Microbiologia

Microbiologia

La microbiologia è lo studio degli organismi non visibili ad occhio nudo. Gli esseri viventi possono essere classificati in due diversi regni:

• Eucarioti: Animali, piante, funghi, cromisti e protozoi.
• Procarioti: Batteri.

Cronistoria della microbiologia

Anthony van Leeuwenhoek nel 1687 scoprì l’esistenza dei microrganismi grazie a un microscopio chiamato protomicroscopio. Louise Pasteur nel 1864 smentisce la teoria della generazione spontanea (la vita si generava dalla materia inanimata) con la teoria della biogenesi, per cui la vita si può generare solo dalla vita. Si ricorda l’esperimento eseguito lasciando all’aria aperta un pezzo di carne, che in poco tempo si riempì di larve, e un pezzo di carne chiuso in un barattolo che anche dopo un lungo periodo rimase inerte dalla contaminazione delle larve. Questo fu la prima vera smentita alla teoria della generazione spontanea.

Un altro esperimento molto importante fu quello di inserire un terreno di coltura in una beuta con collo curvo. Il collo e il terreno vengono così sterilizzati con calore, e anche dopo un lungo periodo il terreno rimane limpido, segno di incontaminazione, dato che i batteri non riuscirono a passare nel collo curvo fermandosi alla prima curva. A questo punto, rovesciando la beuta, il terreno andò in contatto con i batteri sul collo e in poco tempo il terreno si intorbidì. Questo risultato smentì che la sora aria era capace di generare vita.

Altre scoperte importanti

• Fermentazione (1857).
• Pastorizzazione: Riscaldamento dei liquidi alla temperatura in grado di distruggere la maggior parte delle forme batteriche vitali (1864).
• Sviluppo dei terreni di coltura e dei supporti di crescita.
• Sviluppo dei vaccini: la rabbia.
• Propose la patogenicità dei microrganismi.
• Propose l’introduzione di procedure in asepsi per prevenire la contaminazione da parte di k.o. indesiderati.

Uno studente ungherese di medicina di nome Fulop si trasferì a Vienna, ma non gli consentirono di fare anatomia patologica, quindi dovette fare il ginecologo; si accorse che c'erano un numero elevato di morti per febbre, un'asepsi dopo il parto. Questa morte si verificava solo nei luoghi dove gli studenti facevano le autopsie dei cadaveri; nel reparto dove ciò non avveniva le morti erano meno frequenti; quindi si ipotizzò la presenza di microrganismi che danno delle asepsi se il medico non si lavava le mani prima di un intervento chirurgico; seguendo questo procedimento le morti diminuirono, ma ci volle ancora molto tempo, fino alla fine dell'Ottocento, per seguire questo procedimento in modo definitivo.

Postulati di Koch

Robert Koch con i suoi postulati affermò che il microrganismo genera la malattia:

• Il microrganismo deve essere presente in tutti i casi di malattia e sempre assente dagli individui sani;
• Il microrganismo sospetto deve essere isolato e fatto crescere in coltura pura;
• L’inoculazione della coltura pura deve creare la malattia;
• Lo stesso microrganismo deve essere nuovamente isolato.

Tuttora meno dell’1% dei batteri presenti sulla terra è ancora stato isolato e dato lui un nome, causa anche della frequente mutabilità dei batteri.

Osservazione microscopica

Fissazione

• Processo attraverso il quale le strutture del preparato sono fissate in posizione e preservate.
• I microrganismi sono uccisi e adesi saldamente al vetrino.
• Fissaggio termico: facile da eseguire, preserva poco la struttura interna.
• Fissaggio chimico: più complicato, ma preserva meglio la struttura di alcuni microrganismi delicati.

Colorazione

Le principali colorazioni sono:

• Colorazione semplice: Il colorante si lega a tutte le strutture aumentandone il contrasto con lo sfondo. Tutti i coloranti hanno due caratteristiche: il gruppo cromoforo, che ha una particolare struttura chimica che dà il colore, e la capacità di legarsi.
• Colorazione di Gram: È una colorazione differenziale che si basa sulla differenziazione di due o più strutture attraverso il colore. È di gran lunga la metodica più utilizzata e divide i batteri in due principali gruppi: i Gram positivi e i Gram negativi sulla base delle caratteristiche della loro parete cellulare.

I passaggi da effettuare sono:

1. Fissazione;
2. Colorazione con cristal violetto; (tutte le cellule viola)
3. Lavaggio con acqua e aggiunta di mordenzate (Lugol) per fissare il colorante, e un altro lavaggio;
4. Aggiunta di alcool per decolorare i Gram-, seguito da un lavaggio; (i Gram+ rimangono viola)
5. Aggiunta di Fuxina o Safranina (coloranti di contrasto) che colorano i Gram-, un ulteriore lavaggio.

• Colorazione negativa: per capsule
• Colorazione con mordenzante: per flagelli
• Colorazioni doppie: per spore

Colorazione di Gram

Viene utilizzato un vetrino che consente di distinguere i Gram positivi dai Gram negativi; la loro differenza sta nella differente parete che li caratterizza, quindi i gram positivi si colorano diversamente dai gram negativi. Tratto con un primo colorante: il cristal violetto, di colore violetto scuro quasi blu; dopodiché lo lavo con l'acqua e poi aggiungo un mordenzante, una soluzione iodata, chiamato anche liquido di Lugol, che va a combinarsi con il cristal violetto; questa combinazione rende il composto il cristal violetto iodo meno diffusibile, il colorante si fissa all'interno dei batteri e non riesce più ad uscire dal batterio; quindi utilizzo l'alcool che decolora alcuni dei batteri ma non tutti, quindi alcuni batteri sono rimasti blu e alcuni sono tornati trasparenti, quindi aggiungo un nuovo colorante, la safranina o la fucsina che danno una colorazione rosa o rossa e quelli che in precedenza si erano decolorati si ricolorano di rosso o rosa, questi saranno i batteri negativi, mentre quelli che rimangono colorati di blu sono i gram positivi.

Gram + e Gram -

Si definiscono Gram-positivi quei batteri che rimangono colorati di blu o viola dopo aver subito la colorazione di Gram. Si contrappongono ai batteri Gram-negativi, che invece subiscono la decolorazione. I batteri Gram-positivi sono in grado di trattenere la colorazione del cristalvioletto a causa dello strato di peptidoglicano presente nella loro parete cellulare. Queste caratteristiche strutturali distinguono i batteri Gram-positivi dall'altro grande gruppo di batteri, i batteri Gram-negativi, così chiamati per l'incapacità di trattenere la colorazione di cristalvioletto. Questi ultimi microrganismi, al contrario, trattengono altre colorazioni di contrasto (safranina o fucsina) e appaiono di colore rosso o rosa. Il diverso comportamento rispetto alla colorazione di Gram è dovuto al fatto che i batteri Gram-negativi presentano uno strato di peptidoglicano decisamente più sottile. Inoltre, il peptidoglicano si trova localizzato tra due membrane cellulari: una membrana cellulare interna e una membrana esterna batterica.

Principali tipi di batteri

• Diplococchi: Coppie di batteri a forma sferica;
• Streptococchi: Catene di cocchi;
• Stafilococchi: Cocchi raggruppati a grappolo;
• Tetradi: Gruppi di quattro cocchi;
• Sarcine: Otto cocchi disposti a formare un cubo.
• Bacilli: Bastoncelli, coccobacilli (simili ai cocchi), vibroni (bastoncelli ricurvi).
• Spirilli: Hanno una forma a elica rigida.
• Spirochete: Forma a elica flessibile.

Procarioti

I procarioti sono tutti quei microrganismi avente parete e membrana cellulare che racchiudono il contenuto di citosol e il nucleo sparso in esso. Presentano pochi organelli come ribosomi. Possono essere presenti dei filamenti di DNA extrachromosomico chiamati plasmidi, che danno delle peculiarità in più al batterio.

La membrana plasmatica, costituita da fosfolipidi, ha la funzione di regolare il contenuto della cellula e l’ingresso di molecole dall’esterno. La parete è rigida e serve a mantenere la forma del batterio e a evitarne l’esplosione in zone ipotoniche. Può contribuire anche alla patogenicità della cellula.

Il peptidoglicano è formato da N-acetilglucosamina e Acido Murammico legati trasversalmente da aminoacidi. Nei Gram + ci sono più strati appoggiati alla membrana plasmatica e presentano tra gli strati degli acidi lipoproteici che compattano gli strati e danno una struttura rigida. Nei Gram – sopra la membrana cellulare è presente uno o due strati di proteoglicani e sopra di questi è presente una membrana esterna, in cui sono presenti i lipopolisaccaridi. I LPS sono delle molecole presenti solo nei Gram – ed è fattore di patogenicità visto che hanno la funzione di riconoscimento, e la parte principale è il lipide A che ha effetti di endotossina, producendo shock e febbre seguiti da una forte risposta immunitaria. Il LPS è molto pericoloso soprattutto nei farmaci a base di estratto batterico, che possono causare una risposta immunitaria quando somministrati.

Strutture e funzioni dei batteri

I batteri all’esterno della capsula presentano anche i glicocalici che sono dei polimeri che servono per il riconoscimento dei batteri e possono anche accogliere altri batteri grazie ai loro poteri adesivi.

Sono presenti anche dei pili sessuali che servono per la coniugazione cellulare per lo scambio genetico, ma sono anche recettori per virus batterici. Le fimbrie sono appendici sottili che servono per l’adesione alle superfici. I flagelli sono delle strutture a elica che servono per il movimento della cellula. Una cellula può presentare uno o più flagelli. Quando il flagello ruota in senso antiorario il movimento ha la funzione di elica e spinge il batterio in avanti. Quando gira in senso orario fa fare una capriola al batterio. Questo serve per la chemiotassi che è il movimento verso, o via da una sostanza.

Fattori di patogenicità e virulenza

Patogenicità: È la capacità di dare la malattia.

Virulenza: È la capacità di un agente patogeno di attraversare i sistemi di difesa di un organismo per poi moltiplicarsi esponenzialmente. La virulenza è misurata in termini di numero di microrganismi o microgrammi di una determinata sostanza che uccide l’ospite. In genere si esprime come LD-50 cioè la dose letale che uccide il 50% delle cavie. Dose infettante: Numero di microrganismi necessario a causare un’infezione.

Adesività: È la capacità del batterio di attaccarsi all’organismo da infettare. Il legame può essere effettuato da fibre, flagelli, capsule o sime di adesione, sistemi a ventosa, uncini, spikes.

Formazione di biofilm: Il biofilm è un insieme di patogeni adesi e cooperanti. Gli organismi che si attaccano per primi producono materiali che aiutano altri ad aderire e a colonizzare.

Invasività: I microrganismi invasivi hanno la capacità di invadere tutto l’organismo e produrre esoenzimi capaci di distruggere i tessuti e permettere l’ingresso di altri patogeni. Quelli non invasivi creano un’infezione localizzata e possono produrre tossine che creano danni generali. Altri batteri come gli stafiloccocchi creano dei coaguli nell’ospite per proteggere le colonie, e man mano producono streptochinasi che sciolgono il coagulo per permettere la diffusione del microrganismo.

Fattori antifagocitari: Alcuni batteri producono degli enzimi (come le leukocidine prodotte da streptococchi e stafilococchi) che sono tossiche per le cellule del sistema immunitario. Altra caratteristica di certi batteri è l’alta resistenza della capsula che permette la vita anche quando un batterio è fagocitato.

Tossigenicità: Sia patogeni invasivi che non invasivi possono produrre o liberare in seguito al loro disfacimento metaboliti tossici, esoenzimi, endotossine che sono responsabili delle lesioni locali e della sintomatologia sistemica. Endotossine sono prodotte dai Gram -, e ha...