Microbiologia

Generalità

La microbiologia è una scienza molto vasta ed ha come oggetto di studio diverse classi di microrganismi ed agenti infettivi, che sono:

• Microrganismi procarioti: batteri, archea.
• Microrganismi eucarioti: protozoi, funghi (muffe e lieviti), alghe.
• Altri agenti infettivi: elminti, virus, prioni.

La maggior parte dei microrganismi, pur nella loro forma unicellulare, è in grado di avere una vita indipendente, cioè di crescere, di generare energia e di riprodursi indipendentemente dalle altre cellule sia dello stesso tipo che di tipo diverso. La vita microbica è dovunque e nell’equilibrio degli ecosistemi l’attività microbica svolge un ruolo fondamentale di supporto per la vita degli altri organismi viventi. Con l’uomo i microrganismi hanno stabilito relazioni sia utili che dannose; sia il buono stato di salute che molte malattie dell’uomo sono dovute ai microrganismi. L’uomo è da considerarsi un ecosistema complesso ed il numero di microrganismi presenti nell’organismo umano è elevatissimo e prende il nome di microbiota.

Il microbiota umano

Il microbiota umano è l’insieme di microrganismi simbiontici che convivono con l’organismo umano nei vari distretti anatomici senza danneggiarlo. Numerosi e fondamentali sono i ruoli svolti dai microrganismi presenti negli ecosistemi terrestri. Tra i principali ruoli benefici da essi svolti ritroviamo: il riciclo della biomassa, la regolazione della composizione dell’atmosfera, la definizione del fitoplancton e del suolo. Numerosi e fondamentali sono anche i ruoli svolti dai microrganismi che costituiscono il microbiota residente dell’ecosistema umano. Tra i principali ruoli benefici da essi svolti ritroviamo: la fortificazione del sistema immunitario, la competizione con microrganismi patogeni, sintesi di vitamine e degradazione di molecole complesse al fine di ricavarne energia.

Microrganismi patogeni

Infine vi sono i microrganismi patogeni che determinano danni più o meno gravi all’ospite. Tra questi vi sono i microrganismi responsabili delle malattie infettive nell’uomo. I microrganismi vengono classificati in:

• Microbiota: microrganismi che colonizzano l’organismo umano e solitamente non causano malattie.
• Patogeni opportunisti: microrganismi che normalmente non causano malattie, ma possono causarle in alcune circostanze.
• Patogeni franchi: microrganismi che causano sempre malattie.

La virulenza è la capacità di un microrganismo di indurre danno nell’ospite. La patogenesi è il decorso del processo infettivo. Inizialmente i fattori di virulenza determinano:

• Adesione: che è la prima fase nella colonizzazione dell’ospite; conferisce al microrganismo la capacità di resistere alla rimozione meccanica operata sulle mucose. Interazione specifica tra sostanze prodotte dal batterio e recettori sulla superficie della cellula ospite. È responsabile del tropismo di tessuto.
• Colonizzazione: è la fase successiva all’adesione e comporta la moltiplicazione batterica. Per moltiplicarsi un batterio deve: trovare un ambiente nutrizionale favorevole; superamento delle difese dell'ospite.
• Infezione: l’adesione e la colonizzazione dell’ospite da parte di un microrganismo patogeno o patogeno opportunista, non comporta, necessariamente, la comparsa di alterazioni dello stato di salute tipiche della malattia. Le difese dell’organismo, infatti, possono bloccare l’invasione del microrganismo senza che questi riesca a indurre danni nell’ospite. L’infezione può decorrere senza sintomi e in questo caso si parla di “infezione asintomatica”. Se invece compaiono dei sintomi, si instaura la “malattia”.

L’insorgenza della malattia, oltre che dalle difese dell’ospite dipende da:

• Infettività: abilità del microrganismo a stabilire un focolaio iniziale di infezione.
• Invasività: abilità del patogeno a diffondersi in altri tessuti sfuggendo ai meccanismi di difesa dell’ospite.
• Tossigenicità: abilità di un patogeno a produrre tossine.

I meccanismi di difesa dell’ospite sono:

• Aspecifici: barriere anatomiche, produzione di sostanze ad attività antimicrobica, complemento e lisozima, flora microbica normale.
• Specifica: immunità umorale, immunità cellulo-mediata, attività fagocitaria.

Riproduzione e curva di crescita

Il ciclo cellulare si divide in tre fasi:

1. Crescita: sintesi coordinata di macromolecole e di altri componenti cellulari;
2. Formazione del setto;
3. Divisione caratterizzata da una serie di reazioni che culminano nel trasferimento di una copia di DNA in ciascuna cellula delle cellule figlie.

La maggior parte dei batteri di interesse medico si riproduce mediante scissione binaria. Questo processo di riproduzione asessuata assicura alla cellula procariotica una esatta ripartizione del corredo cromosomico tra due cellule figlie, che risulteranno uguali. La divisione di un microrganismo per scissione si realizza attraverso fasi successive:

1. Inizialmente il corpo batterico si allunga per accrescimento sia della membrana citoplasmatica che della parete cellulare. Ciò avviene generalmente in corrispondenza del mesosoma o del sito di membrana a cui è ancorato il materiale nucleare. Durante questa fase si ha invaginazione della membrana citoplasmatica e aumento della parete cellulare. Manca il fuso mitotico, ma si forma un apparato “mitotico” primordiale nel quale risulta centrale la funzione della membrana citoplasmatica (mesosomi).
2. Contemporaneamente ha inizio la duplicazione del cromosoma batterico.
3. L’accrescimento in senso centripeto della parete cellulare e della membrana citoplasmatica porterà alla formazione, nella porzione centrale della cellula, di un setto traverso, che determinerà l’allontanamento dei due nuovi cromosomi per distanziamento delle zone della membrana citoplasmatica alle quali sono ancorati.
4. Con il completo sviluppo di questa struttura si otterrà la separazione delle due cellule figlie.

In alcuni casi il setto di parete cellulare, rimanendo a lungo incompleto genera la formazione di raggruppamenti di cellule caratteristici e diversi in rapporto ai successivi piani di divisione cellulare. La divisione batterica per scissione binaria determina la moltiplicazione del microrganismo in maniera esponenziale, così che, dopo tre divisioni, da una cellula batterica se ne formano otto. Il tempo di replicazione dipende da:

• Disponibilità nutrienti;
• pH;
• Temperatura;

L’intervallo di tempo necessario al batterio per riprodursi è detto tempo di duplicazione e varia tra i differenti microrganismi e a seconda delle condizioni di crescita. Le differenti specie batteriche presentano differenti temperature di crescita. Esiste un range di temperature all’interno del quale la crescita microbica può verificarsi:

• Psicrofili: microrganismi con un optimum di sviluppo tra i 15-20°C.
• Mesofili: a questo gruppo appartengono la maggior parte dei batteri patogeni per l’uomo. Essi crescono a temperature comprese tra i 20 e i 40°C con un optimum di temperatura di 36-37°C.
• Termofili: microrganismi che hanno un optimum di temperatura di circa 45°C.
• Stenotermofili: microrganismi che si moltiplicano a temperature superiori a 60°C.

I batteri presentano un’ampia variabilità nelle loro richieste di ossigeno gassoso:

• Aerobi obbligati: batteri che crescono solo in presenza di ossigeno atmosferico. Questi comprendono, soprattutto, patogeni delle vie respiratorie.
• Anaerobi facoltativi: batteri che sono capaci di crescere in condizioni aerobie e anaerobie.
• Anaerobi obbligati: batteri che possono vivere solo in assenza di ossigeno molecolare e per i quali la presenza ossigeno atmosferico è addirittura tossico. La maggior parte dei batteri anaerobi vive nel tratto gastrointestinale dell’uomo.
• Microaerofili: batteri che hanno bisogno per moltiplicarsi di un'atmosfera con una ridotta pressione parziale di ossigeno; essi non crescono o crescono molto stentatamente in presenza di aria, ma si moltiplicano bene in atmosfera addizionata di CO₂.

La maggior parte dei microrganismi richiede concentrazioni ottimali di ioni idrogeno, anche se possono moltiplicarsi in un range abbastanza ampio di pH. Il valore di pH ottimale per le specie patogene per l’uomo è compreso tra 6.5 e 7.5. Un microrganismo generalmente si moltiplica meglio in un terreno con concentrazione osmotica più bassa della propria. Ciò permette all’acqua di fluire nella cellula, condizione essenziale per la diffusione dei nutrienti. Altre concentrazioni osmotiche possono essere utilizzate per la conservazione degli alimenti. Infatti solo alcuni microrganismi sono in grado di moltiplicarsi in condizioni ipertoniche; questi batteri, detti osmofili o alofili, tollerano elevatissime concentrazioni di cloruro di sodio. In idonee condizioni alle quali il batterio si è completamente adattato, esso è in uno stato di crescita bilanciata. In tali situazioni la crescita batterica segue il principio di una reazione chimica di primo ordine: l’entità di crescita del batterio è proporzionale al numero o alla massa dei batteri presenti ad un determinato tempo.

Curva di crescita

Utilizzando un sistema di assi cartesiani semilogaritmico vengono riportati sull’asse delle ascisse i tempi di osservazione e sull’asse delle ordinate il numero dei batteri. Si otterrà una curva di crescita distinta in 4 fasi:

1. Fase di latenza (fase lag)
2. Fase di crescita esponenziale o fase logaritmica (fase log)
3. Fase stazionaria
4. Fase di declino o lisi

La fase di latenza è caratterizzata dall’aumento di volume della cellula, in assenza di divisione cellulare, dall’incremento di proteine, acidi nucleici, soprattutto acido ribonucleico. È in questa fase iniziale che il batterio ha necessità di adattarsi alle nuove condizioni ambientali, sintetizzando gli enzimi di adattamento che gli consentono di utilizzare i substrati necessari alla sua moltiplicazione.

Fattori che influenzano la durata della fase lag

La durata della fase lag dipende da numerosi fattori:

• Fattori dipendenti dall’inoculo: la durata della fase di latenza è inversamente proporzionale alla quantità dell’inoculo ed è direttamente proporzionale all’età delle cellule dell’inoculo, ossia alla fase di crescita in cui si trova la coltura da cui deriva l’inoculo. Se l’inoculo è costituito da cellule batteriche in fase di crescita logaritmica, la fase lag scompare.
• Fattori dipendenti dal terreno: la fase di latenza si allunga se l’inoculo proviene da un terreno diverso da quello utilizzato per lo studio della curva di crescita. È chiaro che in tal caso il tempo maggiore è necessario affinché la cellula possa sintetizzare gli enzimi di adattamento che le consentiranno l’utilizzo di nuovi substrati.

Alla fine della fase lag si assiste all’inizio delle divisioni cellulari e ad un incremento della velocità di crescita. Tale periodo della crescita batterica viene anche definito fase di accelerazione positiva della crescita. Subito dopo inizia la fase esponenziale o logaritmica (fase log). Il tempo di generazione (ossia il tempo che un certo numero di batteri impiega a duplicarsi) è costante e la velocità di crescita è massima e costante.

Fasi della crescita batterica

Verso la fine della fase log il tempo di generazione si allunga, la velocità di crescita va diminuendo e il tasso di moltiplicazione e di morte cellulare si equiparano. Questa fase è anche fase di accelerazione negativa della crescita. La fase di crescita log può essere distinta in tre parti:

1. Fase di accelerazione positiva, in cui il tempo di divisione aumenta e la velocità di crescita aumenta.
2. Fase di crescita esponenziale o logaritmica, in cui sia il tempo di divisione che la velocità di crescita sono costanti.
3. Fase di accelerazione negativa, in cui il tempo di divisione si allunga e la velocità di crescita diminuisce.

Alla fine della fase di accelerazione negativa, sia per l'esaurimento di sostanze nutritive sia per l’accumulo di metabolici tossici, sia per un fenomeno di inibizione da contatto, la popolazione batterica entra nella fase di crescita stazionaria. In tale fase un certo numero di cellule continua a moltiplicarsi con tempi di generazione più lunghi e con velocità di crescita molto bassa, altre cellule muoiono. Si stabilisce una sorta di equilibrio dinamico, per cui, di solito, il numero di cellule che muore equivale al numero di cellule che ancora si divide. La morte è una funzione esponenziale e si evidenzia come una riduzione lineare del numero di cellule vitali nel tempo. Il tasso di mortalità aumenta fino a raggiungere un livello costante. Tale fase può durare anche mesi, se un piccolo numero di cellule vive persiste nella coltura e continua a moltiplicarsi, utilizzando i metaboliti liberati dalle cellule lisate.

Cellula batterica

Per quanto riguarda la forma dei batteri, un batterio con morfologia sferica è detto cocco, un batterio a forma cilindrica è detto bacillo, la forma cilindrica ricurva su un solo piano caratterizza i vibrioni (caratteristica forma a virgola), batterio ricurvi su più piani prendono il nome di spirilli o spirochete. La forma di E. coli si definisce coccobacillare poiché la morfologia a bacillo è caratterizzata dai due poli terminali arrotondati. I batteri sono poi in grado di assumere conformazioni particolari come risultato della mancata separazione delle cellule dopo la divisione cellulare.

Strutture obbligatorie e facoltative

La cellula batterica è costituita da strutture obbligatorie e facoltative. Per strutture obbligatorie si intendono elementi strutturali indispensabili per la cellula batterica la cui assenza comprometterebbe la sua capacità di sopravvivenza. Queste sono:

• Il nucleoide
• Il citoplasma
• La membrana citoplasmatica
• I mesosomi (solo nei batteri Gram-positivi)
• La parete cellulare

Per strutture facoltative, si fa riferimento a strutture cellulari sia di superficie che citoplasmatiche, che caratterizzano alcuni batteri ma non tutti, la cui assenza con compromette la vitalità cellulare. Queste sono:

• Lo strato mucoso
• La capsula
• I flagelli
• I pili e le fimbrie
• Le inclusioni cellulari
• I plasmidi

I batteri vengono divisi in due grandi classi, batteri Gram-positivi e Gram-negativi, sulla base di differenze nella composizione di specifiche strutture cellulari. Prendendo in considerazione le strutture batteriche obbligatorie, possiamo affermare che i batteri Gram-positivi e Gram-negativi hanno strutture interne molto simili e strutture esterne molto diverse.

Strutture cellulari obbligatorie

Le strutture cellulari batteriche obbligatorie partendo dall’interno della cellula e procedendo verso l’esterno sono le seguenti:

• Citoplasma e nucleoide
• Membrana citoplasmatica
• Parete cellulare

La composizione del citoplasma è molto simile tra tutte le classi di batteri. Esso è costituito da:

• Acqua, sali, polisaccaridi, lipidi.
• Acidi nucleici (mRNA, DNA cromosomico presente in un’area definita nucleoide e plasmidi)
• Ribosomi liberi del tipo 70S, costituiti per il 60% di RNA e per il 40% da proteine.
• Proteine per la formazione del citoscheletro durante la divisione cellulare.
• Enzimi per la biosintesi di macromolecole e processi metabolici.

Tutti i batteri, a differenza delle cellule eucariotiche, sono sprovvisti di un nucleo vero e proprio, ma presentano il materiale genetico in una regione chiamata nucleoide immersa nel citoplasma cellulare.

Caratteristiche del nucleoide

• Può avere posizione centrale (nei Gram-positivi) o periferica (nei Gram-negativi).
• Il DNA è costituito da una singola molecola di DNA circolare a doppio filamento superspiralizzato (genoma aploide).
• Il DNA forma il cromosoma batterico attraverso l’interazione con poliammine cationiche quali spermina e spermidina che, complessandosi con il DNA, ne consentono la compattazione.

La membrana cellulare, in mancanza di organuli, è sede del trasporto di elettroni e produzione di energia. È sede di proteine di trasporto, pompe ioniche ed enzimi. Il cromosoma è costituito da un’unica molecola circolare di DNA a struttura bicatenaria. Governa la trasmissione dei caratteri da una cellula alle generazioni successive. Presiede alla sintesi dei fattori che regolano il metabolismo cellulare. Il mesosoma è una porzione della membrana citoplasmatica invaginata, punto di ancoraggio e duplicazione del DNA batterico. La parete cellulare racchiude in un contenitore rigido la cellula batterica e la protegge dalla lisi osmotica.

Distinzione tra Gram-positivi e Gram-negativi

I batteri possono essere divisi in due gruppi principali detti Gram-positivi e Gram-negativi. La distinzione è basata sulla loro reazione alla colorazione di Gram. La parete cellulare dei Gram-positivi ha una struttura spessa e multistratificata abbastanza uniforme, formata principalmente da peptidoglicano, un polimero polisaccaridico. Il peptidoglicano rappresenta una sorta di esoscheletro per la cellula con la caratteristica di essere sufficientemente poroso da permettere la diffusione di metaboliti verso la membrana citoplasmatica. La parete dei Gram-positivi può anche includere altri componenti come acidi teicoici e lipoteicoici e complessi polisaccaridici. Al peptidoglicano sono associate anche proteine. La parete cellulare dei Gram-negativi è più complessa di quella dei Gram-positivi sia strutturalmente che chimicamente e risulta formata da strati ben distinguibili. Contiene due strati esterni alla membrana citoplasmatica:

• Immediatamente esterno alla membrana