Microbiologia applicata

Microbiologia applicata

Introduzione

I microrganismi svolgono ruoli fondamentali in una serie di ambiti:

• Sono in grado di causare malattie nel regno animale (es. Meningococco che causa la meningite) e nel regno vegetale (es. Xylella che causa gravi malattie nelle piante di interesse agricolo o Agrobacterium che porta alla formazione della galla del colletto, cioè di una proliferazione tumorale nelle piante dicotiledoni).
• Sono fondamentali per i cicli biogeochimici (es. nel ciclo del carbonio è fondamentale il ruolo dei metanotrofi, che utilizzano il metano come fonte di energia e dei metilotrofi, che utilizzano il metano come fonte di C) e per la fertilizzazione del suolo (grazie ai batteri nitrificanti che, tramite la nitrificazione, arricchiscono il suolo di sostanze azotate, cioè nitrati, nitriti e NH₃, rendendolo fertile).
• Sono utilizzati nell'ambito dell'agricoltura come biomassa per la produzione di energia a partire da sostanze organiche (es. tramite la metanogenesi, che porta alla produzione di metano o tramite l'acetogenesi, che porta alla produzione di acido acetico o tramite la produzione di biogas, una miscela di vari tipi di gas composti principalmente da metano. Tutti composti che saranno successivamente convertiti in energia).
• Sono in grado di produrre farmaci e molecole per uso industriale (es. gli Streptomiceti sono una classe di batteri in grado di produrre circa l'80% degli antibiotici comunemente utilizzati oltre a molecole biologicamente attive come antivirali, immunosoppressori, pigmenti, ecc.).
• Comportano effetti significativi sugli alimenti con i quali interagiscono. Essi, infatti, utilizzando l'alimento come terreno di crescita, modificano le sue proprietà organolettiche, quindi ne alterano sapore e odore e durante la fase vegetativa possono anche rilasciare componenti tossiche per l'uomo. Tuttavia non sempre i microrganismi comportano effetti negativi sugli alimenti, in quanto tramite il processo di fermentazione portano alla produzione di cibi e bevande fermentate, come pane, latticini, birra, vino, ecc., garantendo tempi più lunghi di conservabilità del prodotto.

Ovviamente la notevole utilità dei batteri in svariati ambiti ha portato allo sviluppo di una serie di branche della microbiologia. Si sono così sviluppate le tecnologie microbiche dell'agro-industria, che consistono nella produzione di prodotti nel settore agro-industriale utilizzando microrganismi o loro componenti. In questo ambito di fondamentale importanza risultano essere le tecnologie microbiche della fermentazione che consistono nella progettazione del processo fermentativo attraverso lo studio dei microrganismi e dei loro processi fermentativi, al fine di ottenere cibi e bevande fermentate con specifiche e uniche caratteristiche. Diverso è invece il concetto di tecniche della fermentazione, riferite al funzionamento dello strumento fermentatore. Per cui un microbiologo è un tecnologo in quanto deve essere in grado di progettare e controllare le trasformazioni alimentari durante la fermentazione, per ottimizzare la produzione.

Fermentazione

Storia

I cibi e le bevande fermentate sono utilizzate dall'uomo da moltissimi anni, prima ancora di conoscere i batteri ed il processo della fermentazione. Basti pensare al latte che lasciato per un po' di tempo a temperatura ambiente spontaneamente si trasformava in ricotta e poi in formaggio, o al succo d'uva che si convertiva in un prodotto simile al vino. Fu solo con la costruzione dei primi microscopi rudimentali, come quello di Antony van Leeuwenhoek nel 1684 e con la confutazione della teoria della generazione spontanea grazie agli esperimenti di Pasteur intorno al 1800, che si iniziò a conoscere e studiare il processo della fermentazione. E nel corso del tempo gli studi sulla fermentazione si estesero a diversi punti geografici, giungendo ai medesimi risultati, cosa che ne dimostrò la validità. Via via iniziarono a nascere delle aziende della fermentazione, sempre più grandi, fino ad arrivare alle grosse industrie di fermentazione presenti ai giorni nostri, molto più rapide ed efficaci, dove cibi e bevande fermentate devono essere prodotti su larga scala in maniera riproducibile, al fine di ottenere sempre lo stesso prodotto e dove è fondamentale regolare i tempi, quindi accorciare o estendere specifiche tappe della fermentazione per ottenere un prodotto ottimale.

Proprietà dei cibi fermentati

• Conservabilità: la conservazione degli alimenti è stata da sempre fondamentale per l'uomo che ha messo a punto varie strategie come l'essicazione (che eliminando l'acqua blocca le reazioni di degradazione), la salatura (attraverso il sale che crea condizioni proibitive per i batteri) e la conservazione sott'aceto (che rende l'alimento un substrato non colonizzabile dai batteri). Tuttavia anche la fermentazione è utile per la conservazione del prodotto, poiché porta alla produzione di acidi che abbassano il pH del prodotto, condizione che inibisce la colonizzazione batterica (es. etanolo).
• Valore nutrizionale: i cibi e le bevande fermentate hanno dei nuovi valori nutrizionali rispetto ai prodotti d'origine, come nel caso del vino, che contiene polifenoli, tannini e altre sostanze antiossidanti non presenti nell'uva, o come nel caso dello yogurt, che a differenza del latte non contiene lattosio, in quanto esso è scisso in glucosio e galattosio dai batteri lattici, e questo lo rende consumabile anche da soggetti intolleranti al lattosio.
• Proprietà organolettiche: legate al diverso odore e sapore di cibi e bevande fermentate rispetto ai prodotti di partenza.
• Unicità: un cibo o una bevanda fermentata ha specifiche e uniche proprietà e può essere ottenuta da un unico processo fermentativo, con l'impiego di specifici microrganismi che non possono variare. Teoricamente, per risparmiare del tempo nell'attuare la fermentazione, invece di utilizzare batteri che bisogna far crescere in coltura, sarebbe possibile purificare da essi i sistemi enzimatici che utilizzano nel processo. Tuttavia i batteri sono qualcosa di più complesso, cioè possiedono molteplici vie metaboliche e danno origine a svariati prodotti secondari, per cui i prodotti ottenuti saranno dei prodotti chimici, che non potranno mai possedere le stesse proprietà organolettiche del prodotto ottenuto con la naturale fermentazione batterica.
• Valore economico: cibi e bevande fermentate hanno un costo maggiore rispetto al prodotto da cui derivano, perché crescere i batteri nelle industrie e monitorare i processi fermentativi è molto costoso.

Microrganismi e fermentazione

I microrganismi in grado di svolgere il processo della fermentazione hanno caratteristiche peculiari e appartengono esclusivamente a due Phyla: Proteobacteria e Firmicutes. Ovviamente alcuni microrganismi variano a seconda dell'area geografica considerata, generando cibi o bevande tipiche del paese di produzione. I principali microrganismi in grado di svolgere la fermentazione sono: batteri lattici, batteri acetici e lieviti.

Batteri lattici

Appartengono al Phyla dei Firmicutes, sono batteri Gram+ non sporigeni (a differenza di Botulinum che produce endospore o di Clostridium e degli Streptomiceti che producono esospore) e possono avere forma di cocchi (sferici) o bacilli (a bastoncello). Ad esempio il Leuconostoc oenos (anche detto Oenococcus oeni) è un coccobacillo (forma ovale, intermedia tra quella di un cocco e di un bacillo), fondamentale nel processo di vinificazione; il Lactobacillus casei è un bacillo; il Lactococcus lactis è un cocco; lo Streptococcus thermophilus è un cocco disposto a catenelle, che insieme al Lactobacillus delbrueckii è fondamentale nella produzione dello yogurt. In generale i batteri lattici sono coinvolti nella produzione di latticini, formaggi, insaccati, prodotti da forno e bevande attraverso la fermentazione e sono batteri commensali quindi non patogeni, diffusi in natura in svariati ambienti: nel suolo, sui vegetali, nel latte, sulle mucose dei mammiferi e nella flora microbica dell'uomo e degli animali in quanto sono probiotici del tratto gastrointestinale.

Importanti studi basati sul sequenziamento dell'intero genoma nei batteri lattici ha permesso di conoscere a fondo le loro caratteristiche strutturali e metaboliche.

Caratteristiche strutturali dei batteri lattici

Parete: le cui caratteristiche principali sono:

• Contiene molti recettori per batteriofagi, i quali possono alterare il processo di fermentazione. Quindi perché ciò non avvenga è necessario eliminare i recettori attraverso tecniche di genomica.
• In alcuni batteri lattici la parete produce autolisine, ovvero enzimi che durante la crescita cellulare, rompono i legami del peptidoglicano preesistente, permettendo la sintesi di nuovo peptidoglicano. L’aspetto fondamentale è che queste autolisine, attraverso la lisi del peptidoglicano, garantiscono la fuoriuscita di componenti citoplasmatiche che possono migliorare le proprietà organolettiche del prodotto fermentato e inoltre se agiscono nell’uomo o nell’animale, provocano il rilascio di piccole componenti antigeniche in grado di stimolare la risposta immunitaria, quindi la produzione di anticorpi.
• Contiene molte adesine, che favoriscono la colonizzazione del tratto gastrointestinale. In laboratorio è possibile stabilire se un batterio possiede le adesine in superficie, sfruttando la sequenza genomica nota del batterio. Essa infatti, tramite sistemi bioinformatici, viene confrontata con sequenze genomiche note raccolte in banche dati e se l’adesina è presente, verranno fornite varie probabili sequenze che potrebbero codificare per essa.
• Nonostante i batteri lattici siano Gram+, il loro peptidoglicano di parete può differire da quello tradizionale. In generale il peptidoglicano è costituito da residui di NAM e NAG uniti a formare lunghe catene. Il NAM si differenzia dal NAG perché invece di legare un gruppo OH, lega un residuo di acido D-lattico, a sua volta legato ad un tetrapeptide. Nei batteri Gram- il tetrapeptide è costituito da: L-alanina, acido D-glutamico, acido meso-diaminopimelico e D-alanina. Nei Gram+ al quarto posto dell’acido meso-diaminopimelico c’è la L-lisina (posizione 3 del tetrapeptide). La peculiarità nei batteri lattici è che al posto della L-lisina tipica dei batteri Gram+, ci può essere l’acido meso-diaminopimelico (Lactobacillus plantarum) o altri amminoacidi (come la L-ornitina in Lactobacillus fermentum). Inoltre nel peptidoglicano i legami intercatena tra D-alanina in posizione 4 e l’amminoacido presente in posizione 3 di un altro residuo di NAM, sono diretti nei Gram- e mediati da 5 residui di glicina nei Gram+. Nel caso dei batteri lattici ci può essere un legame diretto (come in L. plantarum) o un ponte intercatena costituito da 2 aa, cioè da un diimero (es. 2 L-alanina, 2 L-serine, L-alanina e L-serina, ecc.).
• Inoltre i batteri lattici a livello della parete possono avere acidi tecoici e lipotecoici, ovvero polimeri aninonici costituiti da unità di robitolo o glicerolo unite tra loro da legami fosfodiesterici (acido fosforico lega in contemporanea due monomeri). Gli acidi tecoici sono direttamente legati al peptidoglicano di parete, mentre i lipotecoici si prolungano fino a prendere contatto con i fosfolipidi della membrana sottostante.

Membrana plasmatica: è costituita da fosfolipidi (tra cui i più diffusi: fosfatidil glicerolo, lisofosfatidil glicerolo, difosfatidil glicerolo) e glicolipidi.

Metabolismo dei batteri lattici

• Sono privi di una catena respiratoria, quindi non possiedono citocromi e non possono mettere in atto la respirazione aerobia o anaerobia. La catena respiratoria, infatti, è collocata a livello della membrana plasmatica, dove si formano i mesosomi, ovvero introflessioni di membrana che aumentano la superficie respiratoria e ha il compito di riossidare gli equivalenti riducenti prodotti durante la glicolisi e il successivo ciclo di Krebs, su una serie di substrati ossidati tra cui l’ultimo è l’O₂ nella respirazione aerobia ed un altro possibile composto ossidato nella respirazione anaerobia (come forme ossidate di N, Fe, S, ecc., ad esempio N sotto forma di nitrati o nitriti). Quindi normalmente il glucosio è ossidato a 2 molecole di piruvato (o acido piruvico) nella glicolisi, il piruvato è ulteriormente ossidato a CO₂ nel ciclo di Krebs con produzione di ATP e equivalenti riducenti (sotto forma di NADH₂) poi ceduti alla catena respiratoria, dove verrà prodotta H₂O altro ATP. Nel caso dei batteri lattici, invece, non essendoci la catena respiratoria, il metabolismo energetico è incentrato unicamente sulla fermentazione (tramite la fosforilazione a livello del substrato), un processo alternativo in grado di fornire energia seppure in misura minore rispetto alla respirazione, che permette di riossidare l’NADH₂ in eccesso e mantenere il bilancio ossidoriduttivo della cellula. Quindi prima che abbia inizio la vera e propria fermentazione il composto organico di partenza, di solito il glucosio, deve subire reazioni di ossidazione, per passare di solito ad acido piruvico, cedendo equivalenti riducenti al NAD+, che passa così a NADH₂ (di solito ciò avviene tramite la glicolisi). Ed è a questo punto che entra in gioco la fermentazione. La fermentazione lattica in particolare è suddivisa in omolattica (messa in atto dai batteri omolattici) ed eterolattica (messa in atto dai batteri eterolattici). La omolattica consiste nella riossidazione dell’NADH₂ sull’acido piruvico, ottenuto dalla glicolisi completa, con produzione di acido lattico, senza rilascio di ATP. La fermentazione eterolattica, invece, porta alla formazioni di acido lattico, ma anche di altri prodotti e non parte dalla glicolisi, poiché il glucosio di partenza intraprende la via dell’esoso monofosfato, tramite la quale dopo alcune tappe, che portano al rilascio di CO₂, viene convertito in gliceraldeide 3-P e acetilfosfato. La gliceraldeide entra nella glicolisi ed è ossidata ad acido piruvico, il quale come per la fermentazione omolattica è ridotto ad acido lattico (con riossidazione dell’NADH₂), mentre l’acetilfosfato è ridotto ad acetaldeide, la quale è ulteriormente ridotta ad etanolo (in ciascuna delle due riduzioni si riossida una molecola di NAD(P)H₂ formatasi nelle tappe precedenti alla fermentazione). Questo processo si verifica in assenza di O₂, dove quindi i prodotti della fermentazione eterolattica sono: CO₂, acido lattico ed etanolo. Se invece i batteri eterolattici si trovano in un mezzo aerato, l’acetilfosfato viene converito in acetato (acido acetico), ed il gruppo fosforico è ceduto all’ADP che passa ad ATP. In questo caso, quindi, i due equivalenti riducenti dell’NAD(P)H₂, grazie all’enzima NAD(P)H₂ ossidasi, sono ceduti all’O₂, che viene ridotto ad acqua ossigenata (H₂O₂), la quale pur essendo tossica, sarà eliminata dalle catalasi di questi batteri. Quindi la presenza di O₂ è vantaggiosa, poiché libera l’acetilfosfato dal dovere di riossidare l’NAD(P)H₂ e lo rende disponibile per la produzione di ATP, ottenuto grazie alla grossa quantità di energia liberata con la rottura del legame fosforico. Per cui i prodotti della fermentazione eterolattica in presenza di O₂ sono: CO₂, acido lattico, acido acetico e ATP. Alcuni batteri lattici (come Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc) oltre che fermentare gli esosi, come il glucosio, possono fermentare i pentosi, come ad esempio il ribosio. Inizialmente il ribosio subisce delle isomerizzazioni, che lo convertono in xilulosio-5P. 3 dei suoi atomi di C entrano nella glicolisi sotto forma di gliceraldeide 3-P, ossidata ad acido piruvico, poi ridotto ad acido lattico (con riossidazione dell’NADH₂); gli altri 2 atomi di C invece formano l’acetilfosfato, convertito in acetato con produzione di ATP (quindi non si forma l’etanolo poiché nelle prime tappe della via non si forma NADH₂).
• Sono anaerobi ossigeno-tolleranti, cioè pur non utilizzando l’O₂ a scopi energetici, lo tollerano. L’O₂, infatti, è in grado di dare origine a prodotti tossici, cioè a radicali liberi, come l’H₂O₂ (perossido d’idrogeno o acqua ossigenata), L’O₂^- (anion superossido), l’OH (radicale ossidrilico). I batteri lattici, tuttavia, possiedono sistemi enzimatici in grado di detossificare la cellula dall’azione di questi prodotti (catalasi, perossidasi, superossidodismutasi).
• Sono acido-resistenti, poiché mettendo in atto la fermentazione producono acido lattico, e di conseguenza resistono a pH acidi.
• Hanno complesse esigenze nutrizionali. Essi, infatti, a differenza di E.Coli che è autosufficiente e quindi in grado di crescere su terreno minimo, non possiedono le vie metaboliche per la sintesi di amminoacidi, vitamine, basi azotate, ed è quindi necessario fornire queste componenti nel loro terreno di crescita. Tra i supplementi da aggiungere al terreno c’è il Tween 80, un estere dell’acido oleico che favorisce la crescita batterica, la quale risulta comunque lenta, con produzione di poca biomassa.
• Sono chemioeterotrofi, cioè utilizzano la sostanza organica come fonte di C (eterotrofi) e come fonte di energia (chemiotrofi).

Tassonomia dei batteri lattici

La tassonomia o classificazione dei batteri lattici è basata su diversi criteri che includono sia caratteristiche fenotipiche che molecolari. Questi criteri aiutano nella distinzione e classificazione accurata di diverse specie e ceppi di batteri lattici.