Microbiologia

Microbiologia

Introduzione ai batteri

I batteri appartengono alla categoria di cellule procariote, sono strutture estremamente piccole poiché non hanno gli organelli e i mitocondri che invece sono presenti nella cellula eucariote. Ed è per questo che al microscopio ottico per poter vedere un batterio uso un ingrandimento di 100X, mentre invece per i lieviti che sono strutture decisamente più grandi mi basta un 50X.

I virus invece sono ancora più piccoli e li osservo solo con microscopio elettronico o attraverso le placche di lisi, il virus può essere così piccolo perché è un patogeno all’interno di un fago (intracellulare obbligato, per riprodursi ha bisogno di una cellula ospite); poiché il virus porta con sé solo il genoma, e cioè il gene per duplicare se stesso e i precursori per riformare le proteine di rivestimento della testa e della coda, sfrutta tutto il resto dalla cellula ospite.

Dimensioni e habitat dei batteri

Le dimensioni di un batteri sono variabili, più o meno intorno ai: 0,5-1 x 0,5-14 µm, ma li troviamo anche di dimensioni maggiori a seconda del loro habitat e della funzione che devono svolgere. Es. Il Thiomargarita namibiensis, è un batterio sferico che vive nelle profondità oceaniche, possiede un grande vacuolo e si organizza in “colonie” a formare delle collane, si nutre di acido solfidrico di cui è ricco il fondale, ma lo utilizza ossidandolo tramite il nitrato che trova in superficie. Ecco che questo microrganismo passa dallo stato superficiale a quello profondo e fa scorta di quello che gli serve, questo è grosso proprio perché deve fare scorta, ha un’autonomia di 3 mesi prima che le correnti lo riportino a prendere il costituente.

Morfologia batterica

Li troviamo nella forma dei cocchi o di bastoncini. La struttura dei cocchi è garante di una forma sferica ma in realtà non lo è però si assume come conformazione standard. A seconda che queste sfere si dispongano a catenelle parliamo di streptococchi, a due a due sono i diplococchi, le tetradi a 4, le sarcine quando formano un cubo e parliamo di stafilococchi quando più o meno hanno la struttura di un grappolo. Queste sfere quando formano queste strutture non sono comunicanti tra loro ma sono esseri a se stanti tenuti solo vicini.

Es. La placca batterica la troviamo nella cavità orale nei denti ed è una pellicola di batteri che vi si attaccano grazie all’azione della saliva (contiene lisozima che degrada la parete batterica dei gram +, glicoproteine che permettono l’ancoraggio della placca al dente). Le placche quindi devono essere combattute perché possono sfociare in carie, cioè i batteri fermentano producono acido lattico che è in grado di scomporre la natura dello smalto dentale che consente al microrganismo di entrare arrivando alla polpa e provocare l’ascesso.

Esempi di batteri

Lo streptococco preumoniae è in forma di catenella può portare patologie a livello polmonare ed è uno streptococco, così come lo streptococco thermophilus che è benefico e lo troviamo nello yogurt (troviamo una “cicatrice” nel disegno ed è il punto in cui ho la separazione della parte di parete vecchia da quella nuova dovuta a duplicazione).

Bacilli e altre forme batteriche

I bacilli generalmente si trovano in formazione singola, ma raramente possono rimanere appaiati formando diplobacilli o formare catene di streptobacilli. Quando i bacilli vivono in condizioni non ottimali passano dalla forma allungata a quella ristretta formando coccobacilli. La conformazione a coccobacilli è un intermedio tra il cocco e il bacillo.

Es. Escherichia coli, è ricoperto di estroflessioni che sono più sviluppate nei ceppi patogeni perché favoriscono l’ancoraggio alla cellula.

Morfologia dei batteri incurvati

Un'altra morfologia è quella dei batteri incurvati, i quali presentano un’incurvatura e sono i vibrioni (a virgola, i vibrioni sono ad esempio i vibriocolera che possiamo trovare nell’acqua contaminata oppure mangiando cozze, vongole non certificate perché sono organismi filtranti). Possono essere spirilli (2 incurvature) o spirocheta (più incurvature).

Il problema dei vibrioni è che nel momento in cui le condizioni non sono ottimali questi passano alla forma quiescente, queste forme non si duplicano ma mantengono il metabolismo basale; quando queste forme vengono ingerite dall’organismo, questi possono trovare la loro condizione e quindi attivarsi e dare origine a copie di sé stesso. Il vibriocolera nel nostro intestino induce uno squilibrio ionico che richiama acqua per ristabilire l’equilibrio, fino ad arrivare alla completa disidratazione, data dalla sua esotossina.

Il Treponema Pallidum è uno spirocheta e creava nel medioevo una malattia che è la sifilide ed è un batterio molto esigente perché chiede tempi maggiori per la duplicazione e richiede un terreno particolare.

Batteri legati all'habitat

Abbiamo forme dei batteri molto strane legate all’habitat, come i batteri peduncolati, dei quali fa parte il Caulobacter crescentus. È un microrganismo acquatico con dei peduncoli e nel momento in cui si duplica lo fa secondo una divisione asimmetrica; due cellule figlie distinte: una sessile ed una motile. Quella sessile ha una struttura a stelo che serve per aumentare la sua superficie così da più poter assorbire nutrienti dall'ambiente. Quella motile è dotata di un flagello e colonizza nuovi orizzonti evitando la competizione. Dopo un determinato periodo di tempo, rilascia il flagello, gli cresce lo stelo e torna ad essere una cellula capace di dividersi. Questo avviene anche nei funghi, cioè la dispersione del “seme”.

Infine ci sono gli attinomiceti, batteri gram + che si sviluppano sotto forma di filamenti ramificati, possono frammentarsi o differenziare. Sono fondamentali per la degradazione della sostanza organica insieme ai funghi, e sono importanti nel ciclo dell’azoto.

Cellula procariote

Una cellula batterica è costituita da un nucleoide dove il cromosoma è superavvolto per motivi di spazio, i mitocondri sono assenti, quindi non potrebbe avvenire la respirazione, invece possiedono enzimi che sono posizionati nella membrana citoplasmatica. Ci sono i ribosomi quindi consentono la sintesi delle proteine, e sono inoltre in grado di scindere sostanze complesse in semplici.

Esternamente al citoplasma abbiamo la membrana citoplasmatica con costituenti uguali alla cellula eucariote ma differiscono per il colesterolo. La parete è diversa a seconda che siamo nei gram + o nei gram -. In connessione con la parete abbiamo le appendici esterne: pili, fimbrie (estroflessioni corte che servono come strutture di adesione e alle estremità hanno una componente adesiva), curli, flagello, tutte con la funzione di motilità.

Oltre alle appendici esterne vi è una capsula che funge da cappotto e avvolge la cellula senza però entrarne in contatto. Il ruolo è quello di proteggere la cellula dai farmaci antibiotici, ostacola la penetrazione dell’antibiotico.

Il glicocalice invece è una struttura che ha messo in atto il batterio per superare indenne l’azione dei succhi gastrici nello stomaco. (L’elicobacter pilori prende il nome perché si avvita nelle pareti dello stomaco, nel muco in particolare, si circonda di glicocalice per superare questa condizione estrema.)

Parete cellulare

- Nei gram + (ho una parete semplice): la parete ha uno spesso strato di peptidoglicano poroso e permeabile che riveste la membrana plasmatica ed è privo di membrana esterna.

- Nei gram – la struttura è più complessa: ovvero si osserva un blayer lipidico detto membrana esterna, e la membrana plasmatica detta membrana interna. Nello spazio delimitato dalle due membrane, detto periplasma, si trova un sottile strato di peptidoglicano.

La componente fondamentale della parete batterica è il peptidoglicano o mucopeptide o mureina (nei miceti sono chitina, cellulosa o glucano), comune sia ai gram + che ai gram -. L’unità di base di questo polimero è costituita da un disaccaride legato ad un tripeptide (glicano tetrapeptide). Il glicano tetrapeptide è costituito da due amminoderivati del glucosio: il NAM (acido N-acetilmuramico) e NAG (acido N-acetilglucosammina), legati da legami 1,4 glicosidici a formare la β-porzione polisaccaridica (glicano), a cui si lega a sua volta una catena di 4 aa (coda tetrapeptidica), formando catene lineari. Queste catene sono unite tra di loro dai legami tra i tetrapeptidi: nei gram – intervengono i legami crociati diretti tra le catene poiché l’acido mesodiaminopimelico (DAP) si lega convalentemente alla D-alanina formando una parete compatta:

Nei gram + intervengono legami crociati indiretti tra le catene poiché il legame è mediato da un ponte interpeptidico costituito da 5 molecole di glicina che permettono il legame tra la D-alanina e la L-lisina formando una parete poco compatta:

Parete dei gram +

È costituita da uno spesso strato superiore di peptidoglicano separato dalla membrana citoplasmatica tramite lo spazio periplasmatico. Presenta acidi teicoici e lipoteicoici, che sono i principali antigeni dei gram + e conferiscono elevata densità di cariche all’involucro cellulare, orientate in modo da influenzare/facilitare il passaggio di ioni attraverso gli strati più esterni della parete.

Gli acidi teicoici sono polimeri anionici di alcol polivalenti (glicerolo o ribitolo) esterificati con acido fosforico, che non prendono contatto con la membrana citoplasmatica ma sono legati covalentemente allo scheletro polisaccaridico del peptidoglicano. Gli acidi lipoteicoici sono acidi teicoici legati alla porzione lipidica della membrana citoplasmatica.

Parete dei gram –

È costituita da un sottile strato di peptidoglicano, circondato dalla membrana esterna, una vera e propria membrana a doppio strato fosfolipidico, asimmetrica, costituita da fosfolipidi, nel foglietto interno, e lipopolisaccaride in quello esterno, il quale è una complessa molecola anfipatica contenente sia lipidi che residui saccaridici, in particolare: lipidea, dimero di N-acetil-glucosammina esterificato con 2 fosfati e molecole di acidi grassi, che funge da endotossina, il core polisaccaridico, e l’antigene O, lunga catena polisaccaridica legata al core e in grado di indurre la produzione di anticorpi specifici nell’ospite. Nella membrana esterna sono, inoltre, immerse proteine transmembrana, che fungono da barriere selettive di sostanze nutrizionali. La membrana esterna presenta cariche negative che contrastano la fagocitosi e ostacola la penetrazione di agenti come lisozima e numerosi antibiotici.

Lo spazio compreso tra membrana esterna e membrana interna (citoplasmatica) è il periplasma, ampio compartimento acquoso che contiene enzimi ad attività degradativa. Sarà più facile da rompere la parete dei gram + perché mentre il peptidoglicano è una struttura porosa che facilita il passaggio, nei gram – ho un’altra membrana che funge da muro e non permette il passaggio.

Colorazione dei gram

Si chiamano gram + e – perché il fatto di avere queste pareti diverse fa sì che i batteri rispondano in maniera diversa alla colorazione di gram (si basa sull’utilizzo di 2 coloranti, uno colora di blu scuro: cristal violetto e uno di rosa: fuxina). Prendo la mia colonia microbica, voglio sapere se queste colonie sono + o -, prendo con un ansa sterile un pezzo di colonia, lo diluisco, lo faccio asciugare e lo fisso al calore, metto il primo colorante e il vetrino si colora di blu, aspetto, sciacquo e passo l’alcol, il quale danneggia i lipidi e in particolare lo strato lipopolisaccaridico nei gram -. Sciacquo e aggiungo fuxina, lascio agire, sciacquo di nuovo e porto a microscopio. Se ottengo blu ho i gram + perché non è andato via lo strato lipopolisaccaridico perché non ce l’ha. Se ho i gram – il colore è rosa perché va via lo strato lipidico e penetra la fuxina che dà colorazione rosa.

Capsula

È uno strato di materiale viscoso di scarto non sempre, non viene allontanato nell’ambiente ma resta aderente alla parete ma non è in contatto, la struttura è varia, sono omopolimeri o eteropolimeri di monosaccaridi, come esosi, acido uronico ed aminozuccheri.

Se il microrganismo è avvolto da questa componente non permette il riconoscimento da parte dei macrofagi e quindi la capsula ostacola anche la fagocitosi, è qualcosa che rende virulento il microrganismo. Le funzioni delle capsule sono di:

• Aderenza: aiuta ad aderire alle superfici solide acquatiche o a quelle dei tessuti delle piante o degli animali;
• Protezione: difende da improvvisi cambiamenti di temperatura all’essiccamento essendo ricca di acqua, evita l’attacco di virus batterici e di numerose sostanze tossiche idrofobe;
• Virulenza: nelle specie patogene è un fattore di virulenza in quanto protegge la cellula dalla fagocitosi.

La capsula può essere evidenziata mediante inchiostro di china (colorazione negativa), o con colorazioni specifiche.

Abbiamo anche un altro rivestimento esterno che non conosciamo ancora bene ed è lo strato S, cioè la parte più interna della capsula, è costituito essenzialmente da proteine e glicoproteine che si assemblano a formare una rete che trattiene in gran parte acqua, non è una struttura compatta. Si pensa che abbia una funzione di protezione e di ostacolare la disidratazione. Quando questi batteri capsulati con lo strato S in laboratorio vengono duplicati tendono a perdere questa struttura, questo vuol dire che viene sviluppata solo quando l’organismo ne ha bisogno.

Strato mucoso

Abbiamo poi un altro strato esterno che è lo strato mucoso che quando è presente non ha un confine molto definito, questo è dovuto ai componenti che sono diversi dai componenti della capsula, non hanno una struttura organizzata. La funzione dello strato mucoso è di ridurre l’attrito tra cellula-cellula e cellula-superficie e favorire lo spostamento del batterio su una superficie solida.

Appendici

Sono estroflessioni al di fuori della parete ma sono connesse alla cellula (al contrario della capsula e dello strato S). Per prime troviamo le fimbrie (più corte), si pensa siano organi di ancoraggio per aderire a determinate molecole sulla superficie della cellula ospite tramite dei siti di ancoraggio. Escherichia coli è ricco di fimbrie e vanno dalle 100 alle 300, altri batteri raggiungono il migliaio. Consentire l’adesione alla cellula target è un fattore di virulenza.

Il bersaglio delle fimbrie sono diverse sostanze come il mannosio, N-acetil-galattosamina, galattosio, ecc.. Batteri privi di fimbrie non sono in grado di colonizzare le cellule di un altro organismo e, pertanto, non sono dotati di potere infettante. Possono essere localizzate ai poli o distribuite su tutto il perimetro della cellula, e sono caratteristiche sia dei gram + che gram -, con minime differenze strutturali.

All’interno delle fimbrie abbiamo i curli che sono sempre delle fimbrie ma espresse in escherichia coli e salmonella, anche loro si attaccano a strutture particolari e hanno la capacità di legarsi al complesso maggiore di istocompatibilità di classe I e quindi stimolano la risposta del sistema immunitario. Intervengono nelle prime fasi di formazione del biofilm, quindi può essere considerato un fattore di virulenza.

La formazione di biofilm nel nostro organismo è un problema perché si forma su superfici biotiche e abiotiche. Una superficie abiotica è ad esempio una protesi, un catetere… Se nel momento dell’inserzione queste strutture vengono infettate dai batteri creano un biofilm ed impediscono l’ingresso di antibiotici. Cosa possiamo fare nei casi di infezione che non può essere debellata? Bisogna rimuovere la protesi! Una superficie biotica sulla quale si può sviluppare un biofilm può essere la placca dentale, dovuta allo sviluppo di batteri nella cavità orale. I batteri aderiscono allo smalto tramite la saliva che contiene enzimi (ruolo +) e contiene glicoproteine (ruolo-) perché attraverso questo i batteri aderiscono allo smalto.

La proteina di struttura dei curli, è la curlina, che può essere liberata nell’organismo ospite e dare luogo a danni di una certa entità per la sua moderata azione tossica. I pili sono più lunghi delle fimbrie e li posso trovare in una o più copie e anche queste possono trovarsi o ai poli o lungo tutta la cellula. Sono coinvolti nei processi di adesione ma abbiamo anche un pilo particolare: il pilo sessuale che è espresso dalla cellula F+ (fattore di fertilità), il pilo prende contatto con un'altra cellula batterica che non ha questo fattore e quindi viene chiamato F-, il pilo ora si accorcia, fino a consentire alle due cellule di entrare in contatto e permette lo scambio genico tra le due cellule F ed è per questo che è coinvolto nella coniugazione.

Le spine sono presenti in molte specie di batteri acquatici perché permettono il galleggiamento e consentono loro di poter usufruire di ossigeno e sostanze nutrizionali. Sono più voluminose dei pili e delle fimbrie, aumentano l’area della superficie cellulare consentendo ai batteri di rimanere sospesi per lunghi periodi di tempo.

Flagello

Il flagello è un organo di locomozione in un mezzo liquido. È un lungo filamento che si proietta all’esterno della cellula ma è in intimo contatto sia con la parete che con la membrana citoplasmatica (importante il contatto perché ha bisogno di energia che dissipa sotto forma di rotazione).