Microbiologia – Antibiogramma

ANTIBIOGRAMMA - METODI PER DETERMINARE LA SENSIBILITÀ AGLI AGENTI ANTIMICROBICI

Generalità

L'isolamento e l'identificazione degli agenti patogeni responsabili di manifestazioni cliniche nell'uomo è premessa indispensabile per valutare la necessità dell'intervento terapeutico: di questi agenti è necessario valutare il numero e la specie.

In caso di infezioni miste le prove di sensibilità vanno eseguite separatamente per ogni specie microbica: le prove di sensibilità diretta su materiale patologico polimicrobico sono in genere non valide, anche in relazione al fatto che non è noto il numero dei microrganismi viventi presenti, fattore indispensabile per le prove di sensibilità.

Per la valutazione delle prove in vitro bisogna tenere conto tra l'altro:

• sede di infezione in relazione alla concentrazione che l'agente microbico può raggiungere in essa;
• possibile influenza del pH del mezzo.

colturale;

§ presenza di sostanze organiche che possono ridurre l'attività dell'agente antimicrobico ed impedirne la diffusione;

§ influenza dell'agente microbico sui fattori di virulenza;

§ azione batteriostatica (microstatica nel caso di miceti) o battericida (micocida nel caso di miceti).

I metodi per determinare la sensibilità dei microrganismi agli agenti antimicrobici si dividono in due gruppi: metodi per diluizione e metodi per diffusione.

Metodi per diluizione

Sono in genere migliori per precisione, standardizzazione e riproducibilità; se effettuati con un ampio numero di diluizioni e numerosi ceppi microbici sono nella maggior parte dei casi utilizzati per la valutazione di nuovi agenti antimicrobici. Nei metodi per diluizione l'interpretazione dei risultati si ottiene valutando la crescita microbica in terreni di coltura addizionati di concentrazioni scalari dell'agente antimicrobico (a.a.); è importante evitare

L'utilizzo di terreni di coltura che possono inibire l'attività di alcuni a.a. L'agente antimicrobico utilizzato deve essere sterile, opportunamente conservato e ad attività nota. Con i metodi di diluizione è possibile infine valutare l'associazione di due o più farmaci.

I vantaggi dei metodi per diluizione sono la possibilità di calcolare con precisione la dose minima inibente, inoltre si può studiare (nel caso di terreni liquidi) l'attività microbicida. Gli inconvenienti riguardano soprattutto i terreni liquidi e si riferiscono ad errori di valutazione per la presenza di eventuali germi contaminanti, di mutanti resistenti all'a.a. o all'aspecifico intorbidamento del terreno dovuto a sostanze aggiunte ad esso dall'a.a.

Con i metodi di diluizione è possibile valutare l'azione sinergica, antagonista o nulla dell'associazione di due o più a.a.

Tecnica in terreno

liquidoL’inoculo è preparato da una coltura batterica, sviluppata a 35°C per 18h, in fase di crescita logaritmica.

§ dosare l’inoculo con metodi spettrofotometrici, con misura della torbidità o con camera contaglobuli;

§ diluire l’a.a. dalla soluzione madre scalarmente (per raddoppio) in contenitori contenenti un uguale volume di terreno di coltura;

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§ seminare una quantità costante della sospensione microbica in esame (inoculo); il numero dei germi seminati è in genere compreso tra 10^5 – 10^6 cell/ml finale in modo da ridurre la possibile presenza di mutanti resistenti;

§ seminare per controllo il terreno di coltura senza a.a. (controllo di sviluppo del ceppo);

§ incubare la provetta a temperatura di 35°C per 16 – 20h;

§ lettura dei risultati spettrofotometrica o ad occhio nudo valutando l’assenza di sviluppo (assenza di intorbidamento o meglio non

aumento dell’eventuale intorbidamento dovuto all’inoculo).La concentrazione più bassa di a.a. in grado di inibire la crescita microbica viene definita Concentrazione Minima Inibente (M.I.C.) e viene espressa in microngrammi/ml o U.I. per ml.

La Concentrazione Minima Battericida (M.B.C.), cioè la più bassa concentrazione in microngrammi/ml di a.a. che determina la morte del 99,9% dei batteri presenti, si determina effettuando subcolture in terreno solido o liquido dalle diluizioni in cui vi è stata inibizione dellosviluppo batterico; per la semina si può utilizzare il centrifugato della coltura inibita. La crescita nelle subcolture indica che l’azione inibente dell’a.a. è di natura batteriostatica e non battericida.

I metodi più usati per determinare in vitro le MIC degli a.a. verso i batteri in terreno liquido si differenziano in base al tipo di contenitore utilizzato: metodo in provetta (metodo di Ericcson e Sherris),

Il volume di terreno liquido può essere 10 ml, 5 ml, 3 ml, la metodica è quella precedentemente discussa; micrometodo in pozzetti, sostanzialmente identico al metodo delle diluizioni in provetta, le MIC vengono determinate in microtiter (piastre di plastica o vetro con micropozzetti scavati all'interno) valutando l'intorbidamento o la formazione di sedimento superiore all'inoculo.

Tecnica in terreno solido:

1. L'inoculo è preparato da una coltura batterica per incubazione a 35°C per 16-20h;
2. Dosare l'inoculo con spettrofotometro o analisi turbidimetrica (MacFarland), allestire un microtiter nei cui pozzetti vengono distribuiti i ceppi microbici da saggiare;
3. Diluire scalarmente l'a.a. in provette contenenti terreno nutritivo agarizzato sciolto e portato a temperatura non inattivante per l'a.a.;
4. Versare in piastre petri il contenuto delle provette;
5. Aspettare la solidificazione della piastra.

contenente il terreno più l’a.a. e far asciugare dai residui diumidità sulla sua superficie;

seminare per infissione con l’ausilio di un replicatore a 60 punte i ceppi microbici preparati. Ciò consente l’esame contemporaneo di un numero elevato di colture: la semina viene effettuata in tutte le piastre a partire dal controllo non contenente a.a.;

incubare a 35°C per 18h. La lettura dei risultati si basa sulla presenza di crescita microbica nel punto di inoculo delle punte del replicatore per i microrganismi resistenti ad una determinata concentrazione di a.a. e assenza di crescita per i microrganismi sensibili; la correlazione tra ciascun microrganismo inoculato e la sensibilità all’a.a. può avvenire perché ogni microrganismo è identificato con un numero di riferimento. Si effettua il calcolo della MIC per ogni ceppo microbico verificando l’assenza di crescita nella serie

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Metodi per diffusione: È una prova di sensibilità di un microrganismo verso numerosi agenti antimicrobici (a.a.) su piastre di terreno solido mediante applicazione, con tecniche differenti, di agenti antimicrobici sul terreno solidoinoculato con il microrganismo da esaminare.

L’a.a. diffonde radialmente a partire dal punto in cui è stato deposto creando un gradiente di concentrazione; nella zona circolare di agar dove l’a.a. raggiunge una concentrazione uguale o superiore alla concentrazione minima inibente (MIC) non si avrà crescita microbica ma si formerà una zona di inibizione il cui diametro è in relazione alla sensibilità del microrganismo all’a.a.

L’antibiogramma si può effettuare applicando sulla superficie della piastra dischetti di carta da filtro (carta bibula) sterili perfettamente aderenti contenenti concentrazione nota e standard di a.a.

è il metodo di diffusione su agar, noto anche come test di sensibilità agli antibiotici su disco. In questo metodo, i dischi contenenti gli antibiotici vengono posti sulla superficie di una piastra di agar inoculata con il microrganismo da testare. Gli antibiotici diffondono nel terreno circostante e formano un'area di inibizione intorno al disco, chiamata alone di inibizione. Il diametro di quest'alone viene misurato e confrontato con una tabella di interpretazione per determinare la sensibilità del microrganismo all'antibiotico. Per ottenere una valutazione quantitativa della sensibilità, è possibile eseguire un test di diluizione in terreno liquido. In questo caso, vengono preparate diverse diluizioni dell'antibiotico e il microrganismo viene inoculato in ciascuna diluizione. Dopo un periodo di incubazione, viene determinata la concentrazione minima inibitoria (MIC), cioè la più bassa concentrazione di antibiotico che inibisce la crescita del microrganismo. Questo valore può essere correlato al diametro dell'alone di inibizione ottenuto con il metodo di diffusione su agar utilizzando una retta di regressione. È importante prestare attenzione a diverse variabili durante l'esecuzione di un antibiogramma per diffusione. Queste includono variabili di natura tecnica, come il tipo di piastra utilizzata, la qualità del terreno di coltura e l'applicazione corretta dell'antibiotico. Inoltre, ci sono variabili di natura biologica, come il numero di microrganismi inoculati, la temperatura e il tempo di incubazione. Una corretta standardizzazione delle metodiche è fondamentale per una corretta interpretazione dei risultati.

è quello di Bauer-Kirby; con questa metodica il terreno dicoltura deve rispondere ad alcune proprietà come pH e concentrazione ionica adeguati, concentrazionee spessore uniforme dell’agar.

Poiché la diffusione dell’antibiotico nell’agar avviene in relazione all’uniformità dello spessore delterreno nelle piastre la metodica richiede:

• piastre piane e disposte su una superficie orizzontale;
• concentrazione dell’agar di 1,5-2% ;
• spessore dell’agar di 4 mm calcolato in base alle dimensioni delle piastre e la quantità di terrenoadoperato;
• scelta del terreno di coltura adeguato; generalmente si utilizza Mueller Hinton (pH compreso tra 7.2e 7.4) il quale non interferisce con l’attività dei vari antibiotici. Tuttavia anche uno stesso terreno dicoltura a seconda delle diverse partite può presentare notevoli differenze nella concentrazioneionica (il particolare la concentrazione di

calcio e magnesio può interferire con la grandezza degli aloni di inibizione), nella conducibilità elettrica, ecc. Inoltre è da rilevare che l'aggiunta di sangue al terreno di coltura può modificare l'attività di un a.a. § dosaggio dell'inoculo, necessario perché la grandezza degli aloni di inibizione è in relazione al numero di microrganismi seminati. Per standardizzare la densità dell'inoculo si può usare un metodo microscopico opacimetrico (MacFarland) o spettrofotometrico. L'inoculo ottenuto da diluizione della coltura pura deve contenere 10^5 – 10^6 germi/ml finale; § allestimento dell'agar germi mediante: 1. semina dell'inoculo nella massa dell'agar;