Microbiologia clinica

Microbiologia clinica

Batteriologia

I batteri si classificano in base a:

• Proprietà tintoriali: Colorazione di Gram +/- (in base a parete di peptidoglicani) e Ziehl-Nielsen (micobatteri)
• Morfologia e modalità di rapporti con gli altri microrganismi
• Caratteri metabolici: rapporto con ossigeno - aerobi stretti / anaerobi obbligati / aerobi e anaerobi facoltativi

Streptococcus spp.

- Cocchi Gram +

- Disposti in coppie o catenelle (anche a coppie = diplococchi)

- Capsulati (capsula = struttura non essenziale, ma accessoria. Strato più esterno di natura polisaccaridica. Importante fattore di patogenicità, in vitro può essere persa)

- Immobili

- Asporigeni

- Aerobi/anaerobi facoltativi con metabolismo fermentativo

- Ossidasi-negativi – ossigeno non tossico, ma non eseguono respirazione cellulare

- Catalasi-negativi

- Esigenti dal punto di vista nutrizionale - importante nella scelta dei terreni di coltura, che devono essere molto nutrienti (es., agar sangue)

Localizzazione: cavo orale e faringe. S. pyogenes, S. agalactiae e S. pneumoniae patogeni.

Classificazione Streptococcus spp.

• Rapporto con emolisi prodotta in agar-sangue:
  • Alfa-emolitici determinano emolisi incompleta, viraggio al verde: S. pneumoniae
  • Beta-emolitici emolisi completa, alone trasparente: S. pyogenes
  • Gamma-emolitici: assenza di emolisi (es.: Enterococcus faecalis)
• Sulla base del tipo di antigene polisaccaridico contenuto nella parete: carboidrato C di parete classificazione di Lancefield - 20 gruppi sierologici identificati con lettere dell’alfabeto (A-H, K-V):
  • Gruppo A: S. pyogenes
  • Gruppo B: S. agalactiae
  • Gruppo C: S. equisimilis
  • Gruppo D: E. faecalis, E. faecium, S. bovis
  • Gruppo G: S. anginosus
  • S. pneumoniae non possiede l’antigene C

Streptococchi più rilevanti

• S. pyogenes (Gruppo A)
• S. agalactiae (Gruppo B)
• S. pneumoniae
• Streptococchi viridanti

Streptococcus pyogenes

Streptococco beta-emolitico con antigene polisaccaridico gruppo A. Batterio a circolazione interumana. Localizzazione orofaringea - portatori sani (faringei) è di 4-25% e può raggiungere il 40-60% in alcune comunità infantili.

Capsula e proteina M

Capsula: acido ialuronico (importante perché il nostro organismo non svilupperà Ab per la capsula, essendo acido ialuronico il costituente nel nostro connettivo).

Proteina M: fibrillare, da superficie cellulare forma estensioni filiformi, distingue in vari tipi (M1, M2…)

Fattori di patogenicità/virulenza

• Punti chiave della virulenza: adesione alla superficie della cellula ospite, invasione di cellule epiteliali, elusione dell’opsonizzazione e della fagocitosi, produzione di una varietà di enzimi e tossine.
• Capsula: acido ialuronico (non immunogenica) con attività antifagocitaria.
• Componente di superficie/parete:
  • Acido Lipoteicoico (LTA) – ruolo di adesina (per adesione a superficie dell’ospite), tossico per numerosi tipi cellulari.
  • Carboidrato C – rappresenta i 2/3 della parete. Cross-reagisce con una proteina delle cellule delle valvole cardiache se organismo produce Ab verso il carboidrato C, autoimmunità verso valvole cardiache.
  • Proteina F – ruolo di adesina/penetrazione.
  • Proteina M – principale fonte di virulenza. Forma filamentosa, la parte terminale è quella più variabile. Effetti anti fagocitanti. Molto immunogena. Proteine M di classe I e II – associate a vari tipi di patologie.

Endotossina ed esotossine

Endotossina: LPS in Gram -

Esotossine: molecole proteiche prodotte da batteri ma rilasciate all’esterno.

• Esoenzimi (esotossine):
  • Streptolisina O (ossigeno-labile) Tossina proteica enzimatica ad attività citolitica = citolisine. Immunogena – titolo antistreptolisina O per diagnosi S. pyogenes. Degrada PMN, emazie, macrofagi, piastrine.
  • Streptolisina S (ossigeno-stabile)
  • Streptochinasi – importante fattore di diffusione
  • Desossiribonucleasi – degradano DNA
  • C5a peptidasi – inattiva processo infiammatorio degradando il fattore C5a del complemento
  • Ialuronidasi – importante per invasività
• Esotossine pirogeniche streptococciche (SPE) = tossine eritrogeniche. Esistono 4 tipi sierologici: SpeA, SpeB, SpeC, SpeD. Attivano simultaneamente tante popolazioni di linfociti = superantigeni. Responsabili dell’eritema della scarlattina.

Malattie S. pyogenes

Habitat: Orofaringe

Ospite: Uomo

Trasmissione: Contatto interumano per via aerogena

Malattie suppurative

• Malattie causate da batterio presente in ospite
  • Localizzate: Faringo-tonsillite, Impetigine, Scarlattina
  • Invasive: Erisipela, Fascite necrosante, febbre puerperale

Malattie post-streptococciche non suppurative

• Si manifestano dopo infezione/malattia suppurativa con batterio non presente nell’ospite
  • Glomerulonefrite acuta
  • Febbre reumatica – fenomeno autoimmune post infezione

Faringo-tonsillite (angina) streptococcica

Infiammazione con essudato purulento associato a tonsillite e reattività linfonodi

• Bambini +++
• Durata media 2 settimane
• Trasmissione = via aerogena
• Se infezione è sostenuta da ceppo produttore di tossine pirogeniche Spe Scarlattina
• In era pre-antibiotica complicanze suppurative comuni con gravi complicanze non suppurative
• Terapia: Penicillina

Scarlattina

Si verifica in individui che per precedenti infezioni da ceppi produttori di una diversa SPE abbiano sviluppato uno stato di ipersensibilità verso il componente comune delle SPE

• Eruzione cutanea caratterizzata da eritema diffuso con micropapule, viene risparmiata l’area intorno alla bocca (pallore circolare). Lingua a “lampone” con papille ben evidenti. Febbre per 5-10 giorni

Impetigine

Infezione cutanea superficiale

• Vescicole a grappolo croste color miele
• Bambini +++

Erisipela

Infezione dei tessuti cutanei e sottocutanei, ++ volto e arti inferiori. Può passare da sottocute a sangue

Fascite necrosante e shock tossico

Causate da ceppi produttori di SPE con abbondante capsula e generalmente tipo M1

• Fascite necrosante = necrosi cute e sottocute infetti con miosite e necrosi muscolare
• Shock tossico (prima chiamata sindrome puerperale) – coinvolti alcuni sierotipi (++ M1 e M3) che producono particolari esotossine pirogeniche. Le tossine attivano i linfociti T – citochine – vasodilatazione e ipotensione con compromissione multiorgano e morte.

Febbre reumatica

Base autoimmune che causa processi infiammatori ad articolazioni, cuore (pancardite) e alcuni tessuti cerebrali (corea).

• Sierotipi più coinvolti: M1, 3, 5, 6, 18.
• Quando microrganismo non è più presente, ci possono essere delle molecole Ab prodotto che hanno una certa cross-reattività con strutture dell’organismo, tali da scatenare poi una reazione autoimmune.

Glomerulonefrite acuta

Può comparire da 1-4 settimane dopo faringo-tonsillite o 3-6 settimane dopo l’infezione cutanea.

• Patogenesi autoimmune mediata da immunocomplessi. Gli immunocomplessi arrivano al rene, dove si legano all’endotelio glomerulare e, dopo aver attivato il complemento, scatenano una reazione infiammatoria + esposizione di epitopi normalmente nascosti che cross reagiscono con epitopi anti-proteina M vengono attaccati da cellule infiammatorie.
• Sintomi clinici – edema, ipertensione, ematuria, proteinuria. Lesioni glomerulari potenzialmente reversibili dopo mesi.

Diagnosi di laboratorio

• A. Campioni clinici
  • Tamponi faringei o cutanei
• B. Ricerca diretta del microrganismo
  • Colorazione di Gram, poco utile per molti commensali del faringe simili (= Gram + disposti a catenella)
  • Esame colturale – Agar sangue di pecora al 5% - 24-48h a 37°C colonie di circa 1-2 mm di diametro, spesso con aspetto mucoso circondate da alone di beta-emolisi.
• C. Identificazione del microrganismo – diagnosi diretta
  • Spettrometria di massa = certezza di riconoscimento (MALDI-TOF)
  • Test di sensibilità alla bacitracina
  • Identificazione sierologica del carboidrato C
  • Identificazione mediante immunofluorescenza del carboidrato C
• D. Diagnosi indiretta = Titolazione di anticorpi antistreptolisina O (! Associazione presenza Ab con malattie post-streptococciche).

Streptococcus pneumoniae (Pneumococco)

- Diplococco Gram + di forma lanceolata

- Capsulato, immobile, asporigeno

- Aerobi-anaerobi facoltativo

- Catalasi-negativo

- Streptococco alfa-emolitico

- Non ha il carboidrato C

Diagnosi

• A. Agar sangue con alfa-emolisi (incompleta) Necessitano microaerofilia, esigenze nutrizionali complesse.
• B. Colonie lisce, mucose, lucide, a goccia di rugiada – Fase S ceppi capsulati; Colonie rugose e opache – Fase R ceppi acapsulati. Quando colonie invecchiano, assumono aspetto a pedina di data con cratere centrale – pneumococco produce enzima (autolisina) che degrada la colonia.
• C. Identificazione:
  • Reazione di rigonfiamento capsulare (reazione di Neufeld) – utilizzando Ab anti-capsula, si usa anche per identificazione sierotipo (ogni sierotipo ha Ab specifici contro capsule di natura diversa)
  • Sensibilità all’optochina
  • Fermentazione inulina
  • Solubilità in bile – i Sali biliari attivano l’autolisina

Patologie da S. pneumoniae

• - Polmonite lobare
• - Otite media
• - Meningite batterica in adulto

Fattori di virulenza

• Componente polisaccaridica importante principale fattore di virulenza con attività antifagocitaria. Capsula Principale immunogeno con produzione di anticorpi anti-capsula che risultano protettivi. Sulla base degli antigeni capsulari, si distinguono 90 sierotipi, non tutti ugualmente patogeni e in dipendenza dei sierotipi, causano malattie diverse.
• Proteine di superficie (meno importante rispetto alla capsula)
  • Ialuronidasi e neuraminidasi: riduce viscosità del muco e favorisce esposizione di recettori cellule epiteliali
  • Proteine che legano la colina = Proteina A e C, autolisina: fattore di virulenza in quanto la lisi del batterio fa sì che vengano rilasciate altre sostanze virulente, contribuiscono a colonizzazione e virulenza
  • Lipoproteine
• Esoenzimi e tossine
  • IaA1-proteasi: idrolizza le IgA secretorie + riduce viscosità del muco in mucose = riduce risposta immunitaria primaria verso il patogeno
  • Pneumolisina: emolisina O, simile alla streptolisina. Responsabile dell’emolisi parziale su Agar sangue. Rilasciata in seguito a lisi batterica, non è una vera e propria esotossina.

Patogenicità S. pneumoniae

• Habitat: Vie aeree superiori – in portatori sani (che possono arrivare fino a 60% in bambini, 10% in adulti) rimane stanziale in questo distretto. In certe condizioni, si ha passaggio del patogeno nelle vie aeree inferiori = polmonite.
• Polmonite lobare: coinvolte lobi interi e, dopo eventuale guarigione, si ha una restitutio ad integrum del parenchima. Fattori predisponenti: compromissione difese apparato respiratorio:
  • Alterazione dell’apparato muco-ciliare (es. infezioni virali, fumo, sbalzi termici verso il freddo)
  • Rallentamento del riflesso epiglottale (es. morfina, anestesia, intossicazione alcolica)
  • Alterazione fagocitosi alveolare (es. tutto ciò che causa accumulo fluidi in alveoli)
• Arrivo in alveoli replicazione con diffusione interalveolare richiamo cellule infiammatorie e produzione essudato perpetuazione moltiplicazione estensione a tutto il lobo ed eventualmente agli altri lobi con consolidamento/congestione del parenchima interessato.
• La polmonite lobare ha vari stadi:
  • Consolidamento polmonare di un lobo
  • Epatizzazione rossa – il polmone prende aspetto simile al fegato grazie alla congestione vascolare nel lobo interessato.
  • Epatizzazione grigia – accumulo di fibrina + RBC + WBC
  • Risoluzione – riassorbimento dell’essudato quando vengono prodotti Ab specifici in grado di opsonizzare il microrganismo e renderlo meglio fagocitabile (fagocitosi Ab-mediata).
• Mortalità 30% senza terapia e 5% con terapia.
• Complicanze:
  • Pleurite con empiema
  • Batteriemia – molto grave in immunocompromessi, letale in splenectomizzati
  • Meningite
  • Endocardite e pericardite

Otite media

Comune nei bambini

Sinusite e mastoidite

Meningite

In Italia, sensibilità accettabile a vari antibatterici.

Farmaco resistenza

Prodotti utilizzando degli antigeni polisaccaridici della capsula. Scelti Ag di sierotipi più diffusi e più patogeni e mortali.

Vaccini

• Vaccino polisaccaridico (PPPV23): Ag polisaccaridici capsula contro 23 siero varianti. Efficace contro batteriemie, non efficace nei bambini e poco efficace contro polmonite.
• Vaccino coniugato (PCV13): Ag capsula + anatossina difterica (per aumentarne immunogenicità). Efficace contro 13 sierotipi. Protegge contro polmonite, otite media e patologia invasiva in bambini e adolescenti sia anziani.

Diagnosi

• BAL e espettorato oppure liquor (sospetto meningite)
• Colorazione di Gram – diplococchi Gram +. Poco utile in espettorato per contaminazione orofaringea, mentre molto utile per liquor (normalmente sterile).
• Test rigonfiamento capsulare
• Inchiostro di China
• Agar sangue 24-48 h 37°C. Alfa-emolisi con depresse al centro come conseguenza di fenomeni di autolisi.
• Identificazione:
  • MALDI-TOF
  • Test di sensibilità all’optochina – sensibile 80%
  • Test di solubilità in bile
  • Reazione di rigonfiamento capsulare

Streptococcus agalactiae

• Streptococco beta-emolitico gruppo B
• Habitat: membro della normale flora batterica del tratto GE e genitale (++ femminile)
• Neonato quando passa nel canale del parto può infettarsi – meningite neonatale (nei mesi post-natali; 20-30% mortalità) + sindrome polmonare (nei primi giorni di vita; mortalità >50%)

Altri streptococchi

• Streptococchi gruppo D e Gen. Enterococcus: E. faecalis, E. faecium. Non emolitici. Possono provocare infezioni del tratto urinario. Importante infezione nosocomiale. Farmaco-resistenza VRE Vancomycin-resistant enterococci.
• S. alfa-emolitico: Infezione zoonotica che può causare meningite e setticemia. Streptococcus suis. Infezione tramite consumo di carne suina cruda. Farmaco-resistenza.
• Streptococchi viridanti: sia alfa- che beta-emolitici. Commensali dell’orofaringe con potenzialità patogena molto bassa. Patogenicità se batteriemia con endocarditi. Es. S. mutans, S. salivarius, S. milleri, S. oralis e S. sangui. Non hanno carboidrato C.

Staphylococcus spp.

Cocchi Gram-positivi disposti in ammassi irregolari, immobili, asporigeni, aerobi-anaerobi facoltativi – metabolismo fermentativo, alofili = resistenza ad elevate concentrazioni saline, catalasi-positivi. Causano principalmente infezioni cutanee suppurative, ma possono causare infezioni in altri distretti. Principali patogeni nosocomiali.

Staphylococcus aureus

- Principale patogeno per l’uomo. Implicato in gravi sindromi invasive – COAGULASI + e fermentazione della mannite.

- Altri Staphylococchi – flora normale della cute che possono diventare patogeni opportunisti nelle infezioni nosocomiali – COAGULASI - = CNS (coagulasi negative staphylococcus).

Terreni – Agar sale mannite inibiscono tutti i patogeni NON alofili e avendo la mannite S. aureus fermenta producendo acidi e facendo virare il pH. Gli altri staphylococchi non fermentano la mannite, che non acidificheranno il terreno, quindi rimane dello stesso colore.

Staphylococcus aureus

Produce un pigmento carotenoide giallo-arancio che conferisce alle colonie il colore caratteristico. Fermenta mannitolo e produce coagulasi – se aggiungiamo siero, coaguli di fibrina.

• Habitat: cute e mucose (++ vestibolo nasale anteriore)
• Malattia:
  • Infezioni suppurative cutanee ++
  • Malattie da tossine = intossicazione alimentare, sindrome della cute scottata e sindrome da shock tossico
  • Osteomielite
  • Polmoniti
  • Ascessi in vari organi (reni, cerebrali, epidurali)

Strutture di superficie

• Capsula
• Proteina A – importante per virulenza
• Clumping factor = fattore di coagulazione
• Ac. Tecicoico

Fattori di patogenicità

• Componenti cellulari:
  • Capsula – antifagocitaria
  • Proteina A – lega Ab nel frammento Fc = impedisce che Ab leghino la cellula e inibiscono opsonizzazione
  • Acidi tecoici – funzione di adesine (permette legame S. aureus a cellule epiteliali)
• Componenti extracellulari: tossine (danneggiano tessuti dell’ospite) ed enzimi (attività legata all’invasività)
  • Tossine citolitiche – agisce su RBC e altri tipi cellulari. Le tossine si uniscono tra loro formando una tossina alfa –