Scienze, tecniche di microbiologia

Analisi batteriologiche e microbiologiche

Gram- (E. Coli, enterobatteri, pseudomonas, ecc)
Gram+ (clostridia, lactobacilli, enterococci, ecc)

Per i batteri aerobi si fa coltura con Agar:
- XLD AGar per Salmonella e SHigella
- TCBS Agar per cholera
- MacConkey per Yersinia enterocolitica
- Compylobacter cultur media per Campylobacter specie

Liquor (LCR) liquido sterile:
- prelievo: puntura lombare con trasporto immediato, no refrigerazione (senno uccide Nesserie)
- se liquido è denso è ricco di cellule o proteine

Se cerchiamo batteri --> temperatura ambiente
Se cerchiamo virus --> temperatura refrigerata a 4°C (si inibisce crescita batterica)

Infezione virale aumentano linfociti
Infezione batterica aumentano neutrofili

Tampone vaginale e uretrale:
- Prelievo: 3 tamponi dall'ambiente vaginale prima della minzione
- Per esame microscopico a fresco (protozoi e funghi)
- Per esame microscopico con colorazione
- Per esame colturale

Tampone nasale x ricerca S. Aureus
Tampone faringeo x Streptococcus, Staphylococcus, Candida

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Tampone rinofaringeo: prelievo con tampone sottile montato su un filo di alluminio attraverso narice per la ricerca di Mycolplasma, neisseria, S. aureus, ecc.

Tampone auricolare: prelievo con tampone sottile per la ricerca di otiti.

Tampone congiuntivale: prelievo con tampone da congiuntiva tarsale.

Espettorato: prima di terapia antibiotica - prelievo a digiuno, pulizia cavo orale, induzione colpo di tosse.

Diagnosi batteriologica: si basa su esame colturale per poter ricercare/isolare un batterio o microrganismo; e vengono usati vari tipi di terreno (normali, arricchiti per far crescere tutti i tipi di microrganismi, selettivi per inibire gram+ o gram- e permettono crescita per determinate specie, differenziali per differenziare all'interno di una specie/genere).

Ricerca di enterotossine (prodotte soprattutto da gram-)

Indagini sierologiche

Antibiogramma

Tecniche di biologia molecolare (es. PCR)

Ricerca del batterio patogeno tramite:

• Esame colturale, tramite terreni selettivi e differenziali
• Esame microscopico diretto

ad esempio per le colorazioni gram • Ricerca antigeni • Evidenza sequenze di genoma batterico con sonde (PCR) • Ricerca endotossine come nei Gram- Antibiogramma: in una piastra con terreno e batteri, si mettono dei dischetti contenenti antibiotico a varia concentrazione; intorno ad essi ci sono zone completamente trasparenti, c'è un alone, ciò significa che non sono cresciuti microrganismi attorno e che l'antibiotico fa effetto; quando non c'è alone attorno non fa effetto e i microrganismi crescono lo stesso) ---> serve per trovare antibiotico specifico e a quale concentrazione Diagnosi sierologica: si basa sulla ricerca degli anticorpi nei sieri La produzione di anticorpi in seguito a esposizione ad agente eziologico non avviene subito ma dopo 7/14 gg-->essa può avere diversi scopi: screening (epidemiologico), diagnostico, prognostico, per vedere chi prima o dopo la vaccinazione possiede anticorpi--> valuta stato

immunitario del soggetto

Sistemi di indagine:

• Precipitazione
• Agglutinazione (es. Ricerca salmonellosi) fatto per ricerca di antigeni batterici nel liquido cefalorachidiano, dal liquor ricavo cell batteriche, messo a contatto con degli antisieri (anticorpo specifico contro antigene del batterio, IgM) --> si formano ponti che danno fenomeno all'agglutinazione
• Immobilizzazione
• Fissazione del complemento fa riferimento al complemento a cui si deve legare, quando si ha legame anticorpo+antigene si forma il complemento (che porta alla lisi della cell batterica); mentre se non ci sono gli anticorpi nel campione, il complemento non si lega e non lisa
• Immunofluorescenza
• Immunoenzimatiche (per ricerca antigeni e anticorpi)

Rilevazione di macromolecole:

• ricerca proteine
• ricerca metaboliti batterici
• ricerca acidi nucleici (PCR)

Terreni di coltura

I batteri hanno una serie di caratteristiche fisiche e chimiche, non tutti crescono allo stesso modo e negli stessi ambienti-

Terreni di trasporto:

giunge da reparto o ambiente sterile al laboratorio, in buone condizioni in base a org-Piastre contenenti terreno AGAR-AGAR (complesso polisaccaridico estratto dalle alghe x prep gelatina, si scioglie ad alte temp e si solidifica a tem normali---->i terreni si possono acquistare o preparare in lab con polveri in commercio (si scioglie la polvere con acqua distillata, si porta a pH specifico per batteri, sterilizzazione a 121°C x 15/20 min x eliminare batteri e spore estranee altrimenti alterano i risultati; in caso di pH troppo acido aggiungo idrossido di sodio, in caso di pH troppo basico aggiungo acido cloridrico diluito Terreni naturali, con sostanze organiche naturali: - Liquidi, brodo di carne, mosto d'uva e di birra, latte e siero di latte; che contengono fattori di crescita per batteri - Solidi, uova, patate, pane, frutta - Solidificabili, preparati aggiungendo substrati organici solidificabili come agar e gelatina a terreni di base Agar è un polimero del galattosio derivantedall'alga rossa marina e ha come temp di fusione 72 gradi, solidifica a 42 Gelatina è sost ottenuta da idrolisi di collagene (proteina strutturale animale); ottenuta da lavorazione carni e ossa Mentre i terreni sintetici hanno composizione chimica nota, utilizzati per coltivazione di specifici microrg. Es: Agar sangue contiene 5% del sangue di montone, fattore di arricchimento e permette crescita di solo alcuni batteri e ne inibisce altri Sostanze di base nei terreni: azoto e amminoacidi, fattori di crescita ed energia, sali, agenti selettivi (antibiotici), indicatori di pH (xk ci sono zuccheri, che se utilizzati si produce acido e si abbassa pH) Temperatura ottimale: mesofili 20-45°C; psicrofili 0-10°C; Termofili 45-100°C PH ottimale: solitamente neutro ma acidofili (1-2) e basofili (10-11) Concentrazione salina: fisiologica (0,75% di NaCl); ma alofili (15-25% di NaCl); alotolleranti (7-8% NaCl) Pressione osmotica Atmosfera di incubazione: (presenza/assenza diossigeno)- Aerobi obbligati, no fermentazione ma fosforilazione ossidativa- Anaerobi obbligati, fermentazione ma no fosf ossidativa, possono mancare di alcuni enzimi- Microaerofili, crescono bene in presenza di CO2

Esame colturale per i batteri:

Gram negativi

• Agar McConkey --> enterobatteri
• Agar sangue --> G. vaginalis
• Agar cioccolato --> gonococco

Gram positivi

• Agar sale mannite (sale ad alta concentrazione quindi selettivo) --> stafilococchi
• Agar sangue --> streptococchi

Test della catalasi prevede la produzione di un enzima (catalasi) che scinde l'attività dell'acqua ossigenata

Fishy odor test: fatto per valutare se c'è infezione da gardanella vaginalis (odore di pesce-->putrefazione)-->test servono per differenziare all'interno di una specie

Terreno di coltura costituito da:

• Peptone, fonte di proteine
• Estratto di carne e lievito idem
• Sodio
• Acqua per portare a volume

Soluzione finale si bolle (per sterilizzare)

sciogliere costituenti) e si sterilizza (per non far crescere specie che contaminano)

Nei terreni liquidi, nella provetta, si può mettere una campanella chiamata di Durham per cui i batteri che fermentano lattosio producono anidride carbonica e si forma una bolla, ma con automazione, non si fa più:

Semina- Una provetta contenete agar inclinato e si semina con ansa a zig zag, poi si vedono le colonie

batt- Spatolamento su piastra, quando si prendono grosse quantità di materiale (con spatola)

- Striscio con ansa su piastra; anse di plastica xk sono monouso e costano poco, poi eliminate

Colonia: cloni di cell della stessa tipologia che provengono da un’unica specie

Curva di crescita batterica: latenza (con sost nutritive) - esponenziale (crescita con produz cataboliti) - stazionaria (sost nutritive diminuiscono e aumentano cataboliti) - morte (muoiono tutte tranne spore)

Battericidi, distruggono/uccidono germi

Batteriostatici, inibiscono crescita germi

Decontaminazione,

trattamento di oggetti e superfici che previene crescita microbica

- Disinfezione, uccide microrganismi patogeni (tranne spore); disinfettanti es. candeggina

- Asepsi, evita apporto germi su substrato

- Antisepsi, distrugge/inibisce microrganismi sui tessuti

- Trattamento per spore che vengono indotte a germinare e poi vengono uccise

- Pastorizzazione, elimina microrganismi patogeni ma non gli altri

- Membrana filtrante

Cappa biologica a flusso laminare orizzontale

• Classe biologica 1
• Classe biologica 2
• Classe biologica 3

COPROCOLTURA

Permette di identificare sia batteri che virus nelle feci

--> Le feci in apposito contenitore o possono essere subito portate in laboratorio per l'analisi, o possono essere conservate a 4°C per 12/24 h (altrimenti batteri muoiono o proliferano modificando pH e altri fattori)

Coprocoltura standard va alla ricerca di Salmonella, Shigella e Campylobacter (feci sono liquide); responsabili di infezioni intestinali trasmesse attraverso consumo

di H2O o alimenti contaminati associati a diarrea, dolori addominali, febbre, muco e pus nelle feci---> anche Yersinia, E.coli, Clostridium, Staphyloccoccus aureus, miceti, ecc---> nei pazienti in età pediatrica si ricercano anche i Rotavirus e Adenovirus che danno gastroenteriti, vomito e diarrea

Terreni di coltura:

• Acqua peptonata tamponata
• Brodo selenite x Salmonella typhi e parathyphi
• Agar xilosio
• Agar verde brillanti
• Agar MacConkey
• Agar cisterna lattosio

Test catalasi si applica ai batteri (clostridium, streptococco) che posseggono enzima catalasi, che scinde perossido di idrogeno (H2O2) in O2 e H2O; se positivo c’è effetto frizzante, bollicine

Test coagulasi prodotta da Stafilococcus aureus; batteri che producono questo enzima permettono di convertire il fibrinogeno in fibrina, coagulano l’area di plasma attorno ad essi proteggendo il batterio da fagocitosi

Test dell’ossidasi x pseudomonas o neisseria; enzima che ossida ammine aromatiche

Producendo composti colorati

Test di DNasi o desossiribonucleasi, degradano dna (o rna): si prende colonia e si mette a contatto con dna +acido cloridrico e si forma precipitato che afferma presenza enzima che scinde appunto dna

Test termonucleasi, dnasi termoresistenti

Test del citrato in cui esso viene scisso in acido organico e CO2 (viraggio da verde a blu, per formazione disodio carbonato)

Test ureasi, batteri che hanno enzima scindono composto basico (urea)

Test della beta galattosidasi, enzima scinde legame glucosio e galattosio in molecola di lattosio---> sistemi miniaturizzati: forniscono serie di terreni in cui si hanno diverse attività biochimiche e i batteri si inoculano tutti in una volta; i risultati sono convertiti in profili numerici che consentono identificazione batteri

Esempi di kit: API 20E x enterobact