Microbiologia clinica

Concetti generali ed influenza

La microbiologia clinica è l'applicazione della microbiologia, punta sulla conoscenza di: patologia, patogenesi, diagnostica, eventuale terapia e prognosi. "Nella scienza bisogna ricercare le idee, se non ci sono idee non c’è scienza". "La conoscenza dei fatti ha valore solo quando questi fatti mi portino ad avere delle idee". "Fatti senza idee impigriscono la mente": non potete ricordare tutto ciò che si studia in medicina, dovete avere delle colonne e delle fondamenta che vi portino al ragionamento, male cercare di ricordare a tutti i costi perché potreste ricordare male.

Con un colpo di tosse emettiamo 3000 goccioline di flugge che viaggiano a 75 km/h (la gocciolina è saliva micronizzata e può rimanere in aria per un certo periodo di tempo). Nello starnuto ci sono 40.000 goccioline che viaggiano a 320 km/h e in ogni gocciolina ci sono 200 milioni di particelle virali di tipo influenzale.

Possiamo avere l'infezione senza malattia ma non la malattia infettiva senza l'infezione. Ci sono persone che pur non avendo mai avuto l'herpes labialis sono convinti di non averlo mai contratto. Questi soggetti non hanno mai avuto la manifestazione perché probabilmente possiedono gli anticorpi. In effetti nell'80% della popolazione si ha una positività agli anticorpi dell'herpes labialis. È importante avere una carica infettante di rilievo perché compaia la patologia. In caso in cui il paziente abbia le difese immunitarie indebolite l'infezione può essere causata anche da un numero più basso di agenti infettanti.

Concetti sull'influenza aviaria

Negli ultimi anni sono passati sotto l'occhio dell'opinione pubblica due virus influenzali di tipo A molto importanti: l'H1N1 (virus dell'influenza suina) e l'H5N1 (virus dell'influenza aviaria). Il primo è un virus che contagia facilmente sia il maiale che l'uomo, ma che ha una scarsa virulenza. Il secondo invece contagia facilmente gli uccelli ed ha una fortissima virulenza, con un alto tasso di mortalità.

Da cosa è nata tutta la preoccupazione per l'influenza aviaria, dato che non contagia l'uomo? È nata dal fatto che l'H1N1 e l'H5N1 avrebbero potuto infettare contemporaneamente un maiale e ricombinare geneticamente tra di loro. Il risultato della ricombinazione sarebbe stato un virus con la stessa contagiosità dell'H1N1 e con la stessa virulenza di H5N1. Si sarebbe presentata una pandemia con una mortalità del 50%. Specifichiamo che la ricombinazione genica nel maiale può avvenire solo con virus influenzali di tipo A, perché gli altri virus influenzali non possiedono serbatoi negli animali.

L'H1N1 ha causato varie epidemie nella storia. Ricordiamo l'epidemia del 1918 (la cosiddetta spagnola) e l'epidemia del 2009 (la cosiddetta suina). Precisiamo che la spagnola ha mietuto molte più vittime della suina, facendo una vera e propria strage. Ma se il virus che ha causato le due epidemie è lo stesso, come mai c'è stata questa differenza nel numero di morti? La spiegazione potrebbe essere che il virus ha subito delle mutazioni genetiche nel corso del tempo, ma il professore sostiene che nel 1918 le condizioni igieniche e lavorative erano nettamente peggiori rispetto al 2009, per cui l'infezione del virus avrebbe causato la suscettibilità ad altri tipi di infezioni, batteriche ad esempio, che avrebbero portato le persone infette alla morte.

A proposito dell'influenza aviaria invece mi sorgono dei dubbi. I primi casi di contagio umano di influenza aviaria si sono avuti nel 2003. Il professore ha raccontato di come nei paesi orientali vi sia un forte consumo di pollo (addirittura è usanza bere il sangue del volatile appena ucciso), e quindi di come in quei paesi vi sia maggior probabilità di contrarre l'influenza aviaria. Il mio dubbio è: dato che le nostre cellule non sono suscettibili all'H5N1 come facciamo a contagiarci di influenza aviaria? Non dovremmo rimanere indifferenti al virus anche dopo averlo ingerito?

Nel mondo dal 2004 al 2008 ci sono stati 376 casi di influenza aviaria con 238 morti.

Concetti di virologia generale

I virus sono dei parassiti endocellulari obbligati ed hanno bisogno di una cellula vitale per sopravvivere. Essi sfruttano l'apparato biosintetico della cellula per replicarsi. I virus sono ricoperti da una struttura proteica detta capside. Esso ha due funzioni:

• Protezione: viene protetto l'acido nucleico dall'aggressione di nucleasi, presenti ovunque.
• Antirecettorialità: permette l'adesione del virus ad una cellula. L'antirecettore è una struttura proteica la cui funzione è quella di aderire alla cellula ospite da infettare. Esso si lega in maniera specifica nei confronti di un recettore cellulare, e quindi permette l'inizio dell'infezione. La penetrazione senza antirecettore può avvenire solo in maniera artificiale.

Il capside è formato da sub-unità dette capsomeri. Alcuni virus possono avere un rivestimento lipoproteico esterno detto pericapside (o envelope). I virus muniti di pericapside sono detti virus rivestiti, mentre quelli senza pericapside sono detti virus nudi. Specifichiamo che i virus rivestiti presentano l'antirecettore sul pericapside, e non sul capside. I virus rivestiti sono meno resistenti in ambiente esterno, perché il pericapside è costituito da lipoproteine e dunque è aggredibile da qualsiasi agente lesivo: solventi, agenti chimici, agenti fisici, ecc.

Data la loro scarsa resistenza all'ambiente esterno i virus con pericapside sono trasmessi per via diretta (cioè una via che implica il contatto tra sorgente del virus ed organismo da infettare): rapporto sessuale, trasfusione, contatto di fluidi corporei, per via aerea, ecc. I virus nudi invece resistono meglio all'ambiente esterno, per cui possono essere trasmessi per via indiretta (cioè una via che non implica il contatto tra sorgente del virus ed organismo da infettare): acqua, alimenti, feci, fomiti, vettori (solitamente insetti).

L'HIV, l'HBV e l'HCV sono esempi di virus che si trasmettono per via diretta. Gli enterovirus invece sono un esempio di virus a trasmissione indiretta (perché vengono trasmessi per via oro-fecale).

Parlando dei virus definiamo alcuni concetti principali:

• Spettro d'ospite: è rappresentato dalle specie che un virus è in grado di contagiare. Ci sono dei virus specie-specifici che infettano solo una specie (ad esempio il CMV umano contagia solo la specie umana). Altri virus invece sono in grado di contagiare più specie (ad esempio il virus influenzale umano contagia sia l'uomo che il maiale).
• Tropismo: è rappresentato dai tipi di cellule che il virus è in grado di infettare all'interno dell'organismo ospite. Ad esempio alcuni virus infettano solo le cellule nervose e non quelle muscolari.
• Suscettibilità: capacità di una cellula di permettere la penetrazione di un virus.
• Permissività: capacità di una cellula di permettere la replicazione di un virus.

Le fasi dell'infezione virale sono:

1. Penetrazione.
2. Denudamento.
3. Replicazione del genoma.
4. Assemblaggio.
5. Maturazione.
6. Rilascio.

Orthomixoviridae

Orthomixoviridae è la famiglia dei virus influenzali (che comprende i virus dell'influenza A, B e C), che sono dei virus a simmetria elicoidale. L'orthomixovirus ha un genoma composto da RNA monocatenario di senso negativo frammentato. I virus influenzali A e B hanno il genoma diviso in 8 frammenti, mentre il virus influenzale C ha il genoma diviso in 7 frammenti. Il virus influenzale ha un capside a simmetria elicoidale, ed è munito di pericapside.

Facciamo un ragionamento su questo virus:

• Il virus influenzale diffonde in modo estremamente efficace.
• Dato che diffonde così efficacemente, in pochi anni la maggior parte della popolazione potrebbe essere contagiata ed infettata da questo virus.
• Tutti i soggetti infetti sviluppano l'immunità nei confronti del patogeno (l'immunità per l'influenza è rivolta nei confronti dell'emoagglutinina e/o della neuroamminidasi).
• Se il virus dell'influenza fosse un virus stabile (cioè che non subisce molte mutazioni), in queste condizioni potrebbe estinguersi, perché la maggior parte della popolazione risulterebbe immunizzata, e senza nuovi soggetti da infettare il numero di virus circolanti si ridurrebbe a zero. In realtà il patogeno ha un ottimo tasso di mutazione, per cui, ad ogni nuova epidemia, il virus presenterà delle proteine mutate, ed il sistema immunitario dei soggetti già infettati una volta non è in grado di riconoscere il virus, quindi quest'ultimo è in grado di contagiare nuovamente gli stessi ospiti che aveva già infettato. Le mutazioni del virus influenzale avvengono per antigenic drift ed antigenic shift.

Campionamento in virologia

Uno degli argomenti più importanti in microbiologia clinica è certamente la raccolta dei campioni biologici. Se il campione viene mal trattato o mal trasportato darà risultati alterati. Il campionamento biologico è fondamentale in quanto grazie ad esso il microbiologo è in grado di fare una diagnosi differenziale e di intervenire con una terapia adeguata. La diagnosi differenziale è fondamentale, perché permette di capire quale sia l'agente etiologico della malattia. Una volta effettuata la diagnosi, il paziente va trattato con il farmaco adeguato, e se questo non fosse disponibile (o addirittura non esistesse) l'unica cosa da fare sarebbe intervenire con meccanismi naturali, ed evitare l'immunodepressione del soggetto.

È importante mantenere vivo e sano il sistema immunitario del paziente, altrimenti i virus sarebbero enormemente facilitati nell'effettuare l'infezione. Al microbiologo clinico spesso non importa conoscere il ceppo esatto del virus diagnosticato, ma importa conoscere la famiglia virale, in modo da somministrare la terapia esatta (se esiste). Ad esempio non è importante sapere se il paziente è affetto dal virus influenzale H1N1, H3N2 o HxNy perché tanto la terapia sarà comunque la stessa: trattamento con inibitori della neuroaminidasi.

Spesso le infezioni virali sono autolimitanti (cioè guariscono da sole, grazie all'azione del sistema immunitario). Quindi spesso la diagnosi ha un'utilità solo dal punto di vista differenziale. Nel caso in cui l'infezione non sia autolimitante è preferibile evitare terapie inutili (che non hanno nessuna azione distruttiva nei confronti del patogeno) perché si rischia solo di compromettere il sistema immunitario del paziente. Quando invece si intraprende una terapia corretta, è meglio eseguirla correttamente somministrando i farmaci anche una settimana dopo la scomparsa dei sintomi. In questo modo si evita la comparsa di ceppi resistenti del patogeno. In Inghilterra, anni fa, con gli inibitori della neuroaminidasi sono nati ceppi resistenti a non finire. La diagnosi è costosa, ma meno costosa di un ricovero.

È fondamentale che il campionamento biologico sia effettuato in maniera corretta, perché altrimenti si rischierebbe di falsare il test, generando dei falsi positivi, o peggio dei falsi negativi. In generale il campione microbiologico è rappresentato da materiale biologico o ambientale che viene analizzato per la ricerca di microrganismi. L'analisi del campione può puntare alla ricerca di agenti patogeni, o alla ricerca di anticorpi presenti nel paziente. Il campione biologico deve presentare quattro caratteristiche fondamentali:

• Qualità: essa viene definita da una esecuzione appropriata del campionamento, e dipende da come e quando esso viene effettuato. Dato che i virus sono dei parassiti endocellulari obbligati, più cellule vitali ottengo dal campionamento meglio è. Quando provo ad individuare un virus in un campione posso cercare il virione completo, il DNA, l'RNA, le proteine del capside, oppure posso creare una coltura cellulare da fare infettare al patogeno presente nel campione, e cercare di fare diagnosi in base all'effetto citopatico che si viene a creare.
• Sterilità: il campione non deve essere contaminato con altri agenti infettanti. Infatti esso, dopo il prelievo, viene subito riposto in un contenitore sterile ed adatto alla conservazione. Se il campione dovrà essere utilizzato per la ricerca di acidi nucleici allora il tampone dovrà anche essere privo di nucleasi. Molti tamponi per virus contengono antimicotici ed antibiotici, per cui è fortemente sconsigliato usare dei tamponi da virus per fare dei prelievi di batteriologia o di micologia.
• Mantenimento: nel caso in cui il campione dovrà essere utilizzato per la ricerca di virioni completi esso dovrà essere mantenuto tra i 4 e gli 8 °C. Se invece il campione dovrà essere utilizzato per la ricerca di acidi nucleici bisognerà fare massima attenzione, e conservarlo in contenitori "nucleasi-free" (cioè senza enzimi che degradano gli acidi nucleici). La temperatura a cui va conservato il campione varia in base a diversi fattori come:
  • Tempo di trasporto: se esso è minore di 6 ore si preferisce mantenere il campione a 4-8 °C. Se invece è superiore a 6 ore si preferisce congelare il campione.
  • Tipo di analisi del campione: ci sono delle procedure di analisi del campione che necessitano di cellule integre (come l'immunofluorescenza esfoliativa), per cui il congelamento non può essere effettuato. Altre metodiche invece non necessitano di cellule integre per cui il congelamento può essere tranquillamente effettuato.

  Nota: in caso di emergenza un campione biologico si può isolare anche con granita e brioches: si pone il tampone chiuso dentro uno strato di granita e si pone il tutto dentro una brioches (che fa da isolante termico).

• Trasporto corretto: è fondamentale evitare di sottoporre il campione a stress durante il trasporto (come ad esempio sbalzi di temperatura). Tutti i campioni patologici, in particolare quelli virali, devono arrivare al laboratorio in tempi brevi e devono essere mantenuti ad una temperatura bassa. Nota: per il trasporto batteri non c'è bisogno di mantenere una temperatura bassa, a parte per il trasporto di Lysteria Monocytogenes. Questo batterio infatti è in grado di sopravvivere anche a temperature di 4 °C, per cui trasportando il campione a temperature basse moriranno tutti i batteri tranne Lysteria, ed il campione risulterà più "pulito".

Una volta che il campione arriva in laboratorio si procede con la diagnosi, che può essere di due tipi:

• Diagnosi diretta: evidenzia la presenza dell'agente infettante nell'organismo. Alcuni esempi di diagnosi diretta sono l'isolamento del virione dal campione biologico (che tuttavia è una procedura poco sensibile e che richiede tempo) o la ricerca delle sue componenti (acidi nucleici e proteine). La diagnostica molecolare è molto più efficiente e veloce rispetto alla ricerca del virione.
• Diagnosi indiretta: evidenzia la presenza dell'agente infettante attraverso segni indiretti dell'infezione (come ad esempio la presenza di anticorpi). Il rilevamento di anticorpi è una metodica sensibile e che richiede tempi brevi.

Ecco una tabella che indica quali sono i campioni preferenziali per la diagnosi di vari tipi di virus:

Vediamo ora i vari tipi di campionamento in base al sito di raccolta del campione:

• Apparato respiratorio: nel caso dell'apparato respiratorio i vari tipi di campione che si possono prelevare sono:
  1. Secrezioni naso-faringee: sono raccolte inserendo nelle cavità nasali un sondino aspirante molto morbido con fenestrazioni laterali, che arriva sino alla faringe. Arrivato qui il sondino raccoglie il muco e le cellule esfoliate della mucosa. Essendo i virus dei parassiti endocellulari obbligati, è necessario avere sempre un campione ricco di cellule. Se questo tipo di prelievo si fa su neonati, si capisce di esser arrivati alla faringe quando il bambino comincia a piangere.
  2. Lavaggio bronco-alveolare (BAL): è un sistema invasivo da effettuare solo in caso di estrema necessità. Il BAL può essere fatto solo da specialisti (pneumologi e chirurghi toracici): esso si effettua tramite un broncoscopio, grazie al quale si versa una piccola quantità di fisiologica nei bronchi. Il liquido poi sarà aspirato dallo stesso broncoscopio.
  3. Tamponi nasali o faringei: per il prelievo di tamponi naso faringei è opportuno usare una abbassalingua ed occorre badare ad eventuali getti di vomito. Il tampone non deve asciugarsi (per cui va sospeso in pochissima fisiologica o viene messo in un terreno di trasporto adatto). Il terreno per i tamponi virologici presentano antibiotici ed antifungini, mentre i terreni per i tamponi batterici sono terreni agarizzati.

  Nel campionamento dell'apparato respiratorio in batteriologia il campione ideale è costituito da un tampone nasale o faringeo se il patogeno infetta le alte vie respiratorie, evitando di toccare le tonsille e tutto ciò che non ha molto a che vedere con la patologia causata dal batterio che si vuole analizzare. Nel campionamento dell'apparato respiratorio in virologia il campione ideale è costituito dalle secrezioni nasofaringee.