ingrossamento e l'arrossamento dell'epiglottide con frequente occlusione completa delle vie respiratorie (soprattutto nei soggetti più piccoli) e presenta nel 90% dei casi un'eziologia batterica dovuta a Haemophilus influenzae (che da solo copre più dell'85% dei casi), a Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae ed a Corynebacterium diphteriae, mentre l'epiglottiditi a eziologia virale rappresentano solo il 10% dei casi.

• Otite media acuta si manifesta con dolore, febbre, otorrea (fuoriuscita di pus dal condotto uditivo esterno) ed infiammazione della membrana timpanica soprattutto in età pediatrica e presenta un'eziologia prettamente batterica dovuta a Streptococcus pneumoniae, agli Streptococchi di gruppo B, a Haemophilus influenzae ed a Moraxella Branhamella catarrhalis (non sono conosciuti virus che causino un'otite media acuta).

• Sinusite è un processo infiammatorio a carico delle mucose dei seni paranasali associata a rinorrea spesso purulenta, edema periorbitale e raramente a febbre e presenta un'eziologia prettamente batterica dovuta a Streptococcus pneumoniae (è il patogeno più frequente), a Haemophilus influenzae, a Streptococcus pyogenes ed a Moraxella Branhamella catarrhalis (non sono conosciuti virus che causino sinusite).

• Stomatite è un processo infiammatorio della mucosa del cavo orale ad eziologia virale, batterica o micotica.

Principali quadri patologici delle vie inferiori

• Empiema è una raccolta di pus in una cavità naturale dell'organismo come a livello dello spazio pleurico dovuto principalmente ad un'infezione da Klebsiella pneumoniae, da Escherichia coli, da Proteus, da Salmonella e da Staphylococcus aureus.

• Ascesso polmonare è un processo suppurativo localizzato a livello del parenchima polmonare caratterizzato dalla necrosi del tessuto circostante e dovuto principalmente ad un'infezione da Streptococco e da Staphylococcus aureus.

• Bronchite acuta è un'infiammazione della mucosa bronchiale caratterizzata da tosse generalmente preceduta da un'infezione delle vie aeree superiori e presenta sia un'eziologia virale dovuta a Virus Influenzali A e B, a Virus Parainfluenzali, Adenovirus, Rhinovirus, Virus del morbillo e Virus Respiratorio Sinciziale sia un'eziologia batterica dovuta a Bordetella pertussis, a Haemophilus influenzae, a Moraxella catarrhalis, a Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae e a Chlamydia pneumoniae.

• Polmonite acuta è un'infezione del parenchima polmonare ad insorgenza acutissima (nel giro di alcuni giorni) associata a malessere, tosse con escreato, febbre ingravescente o improvvisa, segni disfunzionali quali dispnea, aumentata freq...