Microbiologia

Microbiologia per i beni culturali

Indice

• Relazioni filogenetiche tra cellule procariote (bacteria e archea) e cellule eucariotiche
• Biodeterioramento. Meccanismi: processi chimici, processi fisici e danni estetici
• Biorecettività
• Biodeteriogeni
  • Batteri (inclusi attinobatteri e cianobatteri)
  • Alghe eucariote
  • Funghi
  • Licheni
• Fattori limitanti - Influenza dei fattori ambientali sulla crescita microbica (nutrienti, pH, temperatura, ossigeno ecc.)
• Metabolismo - Esigenze nutrizionali dei microrganismi e tipi nutrizionali. Metabolismi energetici (Respirazione aerobica. Respirazione anaerobica)
• Ecologia microbica
  • Coltivazione
  • Osservazioni al microscopio - Introduzione alla microscopia. Campo chiaro, contrasto di fase, fluorescenza, tecniche di colorazione con fluorocromi (DAPI, FISH, immunofluorescenza) e saggi immunoenzimatici (ELISA). Citometria. Microscopia elettronica.
• Indagini molecolari
• Aerobiologia
• Biofilm
• Deterioramento microbiologico dei beni culturali costituiti da materiali organici (carta, papiro, tessuti, legno, film fotografici, ambra, polimeri sintetici).
• Deterioramento microbiologico dei beni culturali costituiti da materiali inorganici (piastrelle, vetro, metalli)
• Metodi indiretti di prevenzione. Temperatura, umidità relativa. Sostanze anti-biofilm
• Metodi diretti di controllo
  • Metodi chimici (biocida)
  • Metodi non chimici (rimozione meccanica, radiazioni, plasma)
  • Metodi biologici (proteine, enzimi)
• Biopulitura con microrganismi ed enzimi
• Biocalcificazione. Formazione di biopatine.

Relazioni filogenetiche

La cellula è l'unità base di tutti gli organismi viventi. Esistono due tipi di cellule:

• Cellula procariotica
• Cellula eucariotica

La cellula eucariotica è una decina di volte più grande della cellula procariotica. Nella cellula procariotica non ci sono né mitocondri né cloroplasti; nella cellula eucariotica ci sono i mitocondri mentre per i cloroplasti dipende dal tipo di organismo (chi fa fotosintesi sì, chi non la fa no). Nella cellula procariotica si trova la parete, nella cellula eucariotica dipende (cellula vegetale sì, cellula animale no). Nella cellula procariotica c’è un solo cromosoma (singola molecola di DNA circolare), in quella eucariotica ce ne sono molti. Il cromosoma è l'elemento genico che porta i geni essenziali per le funzioni cellulari.

Il singolo cromosoma dei procarioti si trova immerso nel citoplasma, l’area in cui si trova si chiama nucleoide (area non circondata dalla membrana nucleare); negli eucarioti si trova nel nucleo, il quale è delimitato dalla membrana nucleare (differenza più importante). Il genoma è l’insieme di tutti i geni di una cellula.

Struttura del DNA

DNA e RNA sono formati da subunità chiamate nucleotidi. I nucleotidi sono uno zucchero a 5C, più una base azotata, più un gruppo fosfato. La lunghezza del DNA è espressa in kilobasi (basi perché c’è la base azotata); una kilobase è un frammento di 1000 paia di basi in una molecola a doppio filamento.

Un organismo procariote usato come modello è l’escherichia coli, il quale ha 4600 kilobasi e misura circa 1 mm. Se totalmente disteso, il DNA è circa 1000 volte la lunghezza di una cellula, deve quindi essere strettamente attorcigliato in superavvolgimenti. Il superavvolgimento serve per impacchettare (10% dell’intero volume delle cellule) la forma circolare, rilassata, serve per la replicazione.

La replicazione si ha quando si ottengono più copie del DNA. Trascrizione da DNA a RNA: sintesi di RNA complementare ad un singolo filamento di DNA a doppio filamento. Traduzione da RNA a proteine: sintesi di una proteina con l’ausilio di un ribosoma che utilizza l’informazione trasmessa dall’mRNA.

La sintesi delle proteine avviene a livello dei ribosomi. I ribosomi sono fatti da RNA ribosomiale e da proteine. Formati da due subunità (sia per cellule eucariote che procariote). I ribosomi dei procarioti sono di tipo 70 unità svedberg (70s). Le unità svedberg sono unità di sedimentazione quando si centrifuga l’RNA. Ciascuna delle due subunità (50s e 30s) è fatta da proteine e RNA ribosomiale. Nella subunità più piccola si trova il 16s RNA, questo serve per la classificazione degli organismi viventi.

Filogenesi

La classificazione oggi non si occupa più dei regni, ma differenzia secondo 3 domini:

• Bacteria
• Archea
• Eukarya

La classificazione è cambiata perché all’inizio si faceva un riconoscimento morfologico, ora invece è basata su metodi molecolari (studiano il DNA). Con i nuovi metodi si è arrivati alla classificazione di tutti gli organismi viventi in uno di questi 3 domini. Il dominio bacteria e il dominio archea sono fatti da cellule procariote.

Un gene codifica per l’mRNA, che codifica per una proteina, ma ci sono geni che codificano anche per rRNA e tRNA. Un gene è un segmento di DNA che codifica per un prodotto funzionale, generalmente una proteina ma anche tRNA e rRNA.

L’analisi filogenetica si basa sullo studio dei geni che codificano per 16S rRNA, per i procarioti, e 18S rRNA, per gli eucarioti. Per classificare gli organismi viventi serve qualcosa che hanno in comune ed è sempre presente: i ribosomi, che hanno la caratteristica di essere presenti in tutte le cellule. L’RNA che questi conservano ha delle parti molto conservate e delle parti molto differenti in termini di nucleotidi. Gli organismi si differenziano in base alla sequenza di nucleotidi, che corrisponde al gene, che codifica per il 16s RNA nel caso per procarioti e per il 18s RNA nel caso degli eucarioti.

All’interno di ogni dominio ci sono organismi diversi e tanto più distanti sono tra loro, quanto più sono diversi tra di loro. Quelli a sinistra sono identificati per il gene che codifica per il 16s RNA, quelli a destra (viola) sono identificati tramite il gene che codifica per il 18s RNA.

Biodeterioramento

Biodeterioramento: qualsiasi modificazione indesiderata nell’aspetto e nelle proprietà di un materiale che costituisce il bene culturale dovuto all’attività di organismi viventi. Si tratta quindi di un concetto negativo, mentre la biodegradazione ha valenza positiva (es. batteri che mangiano il petrolio nei mari).

Come fanno gli organismi viventi a causare un danno ad un bene culturale?

1. Processi fisici: si sviluppano in superficie ed in profondità con effetti sulle caratteristiche meccaniche e strutturali del materiale. Es. muffa sul libro bagnato, che penetra all’interno. Alterazioni microstrutturali e macrostrutturali:
   • Fessurazioni
   • Decoesione
   • Fratturazioni
   • Disgregazione
   • Rigonfiamento
   • Caduta
2. Processi chimici: si sviluppano in superficie e nei primi strati del materiale con variazioni della composizione per azione diretta di prodotti metabolici intermedi e di scarto dei biodeteriogeni. Trasformazione di qualcosa: uso del substrato a fini nutrizionali ed emissione di metaboliti.
   • Processi di assimilazione → fonte di C ed energia
   • Processi di escrezione → materiale danneggiato per rilascio metaboliti

   Impoverimento del substrato:

   • Polverizzazione
   • Dissoluzione
   • Corrosione
3. Alterazione estetica: il microorganismo cambia il colore del substrato su cui cresce (es. macchie). I danni possono essere:
   • Diretti: degradazione del materiale
   • Indiretti: la presenza di organismi facilita l’attacco biologico da parte di altri organismi colonizzatori.

Processi chimici

Danni dovuti all’uso del materiale del bene culturale come nutriente, o dovuti ai prodotti di scarto dell’organismo.

Acidolisi

Gli organismi rilasciano acidi e basi (alcuni anche complessanti, es. ac. lattico) che possono reagire con le molecole del substrato: formazione sostanze solubili.

• Acidi organici: formico, acetico, butirrico, lattico;
• Acidi inorganici: carbonico, nitrico, solforico.

Alcalinolisi

• Composti basici: NH₄, NaCO₃

La loro azione indiretta è dovuta alla formazione di un ambiente acido/basico che permette lo sviluppo di organismi acidofili/basofili.

Complessolisi

Chelazione = fenomeno in cui un atomo metallico è condiviso da 2 atomi di una molecola organica per formare un composto stabile ad anello. Molti composti organici (in particolare acidi es. acido ossalico) possono agire da agenti complessanti del substrato.

Scambio di ioni

Si verifica quando gli organismi assorbono cationi metallici necessari alla loro nutrizione o per l’equilibrio osmotico cedendo contemporaneamente altri cationi = flusso bidirezionale di cariche.

Degradazione enzimatica

Gli enzimi sono proteine, alcuni di questi enzimi vengono rilasciati all’esterno della cellula. Tramite idrolasi questi tagliano una molecola complessa, dando luogo a molecole più semplici, quindi attaccando i costituenti del bene culturale. L’attività enzimatica è influenzata dalle condizioni chimico-fisiche (pH, T, UR). Enzimi con differenti attività:

• Scissione o idrolisi = idrolasi
• Formazione di legame accoppiata con rottura di un trifosfato = ligasi
• Eliminazione di gruppi (formazione di doppi legami) = liasi
• Trasferimento 1 gruppo = transferasi
• Reazioni redox = ossidoreduttasi
• Modificazione della struttura = somerasi

- ENDOENZIMI: attivi all’interno della cellula

- ESOENZIMI: escreti all’esterno, attivi nell’ambiente, più dannosi perché degradano i substrati per renderli assimilabili.

Es: complesso cellulasi → insieme di enzimi degradativi della cellulosa, es. fibre tessili vegetali. Solo pochi organismi possiedono tutta la serie completa, tanti sono privi del primo enzima → degradano cellulosa parzialmente attaccata da altri organismi.

Es: proteasi → degradazione di pergamene, pellami ecc.

Es: tannasi → degradazione dei tannini nella carta e legno prodotte soprattutto da muffe (Aspergillus niger, Penicillum glaucum).

Danni estetici

Alterazione della visione superficiale del manufatto e del modellato, si sviluppano solo in superficie.

• Patine
• Macchie
• Croste
• Velature

Colorazioni evidenti ad una semplice osservazione macroscopica, non è sempre separabile da altri tipi di danni.

Pigmenti

Composti organici contenenti un elevato numero di doppi legami che li rende capaci di assorbire le radiazioni luminose nello spettro del visibile e dell’infrarosso vicino → luce riflessa conferisce la colorazione corrispondente. La colorazione assunta varia in funzione della:

• Composizione chimica del substrato
• Presenza elementi metallici
• pH mezzo
• Presenza di altre specie

ENDOPIGMENTI: all’interno dell’organismo sono rilasciati solo per lisi cellulare es. fotosintesi (clorofille, carotenoidi, ficobiline).

ESOPIGMENTI: escreti all’esterno diffusi nell’ambiente circostante, azione inibitoria o di antibiotico prodotti soprattutto dai funghi.

Fenomenologia delle alterazioni

Aspetto o apparenza con cui si presenta l’alterazione, molto importante per riconoscere il tipo di attacco, per risalire alle cause e distinguerlo da altri non biologici. Possono sussistere dei dubbi sulla natura biologica del degrado quando non c’è presenza significativa di agenti biologici. Questi infatti possono essere scomparsi da tempo, ma i prodotti della loro attività metabolica sono rimasti.

• Macchie = natura chimica o natura biologica Es. foxing della carta
• Esfoliazione = per azione dei solfoossidanti o nitrificanti e riconducibili all’azione di SO₂, NO_x
• Efflorescenze = tipiche attinobatteri o aggregati di sali minerali
• Patine nere = dovute ai cianobatteri o a depositi di inquinanti atmosferici
• Corrosione dei metalli = difficile distinguere quella di origine chimica da quella biologica.

Gli ambienti in cui si possono trovare possono essere suddivisi in CONFINATI (musei, gallerie, archivi, biblioteche, chiese ecc.) ed ESTERNI.

Articoli da leggere

• Miller, A.Z., Sanmartín, P., Pereira-Pardo, L., (...), Macedo, M.F., Prieto, B. Bioreceptivity of building stones: A review. 2012. Science of the Total Environment 426, pp. 1-12.
• Guillitte, O. Bioreceptivity: a new concept for building ecology studies. 1995. Science of the Total Environment 167 (1-3), pp. 215-220.

Biorecettività

La biorecettività è l’attitudine di un materiale ad essere colonizzato da organismi viventi senza necessariamente subire alcun biodeterioramento (Guillitte, 1995). Si esclude in questo modo il passaggio transitorio e fortuito degli organismi (es. spore che si depositano senza germinare). Tutti i materiali possono essere colonizzati e perciò sono tutti biorecettivi.

La colonizzazione dipende da:

• Caratteristiche intrinseche del materiale
• Ambiente in cui è esposto.

Grado di biorecettività è funzione:

• Natura chimica e fisica
• Due materiali ≠ possono avere biorecettività ≠ anche nelle stesse condizioni ambientali
• Presenza di sostanza organica (inquinanti organici, trattamenti conservativi precedenti)
• Stato di degrado
• Stadio di colonizzazione già in atto (colonizzatori primari)

Biorecettività del materiale lapideo

Tutte le proprietà del materiale che contribuiscono allo stanziarsi e svilupparsi di organismi.

• Primaria: per tutto il tempo che il materiale rimane in condizioni simili o identiche allo stato iniziale.
• Secondaria: dovuta al fatto che le caratteristiche del materiale cambiano con il tempo.
• Terziaria: tutte le attività umane che causano cambiamenti nella proprietà del materiale. Es. consolidamento.
• Estrinseca: particelle o sostanze che si depositano sul materiale e ne modificano la biorecettività. Es. sporco.

La biorecettività aiuta a capire il biodeterioramento e fornisce informazioni per come selezionare i materiali per la conservazione degli edifici (durabilità).

Test di biorecettività:

• La maggior parte degli studi condotti in condizioni di laboratorio con inoculi artificiali
• Litotipi italiani marmo di Carrara e Pietra di Lecce i più studiati
• Test generalmente con 1 specie. Nella realtà atipico (interazione tra m.i. diversi determinante).

Pietre studiate:

• Calcário ançã (CA), pietra calcarea
• Calcário lioz (CL), pietra calcarea
• Piedra San Cristobal (SC), calcarenite
• Piedra Escúzar (PF), biocalcarenite
• Pietra di Lecce (PL), pietra calcarea

Es. biofilm verde da calcário ançã del monastero Santa Clara-a-Velha in Coimbra (Portogallo). Identificazione tramite tecniche molecolari (alghe verdi: Chlorella, Stichococcus, Trebouxia e Myrmecia; cianobatteri: Leptolyngbya e Pleurocapsa), coltivazione in terreno BG11 per 3 mesi.

Come si comportano: Inoculo: CL assorbimento quasi inesistente; rapido assorbimento CA e PL, per elevata porosità; rapidissimo per SC e PF per pori larghi.

• 1 mese: colorazione verde per tutti tranne CL
• Mesi successivi: colorazione tende al marrone con l’eccezione in senso verticale di SC e PF

Un metodo per stimare la quantità di m.i. presenti sulla superficie, se questi fanno fotosintesi, è quello di studiare la quantità di clorofilla a prodotta. Si può fare in due modi:

• Tramite spettrofluorimetro;
• Tramite estrazione con solvente (DMSO).

Questi due metodi servono per vedere quanta biomassa c’è in superficie rispetto a quanta biomassa in totale.

Agenti biologici

Molti organismi possono avere un ruolo nei confronti di un materiale che costituisce un bene culturale:

• Batteri (inclusi attinobatteri e cianobatteri)
• Alghe
• Funghi
• Licheni
• Muschi e piante
• Animali (uccelli, uomo, insetti)

Batteri

Quando si parla di batteri si parla di cellule procariote unicellulari. Alcune specie sono in grado di formare endospore. Si riproducono per divisione binaria molto rapida. Hanno varie forme:

• Cocchi → forma sferica, formano catenelle
• Bastoncini → forma bastoncellare
• Vibrioni → ricurvi (a boomerang)

I batteri miceliali sono batteri che per forma assomigliano ai funghi, ma in realtà non lo sono perché i batteri sono procarioti mentre i funghi sono eucarioti. Hanno forme irregolari fino ad arrivare a delle pseudo ife. Sono molto presenti negli ambienti ipogei o esposti all’aperto perché sono tipici m.i. che si trovano nel suolo. Sono di piccole dimensioni: mediamente 2 μm. Le dimensioni dei procarioti sono importanti perché mano a mano che si riduce il raggio in una sfera, il rapporto superficie/volume aumenta; quindi per i procarioti c’è più superficie a disposizione rispetto agli eucarioti e la velocità di scambi è maggiore (Procarioti molto più piccoli degli eucarioti. La velocità a cui i nutrienti e i prodotti di scarto passano dentro e fuori la cellula è inversamente proporzionale alle dimensioni. Cellule più piccole hanno maggiore superficie di scambio).

Riproduzione

La modalità principale con cui i batteri si duplicano è la divisione, o scissione, binaria: una singola cellula madre si divide...