Microbiologia

Microbiologia

Microbiologia → studia i microrganismi e le loro attività negli ambienti naturali ed artificiali. Si studiano i procarioti perché presentano una biodiversità maggiore rispetto agli eucarioti, si studiano anche in relazione agli effetti che provocano, sia positivi che negativi, sull’ambiente.

Storia della microbiologia

• 1664 Hook descrive le strutture fruttifere delle muffe.
• 1673 Leeuwenhoek realizza il primo microscopio ottico e descrive diverse forme batteriche.
• Pasteur → fermentazione lattica (1857) e alcolica (1860), confutazione della teoria della generazione spontanea (1864).
• Kock → il primo ad ottenere le colture pure e il primo ad isolare il bacillo tubercolosi, concetto di coltura pura origine microbica delle malattie infettive. Coltura pura: costituite da un unico tipo di organismo.
• Gram → prima colorazione differenziale dei microrganismi, è uno dei primi test per identificare un microrganismo per catalogarlo in una specie e in un genere. (1884)
• Vinogradskij → concetto di chemiolitotrofia, abilità di ricavare energia utilizzando composti inorganici, caratteristica che non possiedono gli eucarioti. (1889)
• Beijerinck → concetto di virus (1889), colture di arricchimento → di creare delle condizioni tali da favorire determinati tipi di organismi sfavorendo altri tipi di organismi, si ottiene una proporzione relativa tra i tipi di organismi (1901).
• 1928 Griffith → principio trasformante, 1929 Fleming → penicillina, 1943 natura casuale della mutazione, 1946 Tatum e Lederberg → coniugazione, 1960 Monod & Jacob → regolazione della trascrizione, 1967 Brock → isolamento primi archea > ipertermofili, 1969 Dulbecco → scoperta retrovirus, 1977 distinzione in Eubacteria e Archaeabacteria, 1995 primo sequenziamento completo.

Classificazione dei microrganismi

Il termine microrganismo è un termine generico, organismo talmente piccolo da non essere visibile ad occhio nudo. Classificazione basata sulla filogenesi dei microrganismi: i batteri vengono suddivisi in due grandi domini, ovvero i batteri (Eubacteria) e gli archea; mentre protisti, funghi, piante e animali vengono raggruppati nel dominio degli eucarioti.

L.U.C.A. → l’ultimo antenato dal quale si riesce a risalire. Si parte da LUCA e si hanno due rami: dominio Bacteria e il secondo ramo si è suddiviso in altri due rami: archea e tutti gli eucarioti. Batteri e archea sono accomunati da un’identica architettura cellulare, ovvero procarioti che non hanno il nucleo delimitato da membrana. Gli archea presentano più caratteristiche in comune con gli eucarioti che non con i Bacteria. Procarioti (comprendono i domini dei batteri e archea) e tutti gli eucarioti (funghi, protozoi, alghe unicellulari) condividono con piante e animali la cellula (struttura fondamentale degli organismi viventi). Nei microrganismi sono compresi anche i virus, non hanno una cellula, sono acellulari.

Proprietà dei viventi

Dotati di un metabolismo (i virus no) e permette ad un organismo di riprodursi (fedeltà/mutazione), di evolvere (mutazione e selezione) e ne definisce la sua identità (ciò che viene definito dal patrimonio genetico dell’organismo). Identità ha a che vedere con le forme di differenziamento, con forme di comunicazione tra cellula e cellula e le cellule collaborano per uno scopo comune. Altra caratteristica è la mobilità, ma non nei batteri. I virus evolvono e si riproducono (cose in comune con i batteri), non hanno un metabolismo proprio, non hanno comunicazione.

Microrganismi sono importanti per la salute umana e animale, hanno un ruolo ecologico fondamentale nel riciclo della materia, sono utilizzabili in svariate applicazioni (cellula come fabbrica, attività batterica per vari scopi), per le loro piccole dimensioni, rapidità di riproduzione, si conosce molto bene la loro genetica e relativa semplicità sono spesso usati come organismi modello per lo studio di fenomeni complessi.

Procarioti

Sono organismi unicellulari, invisibili occhio nudo, si differenziano dagli Eucarioti unicellulari per la struttura della cellula (i procarioti sono privi di nucleo delimitato da membrana nucleare), si dividono in due domini filogicamente distinti (Bacteria e Archea). Cellula eucariote: organelli con diverse funzionalità, nucleo con membrana, mitocondri, Golgi, reticolo endoplasmatico e ruvido, tra i 10 e i 50 micron, lievito (eucariote unicellulare) 8 micron. Cellula procariote: parete cellulare, membrana, citoplasma con ribosomi, nucleoide e nessun particolare tipo di organello interno (sistema di funzionamento diverso da quello degli eucarioti), 1-2 micron.

Dimensioni variano in funzione del microrganismo preso in considerazione: Bacillus megaterium 1.5 x 4 micron, E. Coli 1 x 3 micron, Oscillatoria (alghe azzurre) 8 x 50 micron. Le dimensioni sono importanti anche perché non esistono compartimenti all’interno della cellula, “un po’ come se tutto potesse venire dappertutto”, è necessario che ciò che entra possa raggiungere facilmente la sede della sua attività. Un aumento di raggio relativamente piccolo fa aumentare di tanto il volume e diminuisce il rapporto superficie/volume, il quale dovrebbe essere ottimale per un adeguato sistema di scambi tra ambiente intra ed extracellulari.

Microscopio ottico

• In campo chiaro: per l’osservazione di preparati colorati → colorazioni semplici, colorazioni differenziali (permette di distinguere la caratteristica di un batterio dalla caratteristica di un altro batterio) (permettono di distinguere microrganismi diversi), colorazioni speciali (per osservazioni di particolari strutture).
• A contrasto di fase: per l’osservazione di cellule vive (motilità), si basa sul fatto che i materiali biologici possono rifrangere la luce in modo differenziale.
• In campo scuro: per microrganismi difficilmente colorabili, vengono raccolti solo i raggi difratti e riflessi.
• A fluorescenza: si basa sul principio che alcune molecole illuminate con luce di una certa lunghezza d’onda emettono luce di lunghezza d’onda diversa.

Microscopio elettronico

• A trasmissione: per lo studio dell’ultrastruttura, fa uso di fettine sottili di qualunque preparato di campione biologico per guardarlo all’interno.
• A scansione: fornisce un’immagine tridimensionale dell’oggetto, immagine superficiale della cellula.

Morfologia dei procarioti

Generali, la morfologia più comune.

Esempi di morfologia cellulare: procarioti più o meno sferici = COCCHI, batteri a bastoncino o bacilli = BACILLI, batteri con cellula più o meno curva = SPIRILLI. Esistono forme intermedie: COCCOBACILLI, bastoncino corto o sfera grande, VIBRIONE, curvi ma meno arrotolati su se stessi rispetto agli spirilli. Alcuni batteri, dopo la divisione cellulare, tendono a rimanere aggregati, le cellule rimangono aggregate le une alle altre, a due a due o a volte a più di due; se si tratta di bastoncini = DIPLOBACILLI oppure possono essere a catenelle = STREPTOBACILLI. Aggregazioni che riguardano i batteri a forma di cocco: DIPLOCOCCHI (aggregati a due a due), la cellula (il cocco) si divide secondo un piano ben preciso e rimangono le due cellule, se le divisioni proseguono sullo stesso piano e rimangono attaccati si chiama STREPTOCOCCHI; possono dividersi anche secondo piani diversi, per esempio piano ortogonali tra loro = TETRADI, in altri casi ci possono essere tre piani di divisione ortogonali tra loro = SARCINE (8 cellule a forma di cubo), alcuni si dividono secondo piani disordinati e formano dei grappoli di cellule e prendono il nome di STAFILOCOCCHI. Tra gli archea ci sono batteri con forme particolari: alcuni di forma discoidale, alcuni a forma stellare, altri quadrati con angoli tirati.

Altre morfologie procarioti: SPIROCHETE, elastico arrotolato, difficili da distinguere da certi spirilli, queste non hanno mai flagelli esterni al contrario degli spirilli; PROSTECATI, presentano una prosteca ovvero un’appendice particolare in continuità con il citoplasma della cellula, possono presentare o un peduncolo o una ifa, questa è in continuità con il citoplasma; FILAMENTOSI, dove i filamenti sono costituiti come le ife di funghi di diametro molto più piccolo, costituiti da cellule plurinucleate in continuità tra di loro in certi momenti della loro vita, vengono definite pseudo-ife, possono essere filamenti molto lunghi, molto corti o anche frammentati. Gli spirilli sono dotati di flagelli esterni ad un polo o ad entrambi i poli della cellula, le spirochete non hanno il flagello esterno alla cellula, si parla di endoflagello in questo caso, il flagello è al di fuori della membrana citoplasmatica ma all’interno di una guaina esterna che circonda tutta la cellula.

Cosa determina la forma di un microrganismo? La parete cellulare, che serve per proteggerli anche in un ambiente diverso dal loro, è rigida la parete (dominio Bacteria) ed è formata da un composto peptidoglicano (zuccheri e aminoacidi) che forma una rete tridimensionale rigida. Sono importanti anche alcune proteine che sono simili a quelle che negli eucarioti vanno a formare il citoscheletro: FtsZ, forma un anello che interviene anche nella strozzatura nella formazione delle due cellule figlie dalla cellula madre e determina il punto di inizio della divisione cellulare vera e propria, nel cocco è presente solo questa proteina; MreB, dà la forma allungata alla cellula nei bastoncino, forma una specie di spirale alla periferia della cellula, man mano che questa spirale cresce il bastoncino si allunga; nei vibrioni oltre a queste due proteine c’è anche CreS (crescentina) che si posiziona su uno dei lati della cellula batterica ed è quella che conferisce la curvatura andando a ravvicinare la parte in basso o in alto degli anelli formati dei giri di spirale, comprime da una parte e dall’altra parte tende ad aprire a ventaglio. La forma di un batterio dà dei suggerimenti, ma non dice tutte le informazioni, non è sufficiente per dare un nome a un batterio.

Struttura della cellula batterica

Come è fatta una cellula batterica tipo, da esterno ad interno. Non c’è compartimentalizzazione all’interno della cellula. Ci sono dei rivestimenti esterni di varia natura che proteggono la membrana citoplasmatica, all’esterno della cellula possono sporgere delle appendici di vario tipo che non sono come la prosteca (che è in continuità col citoplasma). All’interno della membrana citoplasmatica (che delimita l’ambiente intra ed extra) si trova il citoplasma e in questo si trovano i ribosomi, i corpi di inclusione (strutture con funzioni diverse) e la regione del nucleoide, materiale genetico della cellula che contiene il cromosoma. Generalmente c’è un singolo cromosoma, sono sempre aploide (una solo copia di ogni gene).

Membrana cellulare: fuori da questa c’è la parete ed eventuali strutture aggiuntive, strati S e capsula. Nei batteri (dominio Bacteria) la membrana è abbastanza simile a quella degli eucarioti, si tratta di un doppio strato fosfolipidico che definisce le due regioni esterne (idrofili) e quella interna (idrofobica). I fosfolipidi = glicerofosfato al quale sono legati degli acidi grassi, sono legati da un legame estere e modello mosaico a fluido. I fosfolipidi possono essere fosfatidiletanolamina o fosfatidilserina.

Membrana mosaico a fluido: struttura fondamentale e associate alla membrana ci sono molti tipi di proteine e lipoproteine, proteine associate più o meno all’esterno, proteine interne. Opanoidi, altri componenti, negli eucarioti ci sono gli steroli, hanno una struttura abbastanza simile, hanno una funzione di tipo strutturale. Ci sono alcuni batteri che hanno steroli nella membrana.

La membrana degli Archaea: sono estremofili, procarioti che sono rimasti confinati in ambienti estremi. Negli archea 3 principali gruppo: metanogeni, anaerobi stretti, esposizione all’aria è letale; alofili estremi, vivono in ambienti con concentrazioni saline estremamente elevate; ipertermofili, vivono a temperature molto elevate. Membrane hanno una composizione chimica diversa da eucarioti e Bacteria, sono fatte da molecole particolari che non sono fosfolipidi, ma sono dei dieteri del glicerolo, vanno a formare un doppio strato lipidico, dove le due facce esterne sono rappresentate dal glicerolfosfato, la parte interna è costituita da fitanile, che è una catena idrocarburica fatte da tante unità di isoprene, il legame che forma col glicerolo è un legame etere ed è un legame più resistente. Può essere uno dei tanti adattamenti dei procarioti che hanno adottato nel corso della loro evoluzione. Alcuni Archaea hanno una membrana monostratificata, dove la molecola che compone la membrana è un tetraetere del glicerolo: la parte idrofila è costituita da un glicerolfosfato, la parte interna idrofobica è costituita da un bifitanile, due catene di fitano che sono collegate tra di loro e formano un’unica molecola. Qual è la differenza che comporta questa molecola? Dal punto di vista della barriera selettiva non cambia molto, stessi passaggi più o meno tra interno ed esterno; cambia rispetto alla permeabilità e alla resistenza; queste molecole rendono la membrana un po’ più resistente, ma anche meno permeabile. I diversi tipi di membrane hanno un grado di permeabilità diverso: membrane monostratificate o nella variante con anelli a 5C sono meno permeabili delle membrane organizzate in un doppio strato.

Tra le membrane organizzate in un doppio strato degli Archaea sono meno permeabili delle membrane costituite da fosfolipidi. La presenza di doppi legami cambia la composizione della membrana dei bacteria, più aumenta il numero dei doppi legami più sono permeabili e la fluidità aumenta. Il freddo tende ad irrigidire la membrana, il batterio per contrastare il freddo aumenta il numero dei grassi insaturi per aumentare la fluidità, al contrario con un aumento della temperatura per evitare il collasso diminuisce la quantità degli acidi grassi insaturi e aumenta la quantità degli acidi grassi saturi. Quindi la membrana non ha mai una composizione identica, varia a seconda delle condizioni.

Funzioni della membrana

È una barriera selettiva che separa intra ed extracellulare, svolge anche altre funzioni importanti nei procarioti. Costituisce i sistemi dei nutrienti, contiene anche dei sistemi di secrezione. Nei procarioti la membrana svolge anche una serie di funzioni che nelle cellule eucarioti sono confinate all’interno di organelli appositi: sistemi per la respirazione, per la produzione di energia, contiene sistema di trasporto degli elettroni, in quelli che fanno fotosintesi molti componenti che costituiscono l’apparato fotosintetico sono contenute nella membrana. Un procariote deve essere in grado di riconoscere e di rispondere agli stimoli esterni, la membrana contiene dei sensori di variazioni ambientali che sono associati a sistemi di trasduzione del segnale.

Possono estendere la membrana e vanno a formare una serie di lamelle che si introflettono all’interno della cellula o alla periferia della cellula o dischi concentrici, sono continue con la membrana cellulare.

Parete cellulare

Fuori dalla membrana si trova la PARETE: è una cosa che hanno quasi tutti i procarioti con rare eccezioni, se la membrana non è adeguatamente corretta può essere che subisca dei danni; la parete protegge la membrana. Poche eccezioni senza parete: Micoplasma (Bacteria) e i Thermoplasma (Archaea). Per quanto riguarda la parete ci sono anche qui differenze tra Bacteria e Archaea: nei Bacteria c’è il peptidoglicano (mureina), negli Archaea non c’è il peptidoglicano; nei Bacteria può essere diversa sia per struttura che per composizione chimica → gram positivi e gram negativi, negli Archaea la parete può essere molto differente nei diversi gruppi di Archaea nella composizione chimica, in alcuni solo proteine e glicoproteine, in altro solo eteropolisaccaridi, in altri è formata dalla pseudomureina.

Gram positivi: hanno una parete cellulare costituita da uno spesso strato di peptidoglicano, buona parte della parete è costituita da questo. Differenza con i gram negativi: membrana citoplasmatica, più uno strato molto piccolo di peptidoglicano immerso in uno spazio chiamato PERIPLASMA, che è delimitato verso l’esterno da una membrana particolare che prende il nome di MEMBRANA ESTERNA, che nei gram positivi è assente. Quindi differenza di quantità di peptidoglicano e differenza di struttura della parete.

Colorazione di gram: è una colorazione differenziale. Come si fa? Si deve preparare il vetrino prima di tutto: si prende una goccia d’acqua si mette sul vetrino, nella goccia d’acqua tramite l’ansa (bastoncino porta ansa e filo metallico che termina con un anellino) si raccolgono dei batteri (per esempio da una piastra) e si stemperano nella goccia d’acqua, quindi si crea una sospensione batterica; il vetrino lo si lascia ad asciugare e lo si deve fissare. Per fissarlo lo si passa 3 volte nella fiamma del becco bunsen. Si può iniziare con la colorazione: primo colorante è il cristalvioletto (30 secondi-1 minuti) si sciacqua l’eccesso con acqua e si aggiunge una soluzione di iugol (favorisce la penetrazione del colorante all’interno della cellula e lo aggrappa alle molecole organiche, è mordenzante), si sciacqua con acqua, poi si lava il vetrino con soluzione di solvente organico (etanolo o acetone). A questo stadio della colorazione o si vedono le cellule viola o non si vede niente, perché il trattamento non è efficiente per asportare il colorante. Quelle che hanno colorazione sono gram positivi, i negativi col lavaggio in etanolo perdono colorazione. Il cristalvioletto penetra sia nei positivi che nei negativi, ma l’alcool disidrata e tende a sciogliere le strutture lipidiche. La membrana esterna dei negativi ha una forte componente lipidica e in lavaggio con alcool tende e a dissolversi; dove c’è poco peptidoglicano il colorante viene rimosso.