Microbiologia

MICROBIOLOGIA

 Storia della microbiologia

 Struttura e funzioni della cellula procariote

 Crescita e metabolismo microbici

 I metodi della microbiologia

 Habitat microbici e cicli biogeochimici

 Genetica microbica

 Cenni di virologia

 Interazione tra microrganismi e con altri organismi

Gli organismi microscopici vengono definiti sulla base della dimensione del loro organismo.

Sono organismi unicellulari. Molti di questi possono avere un organizzazione che prevede

l’aggregazione di diverse cellule che hanno ruoli diversi, anche se non possono essere definiti

pluricellulari.

Hanno una dimensione nell’ordine dei micrometri.

I microrganismi esistono in tutti e tre i domini della vita: batteri, archea, eucarioti. Batteri e archea

sono anche chiamati procarioti, in cui ci sono unicamente microrganismi.

Nel dominio degli eucarioti ci sono organismi unicellulari come funghi e alghe unicellulari.

I microrganismi, specialmente quando formano colonie microbiche, si possono vedere ad occhio

nudo ma non si ha la percezione cellulare.

Nel 1600 nasce la microbiologia, grazia allo sviluppo dei primi microscopi che permettono di

individuare organismi piccoli nelle matrici ambientali (acqua e aria).

La microbiologia infatti è nata principalmente a scopi sanitari e si occupa anche di virus, non vere e

proprie forme di vita, ma sono entità, parassiti intracellulari obbligati che vivono alle spese e

unicamente in presenza di un ospite (ospite batterico o organismo eucariotico).

La microbiologia è importante anche perché è riuscita ad isolare ceppi microbici in coltura pura,

grazie a Koch e Pasteur che hanno sviluppato le tecnologie necessarie per far crescere su un

terreno solido colonie microbiche e poter quindi isolare i microrganismi dall’ambiente in cui

vivono (o da organismi animali). Si usano piastre Petri per la coltura pura su terreni sintetici di

crescita.

Koch ha stabilito 4 postulati, che stabilivano quando un determinato agente microbico/batterico

poteva essere considerato l’agente eziologico, quindi l’agente biologico che causa una

determinata malattia.

Oltre al microscopio e ai terreni di colture è importante anche possono essere studiati anche

nell’ambiente (o in coltura pura) attraverso l’utilizzo di tecniche molecolari. Le tecniche molecolari

permettono di andare a studiare le caratteristiche microbiche, il metabolismo microbico partendo

dalle molecole che compongono la cellula. L’informazione genetica che ci dà sul metabolismo e le

caratteristiche dei vari organismi è contenuta nel DNA, negli acidi nucleici, nell’RNA messaggero e

ribosomale. Possono essere utili queste tecniche per studiare la diffusione nell’ambiente, naturale

o industrializzato, in associazione con ospiti.

Queste tecniche molecolari possono essere utilizzate in due diverse circostanze: 1) su una coltura

pura, un singolo organismo isolato in una piastra petri (es in coltura liquida) e usiamo tecniche di

sequenziamento per capire il suo genoma, e quindi gli enzimi e le proteine che può sintetizzare. 2)

studio nelle comunità complesse presenti nell’ambiente, il DNA studiato è un DNA misto che

presenta componenti che derivano da organismi diversi (DNA metagenomico). Di conseguenza lo

studio di questi DNA di diverse origine ci permette di studiare comunità microbiche anche

complesse. All’aumentare del numero di microrganismi la microbiologia copre un arco di ambiti

molto vasto che deve essere investigato con tecniche differenti. Vengono usate tecniche omiche,

che raccolgono diversi dati.

ALBERO FILOGENETICO: distanza genetica equivale a una distanza evolutiva. Il dominio dei batteri

è estremamente vasto. C’è una notevole distanza evolutiva fra i batteri e gli altri organismi

(archea, eucarioti). Con filogenetica si intendono i rapporti evolutivi fra gli organismi. Tipo gli

archea sono simili come struttura della cellula ai batteri perché entrambi fanno parte dei

procarioti, ma evolutivamente sono più vicini agli eucarioti. Ci sono degli organismi che non si è

ancora riusciti ad isolare in coltura pura, principalmente in un phylum (candidate phyla radiation)

dei batteri. Quindi in questa zona dell’albero lo studio di questi batteri e del loro DNA è avvenuto

non in coltura, ma nell’ambiente, senza essere isolati.

Inoltre, diversità evolutiva significa anche maggiore diversità metabolica, diversa capacità di

sintetizzare enzimi e concatenare reazioni chimiche, catalizzate da questi enzimi, che gli hanno

permesso di avere proprietà di biosintesi e di degradazione, di resistenza ad ambienti con

condizioni estreme, che fa dei microrganismi il gruppo maggior distribuito nella biosfera. I

microrganismi hanno queste caratteristiche grazie alla loro 1) capacità riproduttiva (es un

miliardo di batteri in un gr di suolo, o circa un milione in un ml di acqua di mare). Quindi sono

predominanti dal punto di vista numerico, non di biomassa 2) capacità emergenti che derivano

dai processi evolutivi, da una variazione a seguito della selezione naturale dell’abbondanza delle

tipologie metaboliche e da un’evoluzione molecolare, quindi un accumularsi di variazioni nel

genoma degli organismi che vengono amplificati grazie alla presenza di numerose generazioni in

un arco temporale ristretto. La duplicazione avviene per divisione cellulare asessuata, ma usano

dei meccanismi che permettono di scambiare il materiale genetico che permette lo svilupparsi di

nuove capacità che vengono poi selezionate dall’ambiente.

Si può assumere che i primi organismi evolutisi sulla terra sono stati batteri. Quindi il tempo che

hanno avuto per evolversi, per accumulare capacità è infintamente più grande rispetto a quelli

successivi. Capacità di adattarsi e di sfruttare le risorse. Infatti la lotta ai microrganismi, ai patogeni

dell’influenza con gli antibiotici è contrastata dalla capacità dei batteri di sviluppare in maniera

rapida l’effetto degli antibiotici.

La microbiologia attinge a diverse scienze, perché si basa su organismi biologici che vivono in

ambienti molto diversi e con capacità molto diverse. Basi di genetica, chimica, ecologia, biologia..

Quindi può essere divisa in sottodiscipline: virologia, ecologia microbica, genetica, microbiologia

medica. Quindi la microbiologia è importante per lo studio di processi biologici universali.

I microrganismi hanno un ruolo fondamentale nell’ambiente, ad esempio nei cicli biogeochimici.

LEZIONE 5/03 STORIA DELLA MICROBIOLOGIA

Solo dal 19esimo secolo si ha la possibilità di studiare i microrganismi in laboratorio: terreni

sintetici (o naturali) di crescita.

Possiamo vedere i microrganismi in forma aggregata, ad esempio i corpi fruttiferi nei funghi,

biophylm, colonie nei terreni ricchi, o la muffa, i batteri sui cibi.

L’uomo è riuscito a sfruttare le loro capacità metaboliche: panificazione, fermentazione, yogurt,

formaggi. I microrganismi ci fanno ammalare: batteri e funghi (entità biologiche) o i virus (parassiti

intracellulari, non forme di vita)

1° RIVOLUZIONE TECNOLOGICA: avvento del microscopio nel 17esimo secolo. Robert Hooke

(1635-1703) nel 1665 pubblicò l’esatta descrizione di un microscopio con una sola lente e disegni

di corpi fruttiferi di funghi. Già con galileo si è visto la presenza di strumenti utilizzati per

l’osservazione (telescopio).

Ma la nascita della microbiologia nasce con un commerciante di stoffe a Delft in Olanda, Antonj

van Leeuwenhoek (1632-1723), che fu il primo a descrivere i batteri, lieviti e protozoi. Si era

appassionato alla costruzione di microscopi che potevano raggiungere ingrandimenti di circa 50-

300 volte. Nel 1676 descrisse e disegnò le cellule di alcuni “animalcules”, batteri e lieviti. Dopo

queste iniziali scoperte l’esplorazione del mondo microbico si è arrestata per circa 100 anni.

Nel 1800 la rivoluzione continua. Ferdinand Cohn (1828-1898) studiò per primo le alghe

unicellulari e il batterio Beggiatoa. Paul Ehrlich (1854-1915) sviluppa nel 1881 la “colorazione

vitale” dei batteri con blu dimetilene. Nel 1884 Hans Christian Gram (1853-1938), medico e

farmacologo danese, sviluppò un metodo di colorazione differenziale che da lui prese il nome di

colorazione Gram.

Il dibattito scientifico e filosofico sulla generazione spontanea è durato fino alla fine del XIX secolo.

Da sostanza organica (es cibo) si vedevano nascere ed evolvere diversi organismi: larve di insetti,

mosche, topi nelle grosse derrate alimentari. Quindi si pensava che questo processo riguardasse

una trasformazione spontanea della sostanza inanimata a sostanza animata. La sua confutazione

ha richiesto lo sviluppo della teoria cellulare (gli organismi si basano su un’unità fondamentale,

che è la cellula, che viene ripetuta nel caso degli

organismi pluricellulari) e della biogenesi.

TEORIA DELLA GENERAZIONE SPONTANEA: il medico

Francesco Redi nel 1668 fece uno dei primi tentativi di

confutazione di questa teoria.

ESPERIMENTO A: pezzo di carne in un contenitore

aperto: arrivano mosche e larve.

ESPERIMENTO B: se mettiamo sopra un pezzo di carta,

per un po’ di tempo non vediamo la presenza di mosche

e larve. Lo proteggiamo da qualcosa di esterno. Questa

è già una confutazione che la vita non deriva dalla carne.

ESPERIMENTO C e D: il contenitore viene coperto da una

garza, che fa passare l’aria, ma non permette il

passaggio di particelle grossolane, mosche o altri corpi

di dimensioni superiori. E si comporta come

l’esperimento B. Quindi il fattore arriva da fuori. Ciò si

può provare prendendo la garza usata nell’esperimento

C e lo mettiamo sulla carne in un barattolo sigillato. Si sviluppano mosche perché era la garza

contaminata, nonostante il barattolo fosse sigillato.

Redi conclude che quando si ha una generazione di mosche e di larve non derivano dalla carne,

non sono dovute all’aria, ma alla presenza di organismi esterni che in qualche modo seminano la

vita, anche quando la carne viene richiusa in un contenitore ermetico.

Un'altra teoria diceva che certe soluzioni liquide nel tempo andavano incontro ad un certo

intorbidimento, dovuto alla presenza di

microrganismi in queste soluzioni ricche di nutrienti.

E in questo caso il dubbio della generazione

spontanea si mantiene. La confutazione successiva

deriva da due scienziati, Spallanzani e Pasteur.

L’esperimento di Spallanzani consiste in un brodo che

in assenza di trattamento termico sviluppa come

atteso una torbidità. Questo avviene sia in un

contenitore aperto all’aria che in uno

successivamente chiuso. Questo non confuta la

teoria (della generazione spontanea), perché anche

in un contenitore chiuso ci sono microrganismi.

Allora Sapallanzani tratta il brodo termicamente e

divide il brodo in una aperta e una chiusa.

L’intorbidimento avviene solo nella beuta aperta,

nella maggior parte dei casi. Alcuni organismi

sporigici resistano al calore. In un certo senso

comunque Spallanzani confuta la generazione

spontanea, anche dei microrganismi. L’obiezione fu

che la bollitura distruggeva anche la “forza vitale”, e una volta chiuso il contenitore non può

arrivare dall’aria. Un secolo dopo Louis Pasteur confutò definitivamente la teoria della

generazione spontanea.

ESPERIMENTO: usa una fiasca in cui viene versato del brodo non sterile, la differenza è che la

fiasca viene modificata e si forma un collo a forma di collo di cigno che avendo una curvatura verso

il basso permette all’aria di entrare nella fiasca, ma fa depositare il materiale pulviscolari. Per

prima cosa Pasteur sterilizza con il calore il collo della fiasca ed il liquido. Crea condizioni sterili. Se

si lascia questa fiasca, nonostante ci sia libero accesso all’aria, questa fiasca non mostra torbidità.

Ciò è diverso da quello che era successo nell’esperimento di Spallanzani, dove il liquido era stato

sterilizzato, ma lasciandolo all’aperto entrava particolato e portava a torbidità. Nel caso di Pasteur,

se dopo un po’ di tempo la fiasca viene inclinata e una parte del liquido entra in contatto con il

materiale depositato sull’ansa, e poi la fiasca viene raddrizzata, dopo poco tempo si sviluppano dei

microrganismi e la sostanza va in putrefazione. Ciò confuta la teoria della generazione spontanea,

perché in teoria questa forza vitale era presente nell’aria, allora poteva entrare in contatto con la

soluzione sterilizzata. Ma anche se ciò è avvenuto, questo non ha portato allo sviluppo della

crescita microbica. Il fatto che avvenga solo a contatto fra liquido e materiale viene interpretato

con la presenza di microrganismi all’interno di questo materiale.

Grazie a questa confutazione si afferma anche la teoria cellulare e la teoria della biogenesi, che

postula che ogni cellula deriva da un’altra cellula, ogni organismo vivente è generato da un altro

organismo vivente. Questa teoria si sviluppa in concomitanza delle teorie evolutive di Lamarck e

Darwin. Ma manca un correlazione con una teoria sull’origine della vita.

SVILUPPO DELLE TECNICHE DI BASE: Robert Koch (1843-1910) sviluppò un metodo per coltivare i

microrganismi su terreno solido attraverso l’uso di gelatina o l’uso di fette di patata sulla cui

superficie potevano crescere microrganismi formando delle specie di colonie. Walter Hesse,

introdusse l’uso dell’agar come agente solidificante per i terreni di crescita. Julius Petri, nel 1887

introdusse l’uso di scatole di vetro, le capsule (piastre) di Petri. Ciò permette l’isolamento dei

microrganismi in coltura pura.

Una colonia microbica è un clonale di cellule che si sono generate da un’unica cellula. Le colonie

possono essere molto diverse fra di loro, per colore, forma, grandezza, bordi più o meno

frastagliate, alcune più lucide; hanno strutture di aggregazione cellulare molto diverse, hanno una

morfologia di colonia molto diversa. Se una colonia è separata dalle altre si può assumere che è

una coltura pura. La capacità di separare organismi in contenitori differenti è stata molto

importante per studiarli.

MALATTIE INFETTIVE: era uno degli aspetti più rilevanti di quel tempo. Patogenicità: proprietà di

alcuni organismi di causare malattie in ospiti. Ciò era già stato postulato nel 1550, che la

trasmissione della malattia potesse essere a distanza, cioè che ci potesse essere un trasferimento

della malattia tra organismi non a contatto. Quindi esisteva un mezzo che metteva in contatto i

due organismi. Dopo essere stati individuati, si cominciò a studiare se quei batteri, i funghi

potessero essere degli agenti patogeni. La teoria microbica delle malattie è dovuta al lavoro di

Robert Koch e Luis Pasteur.

Koch isolò per la prima volta un microrganismo causa di malattia e dimostrò che Bacillus anthracis

è l’agente eziologico del carbonchio (antrace). Koch isolò Mycobacterium tubercolosis e il vibrione

del colera. Sviluppò i criteri generali/sperimentali per definire se un determinato agente biologico

è causa di una malattia (postulati di Koch, possibile domanda).

4 POSTULATI: nella teoria dovevano essere tutti verificati per determinare se un agente microbico

era l’agente patogenico/eziologico di una malattia.

1. Il sospetto patogeno deve ritrovarsi in tutti i casi di malattia ed essere assente negli animali

sani. (Riconoscimento attraverso microscopia, colorazione...)

2. Il sospetto patogeno deve poter crescere in coltura pura. Si doveva poterlo far crescere in

coltura pura.

3. Le cellule provenienti da una coltura pura del sospetto patogeno devono introdurre la

malattia in animali sani. (Cavie)

4. Il sospetto patogeno deve poter essere nuovamente isolato e se ne deve poter dimostrare

l’identità con l’originale. Questo doveva dare secondo Koch la certezza che quel

determinato agente patogeno fosse effettivamente quello responsabile di quella

determinata malattia. (Nuovo isolamento in laboratorio e coltura)

Adesso le cose non sono poi così tanto lineari, anche se sicuramente se i 4 postulati sono rispettati

allora l’agente patogeno è considerato l’agente eziologico di quella malattia. Ora sappiamo che

alcuni organismi patogeni possono essere presenti anche in soggetti sani e possono svilupparsi

successivamente. Non tutti gli organismi sono coltivabili, quindi può esistere l’agente patogeno ma

non lo possiamo coltivare (postulato 2). Dipende anche dalla risposta immunitaria del soggetto,

quindi l’esposizione non per forza implica uno sviluppo della malattia.

Ora questi postulati tendono essere trasferiti anche nell’ambito molecolare, con l’obiettivo di

definire il gene, e quindi il determinante genetico della patogenicità e della virulenza all’interno

degli organismi. In questo caso non parliamo di un organismo, di un batterio, ma dei determinanti

genetici che presenti in un microrganismo specifico ne conferiscono patogenicità. Questo deriva

dal fatto che non sempre la tassonomia microbica è così semplice; ci possono essere organismi

simili che possiamo attribuire allo stesso genere o specie, qualche individuo può essere patogeno,

un altro no (dipende dai geni).

POSTULATI DI KOCH MOLECOLARI:

1. Per determinare se un determinato gene conferisce patogenicità questo gene deve essere

presente in tutti gli organismi patogeni. Se il ceppo microbico conferisce malattia e

attribuiamo a quel determinante genetico la malattia, allora quel determinante genetico

deve essere presente nella specie patogena, e assenta in quella non patogena (es sigella

virulento, escherichia coli no).

2. Se inattiviamo il gene implicato questo deve portare alla diminuzione misurabile della

patogenicità o virulenza.

3. La complementazione o reversione della mutazione deve ripristinare