Microbiologia

Microbiologia

Modulo 11: Microbiologia - origini ed evoluzione

I microrganismi costituiscono l'oggetto di studio della microbiologia, ovvero tutti gli organismi di norma unicellulari che hanno dimensioni troppo piccole per essere visibili a occhio nudo e che risultano invece visibili con il microscopio. Per microrganismi si intendono in senso stretto i batteri, i protozoi, molte alghe e i funghi microscopici (o miceti); nell'uso più estensivo del termine (come si fa in ambito medico) vengono compresi anche gli agenti subcellulari (virus e prioni).

L'avvento del microscopio nel XVII secolo fu una tappa fondamentale nella scoperta del mondo microbico. In realtà già intorno alla metà del XVI secolo microscopi rudimentali erano stati realizzati dall’occhialaio olandese Hans Janssen e probabilmente anche da Galileo Galilei. A metà del XVII secolo ebbe inizio lo sviluppo vero e proprio della microscopia con l'invenzione di microscopi semplici da parte di Hook e Leeuwenhoek. Robert Hooke, filosofo sperimentale inglese, nel 1665 pubblicò un trattato contenente l'esatta descrizione di un microscopio con una sola lente e disegni di corpi fruttiferi di funghi. Anthonj Van Leeuwenhoek fu il primo a descrivere batteri, lieviti e protozoi. La sua fama è dovuta principalmente alla scoperta del mondo microbico, cioè il mondo degli animalcules, o piccoli animali come venivano allora chiamati, scoperta avvenuta nel 1676 mentre studiava al microscopio alcuni infusi.

L'esplorazione del mondo microbico, iniziata così brillantemente da Leeuwenhoek, resta tuttavia ferma per più di 100 anni dopo la sua morte, fino a quando con la disponibilità di microscopi composti si diede inizio a una nuova fase di osservazione del mondo microbico, che si avvalse anche dello sviluppo di nuove tecniche per lo studio dei microrganismi in laboratorio. I più importanti progressi nella costruzione di microscopi avvennero verso la fine del XIX secolo e coincisero col periodo di maggiore sviluppo della microbiologia come scienza. La visualizzazione al microscopio dei microrganismi fu notevolmente migliorata con l'introduzione da parte di Paul Ehrlich nel 1881 della colorazione vitale dei batteri con blu di metilene.

Nel 1884 Hans Christian Gram, medico e farmacologo danese, sviluppò un metodo di colorazione differenziale che da lui prese il nome di colorazione di Gram, colorazione tutt'ora usata come tecnica di base per una caratterizzazione morfologica tassonomica dei batteri.

La confutazione della teoria della generazione spontanea

La nascita e lo sviluppo della microbiologia hanno richiesto lo sviluppo di strumenti concettuali importanti: la teoria cellulare e la teoria della biogenesi. L'idea della generazione spontanea di organismi viventi è antica, semplice, quasi intuitiva ed è legata alla percezione immediata della realtà. Fino alla metà del XVIII secolo, la generazione spontanea non era solo una credenza popolare, ma era presente anche nel dibattito filosofico e scientifico, arrivando a postulare una Vis vitalis (forza vitale) responsabile anche di questi fenomeni. Incredibilmente, la teoria della generazione spontanea non sembrava affatto inconciliabile con le teorie creazioniste dominanti ed era suffragata da esperimenti alquanto discutibili. Uno di questi si basava sulla generazione di larve da carne lasciata all'aria senza alcuna protezione.

Il medico Francesco Redi dimostrò, nel 1668, la falsità di questa prova. Egli prese tre pezzi di carne:

• Uno fu lasciato all'aria senza protezione di carta: in questo caso le mosche avevano libero accesso alla carne su cui deporre le uova. Dopo alcuni giorni, si svilupparono larve di mosca.
• Un secondo recipiente contenente la carne fu sigillato con un foglio di carta che impediva l'ingresso alle mosche ma anche dell’aria: le larve di mosca non si svilupparono.
• Un terzo recipiente contenente carne viene ricoperto con una fitta garza: anche in questo caso non si svilupparono larve. Se però la garza veniva deposta su un pezzo di carne fresca e il recipiente sigillato con un foglio di carta si constatava dopo alcuni giorni lo sviluppo delle larve, evidentemente sviluppatesi da uova depositate sulla garza delle mosche.

Con questo esperimento Redi distrusse la credenza dello sviluppo spontaneo dei vermi dalla carne e mise fine al dibattito sulla generazione spontanea. Nello stesso periodo l'invenzione del microscopio poneva le basi per due rivoluzioni nello studio degli organismi viventi. La prima è la teoria cellulare, secondo la quale tutti gli organismi viventi sono costituiti da unità fondamentali delle cellule; la seconda è la scoperta di un mondo prima invisibile, costituito da microrganismi anche unicellulari. Questa seconda scoperta rimise in gioco la teoria della generazione spontanea. Il dibattito fu ripreso a metà del Settecento dal naturalista italiano Lazzaro Spallanzani e dall’ecclesiastico inglese John Needham, forte sostenitore, quest'ultimo, della generazione spontanea. Spallanzani osservò che un brodo di carne sottoposto a bollitura prolungata, se lasciato esposto all'aria, dopo pochi giorni diventava torbido per la presenza di microrganismi; ciò non avveniva se si impediva l'ingresso di aria sigillando ermeticamente la fiasca in cui era stato bollito. Spallanzani giunse pertanto alla conclusione che la bollitura uccideva germi vitali presenti nel brodo e che la sigillatura impediva l'ingresso di nuovi germi presenti nell'aria che avrebbero potuto moltiplicarsi nel brodo. Needham, al contrario, teorizzò che l’intorbidimento della soluzione fosse causato dalla generazione spontanea di microrganismi prodotta da una forza vitale presente nell'aria e che questa veniva distrutta con il calore.

Il dibattito sulla generazione spontanea venne chiuso definitivamente con gli esperimenti di Louis Pasteur che per primo dimostrò, facendo passare dell'aria attraverso filtri di fulmicotone, che questa è ricca di microrganismi che però venivano trattenuti dal filtro. Sciogliendo il filtro con una miscela di etere e alcol, le particelle venivano rilasciate e si depositavano sul fondo del liquido filtrato. Pasteur comprese che questi microrganismi presenti nell'aria potevano depositarsi su materiali esposti e contaminarli. In seguito, sviluppò altri esperimenti per demolire definitivamente la teoria della generazione spontanea fra i quali il più famoso è quello del pallone a collo di cigno: un brodo di coltura è posto in un matraccio la cui imboccatura viene modellata a collo di cigno per permettere il passaggio dell'aria ma non quello delle particelle microscopiche presenti nell'aria stessa. Il brodo viene quindi portato a ebollizione in modo da uccidere tutte le forme viventi ivi presenti. Anche dopo un lungo periodo, il brodo non diventa torbido per la presenza dei batteri. Solo se il collo del pallone viene rotto permettendo alle particelle sospese nell'aria di penetrare nel pallone, si osserva intorbidimento del brodo dovuto alla crescita dei microrganismi presenti nell'aria.

Ripensando all’esperimento di Needham con il brodo di pollo, si trova una spiegazione all'esito di quell'esperimento quando Tyndall dimostrò l'esistenza in molti materiali di spore resistenti al calore. La semplice ebollizione non uccide le spore, che possono successivamente germinare dando origine a cellule batteriche causando intorbidimento del brodo proprio come era successo a Needham. Al paradigma della teoria cellulare si poteva così aggiungere quello della biogenesi che si può riassumere nell’aforisma Omnis cellula e cellula, Omne vivum e vivo. Ma la tesi Omne vivum e vivo già conteneva in sé la contraddizione riguardo l'origine della vita. Contemporaneamente infatti una rivoluzione del pensiero biologico stava per esplodere con la pubblicazione del celebre libro Sull'origine della specie di Charles Robert Darwin che dava fondamento alle teorie evoluzioniste già anticipate da Jean-Baptiste de Lamarck.

Lo sviluppo delle tecniche di base per lo studio di microrganismi

Robert Koch, medico e microbiologo tedesco, si dedicò allo studio delle cause di molte malattie e diede origine alla microbiologia medica isolando per primo un microrganismo causa di malattia. Nel 1876 fornì la dimostrazione conclusiva che il batterio Bacillus anthracis era l'agente eziologico del carbonchio (detto anche antrace), una malattia dei bovini. Il primo contributo importante allo sviluppo delle tecniche batteriologiche fu il metodo per coltivare microrganismi su terreno solido per farli crescere separatamente l'uno dall'altro; questo al fine di isolare e caratterizzare batteri prelevati da animali malati e stabilire se la malattia era causata da un microrganismo. Allora la tecnica disponibile era quella di diluire progressivamente il campione in un brodo fino a ottenere una coltura originata da un solo tipo di batterio. Con questa tecnica, tuttavia, si arrivava all'isolamento della specie più numerosa, ma non necessariamente del microrganismo causa della malattia. Il primo tentativo per solidificare terreni liquidi fu quello di usare la gelatina, ma i risultati non furono soddisfacenti per la natura stessa dell’agente solidificante usato; la gelatina infatti può essere degradata da microrganismi proteolitici.

Si passò quindi ad usare fette di patata sulla cui superficie potevano crescere i microrganismi formando delle specie di colonie. Con questa tecnica Koch riuscì a isolare Bacillus anthracis. Purtroppo, la patata che non consentiva la crescita di qualsiasi tipo di microrganismo. Walter Hesse, un allievo di Koch, prese ispirazione dalla moglie la quale usava l’agar come agente solidificante per preparare le gelatine di frutta. L'uso dell’agar presenta un duplice vantaggio rispetto alla gelatina: liquefa alla temperatura di 100° C ma rimane allo stato liquido fino a 45° C; inoltre non viene degradato da microrganismi salvo poche eccezioni. L'uso dell'agar rappresentò una tappa fondamentale nella storia della microbiologia. Nello stesso laboratorio lavoravano un altro allievo di Koch, Julius Petri, che introdusse l'uso di scatole di vetro dette piastre di Petri, nelle quali preparare terreni solidi. Su questi venivano poi seminati i campioni da cui isolare microrganismi, che crescevano formando colonie sulla superficie del terreno solido.

Distribuzione dei microrganismi nell'ambiente

Beijerinck e Vinogradskij furono tra i primi microbiologi a studiare i microrganismi dell'ambiente. Il primo iniziò la sua attività di ricerca interessandosi anche dei microrganismi che vivono nella rizosfera. Ben presto cominciò a studiare microrganismi del suolo e sviluppò la tecnica delle colture di arricchimento basata sull'impiego di terreni colturali di tipo selettivo. Scoprì che aggiungendo o togliendo certi componenti da un terreno di coltura tradizionale o incubando la coltura in diverse condizioni ambientali era possibile favorire la crescita di determinati microrganismi escludendo quella di altri. Vinogradskij era interessato ai microrganismi del suolo; studiò il consumo di idrogeno solforato da parte dei batteri zolfo ossidanti direttamente nel loro habitat naturale. Lavorando con uno di questi batteri scoprì che questi batteri ricavavano il carbonio cellulare dall’anidride carbonica. Coniò il termine autotrofia per descrivere questa proprietà e successivamente il concetto di chemiolitotrofia per descrivere batteri capaci di crescere usando esclusivamente composti inorganici come fonte di carbonio e di energia. Un ruolo fondamentale è stato svolto dal microbiologo americano Carl Woese, il quale applicò il concetto di filogenesi molecolare all'analisi molecolare dell’rRNA 16s (“orologio molecolare”) e mise le basi per la moderna filogenesi e tassonomia microbica. Woese, attraverso l'analisi del RNA ribosomiale identificò il phylum degli Archaea, un phylum diverso ma correlato filogeneticamente sia ai batteri che agli eucarioti.

Microrganismi come agenti di malattie

La prima dimostrazione diretta del ruolo dei microrganismi come agenti di malattia deriva dagli studi condotti sul carbonchio dal medico tedesco Robert Koch il quale condusse esperimenti per dimostrare che le spore di Bacillus anthracis isolate da colture pure potevano infettare gli animali. Isolò quindi l'agente responsabile della tubercolosi detto anche bacillo di Koch e il vibrione del colera identificando nell'acqua contaminata il principale mezzo di infezione. Sulla base dei suoi esperimenti formulò dei criteri generali, comunemente noti come postulati di Koch, per provare che un determinato microrganismo è responsabile di una specifica malattia.

• Il microrganismo deve essere presente in tutti gli individui affetti dalla malattia e assente negli individui sani.
• Il microrganismo deve essere isolato dall'individuo affetto e, posto in coltura, deve dare origine a una popolazione cellulare omogenea.
• L'inoculo di una coltura pura del microrganismo in individui sani può causare la comparsa della malattia di cui è ritenuto responsabile.
• Il microrganismo deve essere reisolato dall'organismo infettato sperimentalmente in cui la malattia sia insorta.

Koch stesso realizzò che non erano universalmente applicabili tali postulati. Perseguirli in modo dogmatico, anzi, può impedire la corretta identificazione dell'agente patogeno. Oggi si cerca di identificare quali siano in un microrganismo patogeno gli specifici determinanti di virulenza e patogenicità. Sostituendo “gene” a “microrganismo” si possono così formulare i postulati di Koch molecolari:

• Il gene implicato nella patogenicità e virulenza deve trovarsi in tutti i ceppi patogeni di una data specie ed essere assente nelle specie non patogene.
• L'inattivazione selettiva del gene deve portare una diminuzione misurabile della patogenicità e virulenza.
• La complementazione o reversione della mutazione deve ripristinare il livello originario di patogenicità e virulenza. Parimenti l'introduzione del gene in un ceppo non patogeno lo trasforma in patogeno.

Sviluppo della microbiologia come scienza di base e applicata

Con la scomparsa di Pasteur, Koch, Beijerinck e Vinogradskij, finiva quella che viene considerata “l'età d'oro della microbiologia”, durante la quale la microbiologia si era saldamente affermata come scienza ed erano state messe le basi per il suo sviluppo in due direzioni: come scienza di base e come scienza applicata. I microrganismi sono stati e sono ancora il principale modello di studio per la comprensione a livello molecolare dei processi biologici. Con l'avvento delle tecnologie del DNA ricombinante e dell'ingegneria genetica, a partire dagli anni '70 si sono sviluppate le moderne applicazioni biotecnologiche dei microrganismi, che si riferiscono a tutti i processi di trasformazione della materia, che trovano il loro fondamento nelle fermentazioni industriali. Oggi le biotecnologie microbiche possono essere definite come processi che impiegano microrganismi o parti di essi per ottenere prodotti utili o per sviluppare processi di interesse ambientale.

Il metodo scientifico

Galileo Galilei ed il Metodo induttivo-deduttivo: Il contributo fondamentale di Galileo è stato quello di avere intuito per primo che la scienza si deve basare sulla costruzione di un metodo scientifico con il quale arrivare a conclusioni inconfutabili attraverso le osservazioni sperimentali. Le esperienze, come per Bacone, stanno alla base del metodo scientifico, ma occorre cercare le connessioni quantitative (le leggi), facendo uso della matematica. Il metodo scientifico secondo Galilei si basa sull'osservazione sperimentale e su due processi mentali fondamentali: l'induzione e la deduzione.

Le 4 fasi del sapere

• Osservazioni sotto forma di esperimenti: applicazioni concrete.
• Catalogazione, misurazione e selezione dei dati sperimentali accumulati: ricerca di uno schema di inquadramento (importanza della matematica).
• Proposta: costruzione di una ipotesi fase induttiva. Dal particolare al generale, dare forma e consistenza ai dati sperimentali raccolti, inquadrandoli in una visione generale.
• Verifica della legge: da ipotesi a teoria fase deduttiva. Costruzione di un modello, di una teoria di validità generale. Deduzione logico-matematica: dalla generalizzazione dei dati empirici si costruisce un modello generale. Verifica sperimentale. Ripetizione dell'esperimento.

Karl Popper: il metodo Ipotetico-deduttivo

Popper afferma che il metodo scientifico non può essere induttivo. Non basta osservare: bisogna sapere cosa osservare! Per dimostrarlo cita Kant e la “Critica della Ragion Pura”. In altre parole, già Kant vide con estrema chiarezza che la storia della scienza ha confutato quell’idea del metodo – che è un dogma infondato – stando alla quale noi dovremmo partire dalle osservazioni e derivare poi da esse le nostre teorie (se osservo un fenomeno, è già insita in me una risposta!). In realtà, facciamo qualcos’altro: partiamo da un problema, con l’aiuto di un’ipotesi. Questo è il metodo della ricerca scientifica, adottato anche per l’apprendimento. Popper afferma quindi che il metodo per tentativi ed errori, il metodo ipotetico-deduttivo, sia un metodo universale. Dobbiamo costringere la natura a rispondere alle nostre domande, liberamente scelte da noi, piuttosto che aggrapparci alle gonne di madre natura e aspettare che sia lei a guidarci. Osservazioni fatte a caso, senza un piano elaborato in anticipo, non possono essere connesse da leggi, mentre sono proprio le leggi ciò di cui la ragione va alla ricerca.