Microbiologia - Appunti

Microbiologia: lezione 1 - 01/03

La microbiologia studia organismi di dimensioni microscopiche: batteri, protozoi e miceti. Sono compresi anche i virus (parassiti non autonomi). Il punto di interesse sono i microrganismi patogeni anche se non sempre è chiaro il riconoscimento. Si distinguono i saprofiti che sono solo occasionalmente patogeni perché vivono nell'ambiente (temperatura); parassiti che sono patogeni; simbionti e/o commensali che sono normalmente non patogeni. Questi ultimi comprendono microrganismi normalmente presenti a popolare le superfici mucose esposte (vie aeree, orecchio esterno, intestino, vie genitali).

La colonizzazione comporta: il contrasto di specie patogene, stimolazione del sistema immunitario e apporto di vitamine. Nella maggior parte dei casi vi è la convivenza di più specie microbiche. L'equilibrio tra più specie a volte viene disturbato (terapie antibiotiche) con accumulo di sostanze tossiche. Nel cavo vaginale è presente un unico tipo di batterio (Lactobacillus) che consente tramite la produzione di acido lattico il mantenimento di un pH acido che impedisce l'impianto di altre specie microbiche. Il sistema immunitario viene stimolato da certi microrganismi.

La maggior parte delle malattie da microrganismi sono quelle da infezione ma vi sono anche quelle da intossicazione. L'infezione prevede diverse fasi: contaminazione, penetrazione, moltiplicazione ed infine il danneggiamento. Il batterio a questo punto può creare tossine o particolari enzimi. A questo punto è rilevabile l'infiammazione. A lungo tempo il sistema immunitario può danneggiare il tessuto stesso coinvolto. Le malattie da intossicazione prevedono l'ingestione di tossine pre-formate. La patogenicità è la possibilità di creare un danno ad un ospite sensibile. Gli individui refrattari sono una specie non sensibile all'agente patogeno.

All'interno di una specie sensibile vi possono essere individui resistenti: nel caso più semplice questi possono essere immunizzati. Nelle prime fasi della vita si è più sensibili a causa della scarsa esperienza di infezioni. Il microrganismo è patogeno in quanto nel suo genoma presenta fattori di patogenicità (che possono essere più o meno espressi a seconda del ceppo). Un ceppo può essere più virulento di un altro. La nostra arma contro i microrganismi patogeni sono i vaccini che presentano tossine modificate, microrganismi morti oppure a virulenza modificata o ridotta.

Il nostro organismo ha tre ordini di difesa: barriere naturali (cute, mucose). Le cellule più vecchie della superficie cutanea disquamandosi tendono a portare via i batteri presenti. Le secrezioni contribuiscono alla protezione. Le mucose rappresentano una barriera più debole ma sono coperte di muco in movimento (cellule vibranti). In alcuni distretti è presente un flusso dilavante (urina, feci, saliva ecc.).

Immunità congenita e inducibile

Il secondo livello è quello dell'immunità congenita (o costitutiva). Si tratta di un'immunità non inducibile ma sempre presente. Nonostante la sua bassa efficacia consente all'immunità inducibile di organizzarsi dimostrandosi fondamentale. L'ultimo livello è l'immunità inducibile che è la più efficace e specifica. L'immunità congenita è poco specifica e senza memoria. A questa forma di immunità contribuiscono fattori solubili (complemento, interferoni, lisozima), fagociti professionali (macrofagi, neutrofili) ed il processo infiammatorio. Lo scopo del processo infiammatorio è quello di limitare il processo infettivo modificando la permeabilità dei vasi e consentendo il passaggio delle cellule circolanti per diapedesi. Il pus è un accumulo di granulociti neutrofili. Anche la febbre può essere considerata un fattore di contenimento.

Esistono inoltre recettori detti PRR che sono in grado di riconoscere dei modelli batterici (strutture comuni a gruppi di batteri o virus). Si tratta di unità non specifiche. Per esempio vi sono recettori in grado di riconoscere la flagellina o il lipopolisaccaride (GRAM-). Altri ancora riconoscono l'RNA a doppia elica tipico di certi virus. L'ultimo livello, rappresentato dalla risposta immunitaria inducibile, è in grado di riconoscere macromolecole estranee (antigeni). Per contro tollera il "self".

Verso gli antigeni viene attivata una risposta specifica secondo una componente umorale (anticorpi) e cellulo mediata (macrofagi e linfociti citotossici). Una volta che il sistema specifico è venuto in contatto con un antigene ne conserva la memoria. La risposta immunitaria parte dalle cellule fagocitarie che fagocitano l'antigene, lo digeriscono ed espongono sulla superficie le singole componenti (quando le cose vanno bene). Se l'antigene è particolare il macrofago necessita di attivazione. Il macrofago presenta l'MHCII che lo "autorizza" ad esporre l'antigene sulla sua superficie. In questo modo con l'incontro con i linfociti T CD4 specifici per quel recettore, scatta l'interazione. Questo provoca la formazione di segnali verso i linfociti B che differenziano in plasmacellule (si tratta sempre di cellule per uno specifico antigene).

Contemporaneamente si attivano i T CD8 che diventano linfociti citotossici in grado di distruggere per contatto le cellule con quell'antigene. I T citotossici sono attivi unicamente verso le cellule che riconoscono come "self" che presentano l'antigene (cellula dell'organismo infettata). I linfociti natural killer attivati dai linfociti T, sono in grado di distruggere le cellule infettate da un virus anche se queste sono "non self". Gli anticorpi prodotti dalle plasmacellule sono di cinque tipi: IG G, M, A, D e E. Gli anticorpi sono gli effettori della risposta umorale.

Le IG sono composte da due catene leggere e due catene pesanti. Alle estremità sono presenti due FAB identiche per il riconoscimento dell'antigene. All'estremità opposta è invece presente la zona FC per il riconoscimento con il macrofago. Le IGG sono quelle classiche a Y. Le IGM presentano invece cinque subunità. Sono le prime prodotte durante la risposta immunitaria e le meno specifiche. Le IGA si trovano anche secrete dalle superfici mucose. Sulla superficie dei fagociti è presente un recettore per la zona FC. Gli anticorpi consentono la neutralizzazione dell'antigene e si attiva il complemento.

Lezione 2 - 02/03

Alcuni batteri che vengono fagocitati sono in grado di evitare la digestione e di lisare il macrofago. In questo modo la loro diffusione è facilitata. Tali macrofagi per una corretta digestione devono essere attivati dai TH1. I TH1 attivano anche i NK che riescono a lisare le cellule che presentano l'antigene anche se non sono appartenenti allo stesso organismo. Gli NK sono responsabili della risposta immunitaria cellulo-mediata dipendente da anticorpi. La risposta umorale è specifica per neutralizzare tossine mentre la cellulo-mediata è essenziale verso i virus ed i batteri intracellulari (oltre che il rigetto per i trapianti e la necrosi tumorale).

Aggressione e risposta immunitaria

Atto iniziale dell'aggressione di un patogeno è l'adesione che avviene tramite: adesine che riconoscono qualcosa di complementare (batteri) o recettori (virus). Possono anche essere presenti delle fimbrie (non mobili) per rendere più efficace il contatto (adesine). Molti batteri producono polisaccaridi che compongono la capsula che rappresenta un elemento di adesione aspecifico (rende difficili da parte del macrofago l'aggancio). Si tratta di uno strato di polisaccaridi che forma un glicocalice. La seconda tappa è l'invasione del tessuto: molti microrganismi producono fattori depolimerizzanti come collagenasi, lipasi ecc. Le DNAasi sono importanti per penetrare gli annessi di anticorpi morti (pus).

Un terzo passo è la capacità di sfuggire agli anticorpi. Vi sono mezzi di mimetismo esponendo fattori simili al nostro organismo (si possono scatenare patologie autoimmuni). Alcuni batteri hanno anche settori che legano la regione FC rendendo inefficaci gli anticorpi. Un altro trucco è quello di avere nel genoma un'ampia gamma di antigeni che espone sulla superficie. Ad una prima risposta immunitaria ne può seguire una seconda. La capsula del batterio la rende poco aggredibile; a volte è espresso un enzima coagulasi che consente la formazione di un coagulo intorno al batterio. Anche una volta fagocitato il batterio può sfuggire al fagosoma producendo lisine ed andando nel citoplasma. Altri microbatteri, invece, impediscono la fusione delle vescicole lisosomiali al fagosoma fermando la digestione.

Un'altra arma è la tossicità con la produzione di tossine verso una specifica cellula (neurotossine, enterotossine ecc.). Nello stabilirsi del processo infettivo è fondamentale la risposta anticorpale che è deficitaria nel batterio e nell'anziano. Le difese possono essere indebolite da alcol e droga. Anche i grandi ustionati sono a rischio di infezione. In questi casi anche un organismo poco patogeno può rivelarsi patogeno. Si tratta di un patogeno opportunista. Le malattie da infezione nella maggior parte dei casi possono essere trasmesse. Per trasmissione orizzontale si definisce quella diretta interumana per contatto. Alcune infezioni vengono trasmesse dalla madre al neonato durante la permanenza nel canale del parto. Si tratta in questi casi di trasmissione diretta.

L'indiretta è quella orofecale con ingestione di elementi contaminanti (colera, salmonella ecc.) o quella aerogena e mediata da vettori (spesso ematologi). La trasmissione verticale è quella germinale legata alla linea germinale, mediata tipicamente dai retrovirus o quella transplacentare. Le fonti di infezione possono essere esterne (cibi, bevande, oggetti ecc.) o interne per rottura di un equilibrio o per trasferimento di sede. La contaminazione può evolvere in vario modo: se supera le barriere diventa infezione, viceversa il soggetto diventa portatore. L'infezione dopo un periodo di incubazione può diventare una malattia conclamata o silente. La malattia può essere acuta o cronica. Al termine della malattia è presente la convalescenza. Durante l'incubazione vi può essere trasmissione. In molti casi il microrganismo può permanere anche durante la convalescenza.

I batteri hanno dimensioni che oscillano intorno ad 1µm e sono visibili solo al microscopio. Essendo organismi procarioti, manca la membrana nucleare, hanno nella maggior parte dei casi un solo cromosoma circolare ed il citoplasma è molto più semplificato. I ribosomi sono 70S. La membrana citoplasmatica manca di steroli ed al di fuori hanno una parete rigida contenente peptidoglicano (solo i batteri lo contengono). Gli antibiotici beta-lattamici hanno come obiettivo l'ostacolo della sintesi del peptidoglicano. Il plasmalemma batterico a volte si invagina formando dei mesosomi. Al di fuori della parete cellulare può essere presente la capsula, ciglia, flagelli, fimbrie (non mobili).

La forma del batterio è variabile: cocco (sferica), bastoncello, spirale. Alcune sono cellule singole o raggruppate in ammassi. I batteri si dividono per replicazione binaria. Alcuni batteri producono le spore che sono forme di resistenza a condizioni ambientali avverse. Le spore possono sopravvivere per decenni (vita quiescente). Gli involucri sporali rendono particolarmente protetto l'interno. La spora si riapre quando all'interno può entrare l'acqua. La sporificazione è solo una trasformazione per resistere. Dopo una divisione binaria le cellule batteriche possono dividersi istantaneamente o rimanere agganciate formando strutture differenti. Gli stafilococchi richiamano la forma del grappolo d'uva (per esempio). Il batterio è un organismo aploide anche se spesso prima della copia il genoma è presente in più di una copia. Il genoma è costituito da 5 x 10⁶ paia di basi per la codifica di circa 3000 geni. La velocità media di replicazione è di 40 minuti. Oltre al cromosoma batterico nella cellula sono presenti plasmidi (che possono entrare ed uscire dall'anello del cromosoma). Il plasmide può "prendere" qualche gene dal cromosoma.

Nel genoma batterico non sono presenti gli istoni, non sono presenti sequenze ridondanti. Una mutazione viene immediatamente espressa a causa dell'aploidia. I caratteri di trasmissione importanti sono quelli di resistenza o patogenicità. La membrana citoplasmatica batterica è la sede di molti processi citoplasmatici. La parete batterica rappresenta un fattore di resistenza contro le variazioni osmotiche.

Lezione 3 - 03/03

Nel batterio la catena respiratoria ha sede sulla membrana plasmatica. Al di fuori della membrana plasmatica è presente la parete che è uno strato rigido (guscio) presente in quasi tutti i batteri tranne che nei mollicutes. Il mondo batterico per le caratteristiche della parete può essere diviso in GRAM + e GRAM -. Questa classificazione è data dalla colorazione dei batteri che dava due colori differenti. A seguito di questo risultato, la colorazione corrispondeva a diverse strutture della parete. La parete dei GRAM + è costituita da uno spesso strato di peptidoglicano (200-800 Å) ed acidi grassi implicati nell'adesione. La parete è molto più resistente che nei GRAM - ma non costituisce un fattore di impermeabilità.

La parete dei GRAM - è più sottile ma più complessa. Il peptidoglicano è disposto in uno strato molto sottile. Al di fuori del peptidoglicano è presente in questo caso una membrana esterna che rappresenta un fattore di impermeabilità. A differenza della membrana interna che è simmetrica, quella esterna possiede lipopolisaccaridi esterni e fosfolipidi interni. Lo spazio tra le due membrane è uno spazio particolare. La membrana esterna funge da selettore e nel caso di una tossina, nello spazio intermembrana, viene demolita. Gli anticorpi beta-lattamici, vengono demoliti in alcuni batteri nello spazio intermembrana. Anche i GRAM + producono elementi detossificanti che vengono riversati all'esterno. I GRAM - concentrano invece l'antitossina nel periplasma.

Il peptidoglicano avvolge tutta la cellula: è fatto come un tessuto con fili paralleli e ponti trasversi. Le catene parallele sono costituite da N-acetilglucosammina ed acido muromico. Queste catene sono collegate trasversalmente da ponti formati da pochi amminoacidi (vi sono sia legami glicosidici che peptidici). Il peptidoglicano si allunga con l'inserimento di nuovi monomeri distruggendo e ricreando legami. L'antibiotico beta-lattamico impedisce la formazione di un certo legame peptidico (blocca la transpeptidasi durante il processo di accrescimento).

Nei GRAM- è presente la membrana esterna che presenta un doppio strato asimmetrico: lipopolisaccaridi (LPS) esterni e fosfolipidi interni. Si tratta di una barriera di permeabilità consentendo solo il passaggio a molecole piccole idrofiliche. Superficialmente tende a legare ioni Ca ed Mg fattore che la rende più rigida. Il LPS è costituito da più porzioni. La parte esterna possiede catene oligosaccaridiche che rappresentano una specie di mosaico. Questa porzione è l'antigene somatico del batterio detto antigene O. L'antigene O è anche un fattore di patogenicità. Le catene oligosaccaridiche sono agganciate ad un core che a sua volta dà attacco a catene lipidiche (lipide A) verso l'interno.

Il lipide A è molto tossico per l'uomo. Si tratta di un'endotossina poiché si libera solo con la lisi dei batteri. Se ne veniamo a contatto causa febbre anche in concentrazioni molto piccole (pirogeno). Quando il lipide A è rilasciato in alta quantità si può arrivare alla morte per shock. Un effetto è anche la coagulazione intravasale disseminata. Il TOLL-like receptor numero 4 è in grado di riconoscere il LPS. Lo spazio periplasmico è ricco di enzimi detossificanti, binding di proteine e si occupa anche di trasferimento di nutrienti.

Caratteristiche di crescita e classificazione

I batteri che crescono solo in presenza di ossigeno sono gli aerobi obbligati; gli anaerobi obbligati, viceversa, devono vivere senza ossigeno che sarebbe un veleno per certi loro enzimi (traggono energia ad esempio dalla fermentazione). Intermedi vi sono gli aerobi facoltativi. I microaerobi necessitano di ossigeno ma a bassa densità. Gli aerotolleranti sono anaerobi ma tollerano la presenza di ossigeno anche se non lo utilizzano.

Esiste anche una classificazione in base alla temperatura di crescita: psicrofili (-5°C – 15°C), mesofili (25°C – 45°C), termofili (45°C – 70°C) e ipertermofili (70°C – 110°C). I batteri patogeni sono esclusivamente del gruppo dei mesofili. Per quanto riguarda le fonti di energia si distinguono gli autotrofi (sintetizzano composti a partire dalla CO₂) ed eterotrofi (necessitano di carbonio in forma organica). I patogeni sono tutti eterotrofi. L'energia nei batteri viene prodotta per ossidazione ed immagazzinamento di ATP. Le reazioni sono fosforilazione diretta a livello di substrato e fosforilazione ossidativa.

Il substrato finale può essere di natura acida (acido lattico) o neutro. Alcuni batteri utilizzano reazioni ossidoriduttive tra amminoacidi. Per lo studio dei batteri occorre coltivarli: in una coltura batterica si necessita di un terreno di coltura disposto di tutti i nutrienti necessari. In alcuni casi si possono immettere degli agenti che inibiscono la crescita dei batteri non desiderati (terreni selettivi). Si possono aggiungere inoltre sostanze nutritive particolari o emazie per verificare l'effetto. Il terreno può essere liquido o solido. Nel terreno liquido il batterio cresce tutto insieme formando grandi masse. Il terreno solido si dispone su una piastra di Petri. Il tempo di generazione batterica dipende dalla specie batterica e dalla tipologia di coltura. La crescita è esponenziale. Il numero delle generazioni si ottiene dividendo il tempo di coltura con il tempo di generazione. Nella crescita batterica esiste un periodo di latenza utile per la produzione dell'apparato duplicativo. I batteri si replicano molto velocemente.