Microbiologia

MICROBIOLOGIA PER I BENI CULTURALI

Prof.ssa Cappitelli

A.A. 2017/2018 1

INDICE

3.......... Realzioni filogenetiche tra cellule procariote (Bacteria e Archea) e cellule eucariotiche

5.......... Biodeterioramento. Meccanismi: processi chimici, processi fisici e danni estetici

8.......... Biorecettività

10........ Biodeteriogeni

10.....Batteri (inclusi attinobatteri e cianobatteri)

17..... Alghe eucariote

18..... Funghi

20..... Licheni

22.........Fattori limitanti - Influenza dei fattori ambientali sulla crescita microbica (nutrienti, pH,

temperatura, ossigeno ecc.)

26.........Metabolismo - Esigenze nutrizionali dei microrganismi e tipi nutrizionali. Metabolismi energetici

(Respirazione aerobica. Respirazione anaerobica)

31.........Ecologia microbica

31..... Coltivazione

35.....Osservazioni al microscopio - Introduzione alla microscopia. Campo chiaro, contrasto di fase,

fluorescenza, tecniche di colorazione con fluorocromi (DAPI, FISH, immunofluorescenza) e 2

saggi immunoenzimatici (ELISA). Citometria. Microscopia elettronica.

42.....Indagini molecolari

46..........Aerobiologia

49..........Biofilm

56.....Deterioramento microbiologico dei beni culturali costituti da materiali organici (carta, papiro,

tessuti, legno, film fotografici, ambra, polimeri sintetici).

71.....Deterioramento microbiologico dei beni culturali costituti da materiali inorganici (piastrelle,

vetro, metalli)

78......... Metodi indiretti di prevenzione. Temperatura, umidità relativa. Sostanze anti-biofilm

84......... Metodi diretti di controllo

89.....Metodi chimici (biocida)

93..... Metodi non chimici (rimozione meccanica, radiazioni, plasma)

95..... Metodi biologici (proteine, enzimi)

102........Biopulitura con microrganismi ed enzimi

109........Biocalcificazione. Formazione di biopatine.

RELAZIONI FILOGENETICHE

La cellula è l’unità base di tutti gli organismi viventi. Esistono due tipi

di cellule:

• Cellula procariotica

• Cellula eucariotica

La cellula eucariotica è una decina di volte più grande della cellula

procariotica.

Nella cellula procariotica non ci sono né mitocondri né cloroplasti;

nella cellula eucariotica ci sono i mitocondri mentre per i cloroplasti

dipende dal tipo di organismo (chi fa fotosintesi si, chi non la fa no).

Nella cellula procariotica si trova la parete, nella la cellula eucariotica

dipende (cellula vegetale si, cellula animale no).

Nella cellula procariotica c’è un solo cromosoma (singola molecola di

DNA circolare), in quella eucariotica ce ne sono molti. Il cromosoma è

l’elemento genico che porta i geni essenziali per le funzioni cellulari.

Il singolo cromosoma dei procarioti si trova immerso nel citoplasma,

l’area in cui si trova si chiama nucleoide (area non circondata dalla

membrana nucleare); negli eucarioti si trova nel nucleo, il quale è

delimitato dalla membrana nucleare (differenza più importante).

Il genoma è l’insieme di tutti i geni di una cellula.

Struttura del DNA 3

DNA e RNA sono formati da subunità chiamate nucleotidi. I

nucleotidi sono uno zucchero a 5C, più una base azotata, più un

gruppo fosfato.

La lunghezza del DNA è espressa in kilobasi (basi perché c’è la base

azotata); una kilobase è un frammento di 1000 paia di basi in una

molecola a doppio filamento.

Un organismo procariote usato come modello è l’escherichia coli, il

quale ha 4600 kilobasi e misura circa 1 mm.

Se totalmente disteso il DNA è circa 1000

volte la lunghezza di una cellula, deve

quindi essere strettamente attorcigliato in

superavvolgimenti.

Il superavvolgimento serve per

impacchettare (10% dell’intero volume delle cellule) la forma

circolare, rilassata, serve per la replicazione.

La replicazione si ha quando si ottengono

più copie del DNA.

Trascrizione da DNA a RNA: sintesi di RNA complementare ad un singolo filamento

di DNA a doppio

Traduzione da RNA a proteine: sintesi di una proteina con l’ausilio di un ribosoma

che utilizza l’informazione trasmessa dall’mRNA.

La sintesi delle proteine avviene a livello dei ribosomi. I ribosomi sono fatti da RNA

ribosomiale e da proteine. Formati da due subunità (sia per cellule eucariote che

procariote). I ribosomi dei

procarioti sono di tipo 70

unità svedberg (70s). Le

unità svedberg sono unità di

sedimentazione quando si

centrifuga l’RNA. Ciascuna

delle due subunità (50s e

30s) è fatta da proteine e

RNA ribosomiale. Nella

subunità più

piccola di trova

il 16s RNA, questo serve per la classificazione degli organismi

viventi.

Filogenesi

La classificazione oggi non si occupa più dei regni, ma differenzia

secondo 3 domini:

• Bacteria

• Archea

• Eukarya

La classificazione è cambiata perché all’inizio si faceva un

riconoscimento morfologico, ora invece è basata su metodi

molecolari (studiano il DNA). Con i nuovi metodi si è arrivati alla

classificazione di tutti gli organismi viventi in uno di questi 3 domini.

Il dominio bacteria e il dominio archea sono fatti da cellule procariote. 4

Un gene codifica per l’mRNA, che codifica per una proteina, ma ci sono geni

che codificano anche per Rrna e tRNA. Un gene è un segmento di DNA che

codifica per un prodotto funzionale, generalmente una proteina ma anche

tRNA e rRNA.

L’analisi filogenetica si basa sullo studio dei geni che codificano per 16S rRNA, per i procarioti, e 18S rRNA,

per gli eucarioti. Per classificare gli organismi viventi serve qualcosa che hanno in comune ed è sempre

presente: i ribosomi, che hanno la caratteristica di essere presenti in tutte le cellule. L’RNA che questi

conservano ha delle parti molto conservate e delle parti molto differenti in termini di nucleotidi. Gli

organismi si differenziano in base alla sequenza di nucleotidi, che corrisponde al gene, che codifica per il

16s RNA nel caso per procarioti e per il 18s RNA nel caso degli eucarioti.

All’interno di ogni dominio ci sono organismi diversi e tanto più distanti sono tra loro, quanto più sono

diversi tra di loro. Quelli a sinistra sono identificati per il gene che codifica per il 16s RNA, quelli a destra

(viola) sono indentificati tramite il gene che codifica per il 18s RNA.

BIODETERIORAMENTO

Biodeterioramento: qualsiasi modificazione indesiderata nell’aspetto e nelle proprietà di un materiale che

costituisce il bene culturale dovuto all’attività di organismi viventi.

Si tratta quindi di un concetto negativo, mentre la biodegradazione ha valenza positiva (es. batteri che

mangiano il petrolio nei mari).

Come fanno gli organismi viventi a causare un danno ad un bene culturale?

1. Processi fisici: si sviluppano in superficie ed in profondità con effetti sulle

caratteristiche meccaniche e strutturali del materiale. Es. muffa sul libro

bagnato, che penetra all’interno.

Alterazioni microstrutturali e macrostrutturali:

• fessurazioni

• decoesione

• fratturazioni

• disgregazione

• rigonfiamento

• caduta

2. Processi chimici: Si sviluppano in superficie e nei primi strati del materiale con variazioni della

composizione per azione diretta di prodotti metabolici intermedi e di scarto dei biodeteriogeni.

Trasformazione di qualcosa: uso del substrato a fini nutrizionali ed emissione di metaboliti.

• Processi di assimilazione → fonte di C ed energia

• Processi di escrezione → materiale danneggiato per rilascio metaboliti

Impoverimento del substrato

• polverizzazione

• dissoluzione

• corrosione 5

3. Alterazione estetica: il microorganismo cambia il colore del substrato su cui cresce (es. macchie).

I danni possono essere:

• diretti: degradazione del materiale

• indiretti: la presenza di organismi facilita l’attacco biologico da parte di altri organismi

colonizzatori.

2. Danni dovuti all’uso del materiale del bene culturale come nutriente, o dovuti ai prodotti di scarto

dell’organismo.

Acidolisi

Gli organismi rilasciano acidi e basi (alcuni anche complessanti, es. ac. lattico) che possono reagire con le

molecole del substrato: formazione sostanze solubili.

• acidi organici: formico, acetico, butirrico, lattico;

• acidi inorganici: carbonico, nitrico, solforico.

Alcalinolisi

• 4+

composti basici: NH NaCO -

3

La loro azione indiretta è dovuta alla formazione di un ambiente acido/basico che permette lo

sviluppo di organismi acidofili/basofili.

Complessolisi

Chelazione = fenomeno in cui un atomo metallico è condiviso da 2 atomi di una molecola organica per

formare un composto stabile ad anello. Molti composti organici (in particolare acidi es. acido ossalico)

possono agire da agenti complessanti del substrato.

Scambio di ioni

Si verifica quando gli organismi assorbono cationi metallici necessari alla loro nutrizione o per l’equilibrio

osmotico cedendo contemporaneamente altri cationi = flusso bidirezionale di cariche.

Degradazione enzimatica

Gli enzimi sono proteine, alcuni di questi enzimi vengono rilasciati

all’esterno della cellula. Tramite idrolasi questi tagliano una molecola

complessa, dando luogo a molecole più semplici, quindi attaccando i

costituenti del bene culturale.

L’attività enzimatica è influenzata dalle condizioni chimico-fisiche (pH, T,

UR)

Enzimi con differenti attività:

• scissione o idrolisi = idrolasi

• formazione di legame accoppiata con rottura di un trifosfato =

ligasi

• eliminazione di gruppi (formazione di doppi legami) = liasi

• trasferimento 1 gruppo = transferasi

• reazioni redox = ossidoreduttasi

• modificazione della struttura = somerasi

- ENDOENZIMI: attivi all’interno della cellula

- ESOENZIMI: escreti all’esterno, attivi nell’ambiente, più dannosi perché degradano i

substrati per renderli assimilabili.

Es: complesso Cellulasi → insieme di enzimi degradativi della cellulosa,

es. fibre tessili vegetali. Solo pochi organismi possiedono tutta la serie

completa, tanti sono privi del primo enzima → degradano cellulosa

parzialmente attaccata da altri organismi.

Es: Proteasi → degradazione di pergamene, pellami ecc. 6

Es: Tannasi → degradazione dei tannini nella carta e legno prodotte soprattutto da muffe (Aspergillus niger,

Penicillum glaucum).

Danni estetici

Alterazione della visione superficiale del manufatto e del modellato, si sviluppano solo in superficie.

• Patine

• Macchie

• Croste

• Velature

Colorazioni evidenti ad una semplice osservazione macroscopica, non è sempre separabile da altri tipi di

danni.

Pigmenti

Composti organici contenenti un elevato numero di doppi legami che li rende capaci di assorbire le

radiazioni luminose nello spettro del visibile e dell’infrarosso vicino → luce riflessa conferisce la colorazione

corrispondente. La colorazione assunta varia in funzione della:

• composizione chimica del substrato

• presenza elementi metallici

• pH mezzo

• presenza di altre specie

ENDOPIGMENTI: all’interno dell’organismo sono rilasciati solo per lisi cellulare es. fotosintesi (clorofille,

carotenoidi, ficobiline).

ESOPIGMENTI: escreti all’esterno diffusi nell’ambiente circostante, azione inibitoria o di antibiotico prodotti

soprattutto dai funghi.

Fenomenologia delle alterazioni

Aspetto o apparenza con cui si presenta l’alterazione, molto importante per riconoscere il tipo di attacco,

per risalire alle cause e distinguerlo da altri non biologici.

Possono sussistere dei dubbi sulla natura biologica del degrado quando non c’è presenza significativa di

agenti biologici. Questi infatti possono essere scomparsi da tempo, ma i prodotti della loro attività

metabolica sono rimasti.

• Macchie = natura chimica o natura biologica Es. foxing della carta

• Esfoliazione = per azione dei solfoossidanti o nitrificanti e riconducibili all’azione di SO , NO

2 x

• Efflorescenze = tipiche attinobatteri o aggregati di sali minerali

• Patine nere = dovute ai cianobatteri o a depositi di inquinanti atmosferici

• Corrosione dei metalli = difficile distinguere quella di origine chimica da quella biologica.

Gli ambienti in cui si possono trovare possono essere suddivisi in CONFINATI (musei, gallerie, archivi,

biblioteche, chiese ecc.) ed ESTERNI.

Articoli da leggere

• Miller, A.Z., Sanmartín, P., Pereira-Pardo, L., (...), Macedo, M.F., Prieto, B. Bioreceptivity of building

stones: A review. 2012. Science of the Total Environment 426, pp. 1-12.

• Guillitte, O. Bioreceptivity: a new concept for building ecology studies. 1995. Science of the Total

Environment 167 (1-3), pp. 215-220. 7

BIORECETTIVITA’

La biorecettività è l’attitudine di un materiale ad essere colonizzato da organismi viventi senza

necessariamente subire alcun biodeterioramento (Guillitte, 1995).

Si esclude in questo modo il passaggio transitorio e fortuito degli organismi (es. spore che si depositano

senza germinare).

Tutti i materiali possono essere colonizzati e perciò sono tutti biorecettivi.

La colonizzazione dipende da:

• caratteristiche intrinseche del materiale

• ambiente in cui è esposto.

Grado di biorecettività è funzione:

• natura chimica e fisica

• due materiali ≠ possono avere biorecettività ≠ anche nelle stesse condizioni ambientali

• presenza di sostanza organica (inquinanti organici, trattamenti conservativi precedenti)

• stato di degrado

• stadio di colonizzazione già in atto (colonizzatori primari)

Biorecettivitaà del materiale lapideo

Tutte le proprietà del materiale che contribuiscono allo stanziarsi e

svilupparsi di organismi.

• Primaria: per tutto il tempo che il materiale rimane in condizioni

simili o identiche allo stato iniziale.

• Secondaria: dovuta al fatto che le caratteristiche del materiale

cambiano con il tempo.

• Terziaria: tutte le attività umane che causano cambiamenti nella

proprietà del materiale. Es. consolidamento. 8

Estrinseca: particelle o sostanze che si depositano sul materiale e ne

modificano la biorecettività. Es. sporco.

La biorecettività aiuta a capire il biodeterioramento e fornisce informazioni per come selezionare i materiali

per la conservazione degli edifici (durabilità).

Test di biorecettività:

• la maggior parte degli studi condotti in condizioni di laboratorio con inoculi artificiali

• Litotipi italiani marmo di Carrara e Pietra di Lecce i più studiati

• Test generalmente con 1 specie. Nella realtà atipico (interazione tra m.i. diversi determinante).

Pietre studiate:

• calcário ançã (CA), pietra calcarea

• calcário lioz (CL), pietra calcarea

• piedra San Cristobal (SC), calcarenite

• piedra Escúzar (PF), biocalcarenite

• pietra di Lecce (PL), pietra calcarea

Es. biofilm verde da calcário ançã del monastero Santa Clara-a-Velha in Coimbra (Portogallo).

Identificazione tramite tecniche molecolari (alghe verdi: Chlorella, Stichococcus, Trebouxia e

Myrmecia; cianobatteri: Leptolyngbya e Pleurocapsa), coltivazione in terreno BG11 per 3 mesi.

Come si comportano: Inoculo: CL assorbimento quasi inesistente; rapido assorbimento CA e

PL, per elevata porosità; rapidissimo per SC e PF per pori larghi.

• 1 mese: colorazione verde per tutti tranne CL

• Mesi successivi: colorazione tende al marrone con l’eccezione in senso verticale di SC e PF

Un metodo per stimare la quantità di m.i. presenti sulla superficie, se questi fanno fotosintesi, è quello di

studiare la quantità di clorofilla a prodotta. Si può fare in due modi:

• Tramite spettrofluorimetro;

• Tramite estrazione con solvente (DMSO).

Questi due metodi servono per vedere quanta biomassa c’è in

superficie rispetto a quanta biomassa in totale. 9

AGENTI BIOLOGICI

Molti organismi possono avere un ruolo nei confronti di un materiale che costituisce un bene culturale:

• batteri (inclusi attinobatteri e cianobatteri)

• alghe

• funghi

• licheni

• muschi e piante

• animali (uccelli, uomo, insetti)

BATTERI

Quando si parla di batteri si parla di cellule procariote

unicellulari.

Alcune specie sono in grado di formare endospore.

Si riproducono per divisone binaria molto rapida.

Hanno varie forme:

• cocchi → forma sferica, formano catenelle

• bastoncini → forma bastoncellare

• vibrioni → ricurvi (a boomerang) 10

I batteri micelliari sono batteri che per forma assomigliano ai

funghi, ma in realtà non lo sono perché i batteri sono procarioti mentre i funghi sono eucarioti. Hanno

forme irregolari fino ad arrivare a delle pseudo ife.

Sono molto presenti negli ambienti ipogei o esposti all’aperto perché sono tipici m.i. che si trovano nel

suolo. Sono di piccole dimensioni:

mediamente 2 μm. Le dimensioni

dei procarioti sono importanti

perché mano a mano che si riduce

il raggio in una sfera, il rapporto

superficie/volume aumenta;

quindi per i procarioti c’è più

superficie a disposizione rispetto a

gli eucarioti e la velocità di scambi è maggiore (Procarioti molto

più piccoli degli eucarioti. La velocità a cui i nutrienti e i prodotti di

scarto passano dentro e fuori la cellula inversamente proporzionale alle

dimensioni. Cellule più piccole hanno maggiore superficie di scambio).

Riproduzione

La modalità principale con cui i batteri si duplicano è la divisione, o scissione,

binaria: una singola cellula madre si divid