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Microbiologia

Appunti di microbiologia basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Barbieri dell’università degli Studi Insubria Como Varese - Uninsubria, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali - Varese. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Microbiologia docente Prof. P. Barbieri

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resa di crescita, ma non la velocità di crescita, la influenza solo quando la

concentrazione del nutriente di interesse è talmente bassa da non riuscire a saturare i

sistemi di trasporto. I trasportatori lavorano così velocemente che la concentrazione

dei nutrienti è sempre sufficientemente alta da non rendere limitante il nutriente. Al di

sopra di una determinata concentrazione la velocità di crescita non è influenzata dalla

concentrazione dei nutriente, questo è vero per concentrazioni così basse da non

riuscire a saturare i trasportatori. Come si esprime la velocità di crescita? Generazioni

per ora, numero di popolazioni su unità di tempo. Come si esprime la resa? Numero di

cellule per unità di volume o peso (umido o secco) in mg/L.

Costruire retta di taratura: allestisco la coltura, devo mettere in relazione il titolo

con densità ottico quindi al tempo zero misuro al densità ottica e contestualmente

faccio il bianco (che serve per misurare la densità ottica) e prelevo un secondo

campione per fare la conta. Dopo questo ho una serie di dati e nello stesso momento

ho il valore della densità ottica che di CFU/mL, questi mi servono per fare il grafico. Su

un asse metto il logaritmo del numero di cellule e sull’altro asse metto la densità

ottica. Teoricamente mettendo questi valore in grafico bisognerebbe avere una retta,

ma dopo un certo tot di valori la linearità si perde. È molto utile perché ho già i dati

per gli esperimenti successivi. Bisogna avere delle precauzioni: bisogna usare lo stesso

microrganismo e le stesse identiche condizioni, se cambia uno dei due bisogna rifare

tutta la retta di taratura, non è possibile farla universale.

Una crescita in beuta è chiamata crescita in betch, semino la coltura in tempo zero e

non vado più a modificare le condizioni che ho imposto. Anche se ho un terreno ricco

la crescita è autolimitante e si arriva alla fase stazionaria. Per avere una crescita in

continua fase esponenziale, si usa il chemostato: costituito da un serbatoio che

contiene il terreno di crescita inoculato con una quantità opportuna di microrganismi e

la camera di crescita ha uno spazio gassoso di testa, un sistema per introdurre aria o

gas, è collegato ad un serbatoio di terreno fresco sterile di cui posso regolare il flusso

con una valvola, viene aggiunto un sifone di troppo pieno che permette di allontanare

lo stesso volume di terreno che è entrato (tanto ne entra tanto ne esce), viene

allontanato il terreno esausto. In questo modo è possibile mantenere una coltura in

fase esponenziale. I due parametri che l’operatore può modificare sono la

concentrazione dei nutrienti (la definisco nel serbatoio) in ingresso e la velocità di

flusso (velocità flusso in entrata = velocità flusso in uscita); con questo parametro

modulo la concentrazione batterica e la velocità di crescita, all’interno di un certo

range, perché se la velocità di flusso è troppo bassa le cellule crescono troppo e vanno

a saturazione, se invece la velocità di flusso è troppo elevata si dilava la coltura.

Fermentatori: grande camera di crescita dove si possono controllare le condizioni,

ma non permette di mantenere una coltura sempre in fase esponenziale, di solito si

utilizza per produrre grandi quantità di biomassa.

FATTORI AMBIENTALI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA

TEMPERATURA

Ogni microrganismo ha un intervallo di temperature che vengono definite temperature

permissive della crescita. Sono importantissime la temperatura e la velocità di

crescita. Nel grafico, che ha una forma a campana asimmetrica: partendo da una

temperatura minima la velocità di crescita aumenta all’aumentare della temperatura

fino a raggiungere un massimo dopo di che decresce molto rapidamente. Spiegazione

di questo andamento: le cellule possono essere definite come un insieme di reazioni

chimiche catalizzate da enzimi, se aumenta la temperatura queste aumentano di

velocità, ma in quelle enzimatiche raggiunte una certa temperatura gli enzimi

denaturano. L’intervallo di temperature permissive ha tre punti, le tre temperature

cardinali:

La temperatura minima, al di sotto di questa temperatura la velocità di

 crescita è pari a zero perché le reazioni avvengono così lentamente o addirittura

non avvengono affatto e quindi le cellule non riescono a crescere, la membrana

gelificata come se diventasse un gel e non permette alle proteine di trasporto di

lavorare quindi la cellula non può assumere nutrienti, al di sotto di questa

temperatura la cellule non muore, si blocca solo il metabolismo;

La temperatura ottimale, è la temperatura alla quale la velocità di crescita

 raggiunge la massima possibile nelle condizioni date, temperatura alla quali le

reazioni della cellula avvengono alla velocità più alta;

La temperatura massima, la cellula non può crescere e le sue proteine

 tendono a denaturare, al di sopra la cellula muore.

Un sistema molto comodo per conservare le colture batteriche è metterle in un

ambiente freddo, in questo modo si bloccano le attività metaboliche. La cellula muore

quando si formano i cristalli di ghiaccio che provocano la rottura meccanica della

cellula. Le alte temperature sono un ottimo sistema di sterilizzazione. È possibile

conservare le colture anche a temperature più basse del frigorifero, tipo a -18°C o

anche a -80°C utilizzando composti antigelo come ad esempio il glicerolo in

concentrazioni variabili. Un sistema di conservazione per tempi ancora più lunghi è la

liofilizzazione.

Ogni batterio ha un range di temperature permissive diverso.

PSICROFILI: microrganismi che crescono bene a basse temperature (-4°C fino al

massimo a 15°C), ha la temperatura ottimale a 4°C, sono comuni in ambienti

perennemente freddi, si lavora in camere fredde e tutta la vetreria viene pre-

raffreddata; hanno enzimi adatti al freddo per cui se superano i 15°C denaturano; si

trovano nelle profondità oceaniche, marine.

MESOFILI: microrganismi che si trovano a temperatura tra i 10-12°C e i 37-45°C, E.

coli è un batterio particolare perché vive nell’intestino di animali a sangue caldo, i

mesofili in generali crescono in ambienti tra di 18°C e i 27°C. questo gruppo contiene

la maggioranza dei batteri patogeni.

TERMOFILI: possono avere temperature minime intorno ai 40°C, temperatura

ottimale intorno ai 60°C. temperatura massimo 70°C; sono in ambienti naturali o

artificiali con queste temperature.

IPERTERMOFILI: due gruppi, uno in cui la temperatura massima non supera i 100°C

(quindi crescono tra i 65-98°C) e il secondo che ha un range di temperatura ancora più

alto con un massimo di 113-115°C, temperatura superiore al punto di ebollizione

dell’acqua, hanno temperature così elevate perché derivano da sorgente termali

sottomarine, non entrano in ebollizione per la pressione della colonna idrostatica

sovrastante; sono tutti Archaea. Hanno proteine che possono lavorare bene a queste

temperature e denaturano a temperature superiori.

C’è sempre un grado di sovrapposizione tra un gruppo e l’altro. Intervallo temperature

permissive è di 30°C.

RELAZIONI CON O 2

Due aspetti: necessità di ossigeno per il metabolismo energetico e tolleranza ai

composti tossici dell’ossigeno, perché questo è un composto reattivo e quindi in

qualunque cellula esposta all’ossigeno, si formano dei composti tossici (ros) che sono

-

O -, H O , OH , perché sono potenti ossidanti che nel momento in cui reagiscono

2 2 2

tendono ad ossidare le molecole. Nel primo aspetto distinguiamo due tipi di

-

microrganismi: aerobi, O come accettore finale di e e anaerobi.

2

Sistemi per proteggere da specie reattive dell’ossigeno:

Catalasi, è deputata alla detossificazione di acqua ossigenata, H O + H O ->

 2 2 2 2

2 H O + O

2 2

Perossidasi, enzima detossificante, utilizza una fonte di potere riducente per

 convertire una moltecola di perossido di idrogeno in due molecole d’acqua e

+ + 2 +

NAD , H O + NADH + H -> 2H O + NAD

2 2

Superossido dismutasi, enzimi deputati alla detossificazione dell’anione

 2- +

superossido, 2 O + 2H -> H O + O

2 2 2 2-- +

Superossido dismutasi/catalasi in combinazione, 4O + 4H -> 2H O + 3O

 2 2

Superossido riduttasi, converte l’anione superossido in perossido di idrogeno

 + 2- +

utilizzando 2H e il citocromo c ridotto, O + 2H + cyt c -> H O + cyt

ridotto 2 2

c ossidato

Si possono classificare i microrganismi in una serie di gruppi tenendo in considerazione

i due aspetti considerati precedentemente.

Gruppo % O Metabolismo Enzimi Esempio

2 energetico detossificanti

Aerobi 18-10 Respirazione +SOD Pseudomonas

obbligati aerobica +Kat

Micro aerofili 2-10 Respirazione +SOD Azospirillum

aerobica ±Kat Treponema

pallidum

Anaerobi ± O Respirazione +SOD E. coli

2

facoltativi aerobica o +Kat

fermentazione

Anaerobi O 0.1-5 Fermentazione ±SOD Batteri lattici

2

tolleranti e fotosintesi -Kat Alcuni batteri

anossigenica (perossidasi) rossi (fototrofi

anossigenici)

Anaerobi < 0.1 Fermentazione -SOD Clostridium

obbligati Respirazione -Kat (meno

anaerobica (+SOR) sensibili)

Fotosintesi Archaea

anossigenica(i metanogeni

n alcuni casi) (molto sensibili

all’ossgeno)

Anaerobi facoltativi o fanno la respirazione o la fermentazione, mentre quelli tolleranti

non hanno scelta; in quest’ultimi nessun batterio lattico ha la catalasi funzionante

perché non possono produrre gruppi eme. Alcuni batteri lattici possono produrre una

pseudo catalasi se riescono ad ottenere il gruppo eme dall’esterno.

Come si comportano i batteri rispetto all’ossigeno? Provette con terreno semi solido

(concentrazione di agar relativamente bassa) che viene inoculato con diversi tipi di

microrganismi, essendo in una provetta ci sarà la parte più in contatto con il gas di

testa che è la parte ossigenata, man mano che si scende la concentrazione di

ossigeno tende a diminuire e sarà tendenzialmente anaerobico.

Se voglio far crescere il microrganismo in aerobiosi, dopo averlo inoculato nella beuta

lo metto in uno shaker in modo da permettere un continuo apporto di ossigeno. Per

l’incubazione si utilizzano delle particolare giare per anaerobiosi: contenitori a tenuta

ermetica che contengono una bustina che contiene sostanza chimiche che portano

alla formazione di idrogeno e CO e un catalizzatore che forma acqua facendo reagire

2

idrogeno e ossigeno.

pH

Molti microrganismi hanno metabolismo di tipo acidificante quindi si mettono dei

tamponi per tamponare il mezzo di coltura e fornire al microrganismo l’ambiente

migliore per crescere. Anche rispetto al pH possiamo suddividere i microrganismi in

classi di intervalli di pH permissivi. Ci sono tutta una serie di microrganismi che hanno

un pH ottimale intorno al pH: i neutrofili. Altri microrganismi prediligono degli ambienti

più o meno acidi: acidofili e si dividono ulteriormente in moderatamente acidofili (4.5-

5.5) o fortemente acidofili (2-3).

Min pH ottimale Max

E. coli 4.4 6.0-7.0 9.0 Neutrofili

Pseudomonas 5.6 6.6-7.0 8.0 Neutrofili

aeruginosa

Lactobacillus 4.0 4.6-5.8 6.8 Moderatament

acidophilus e acidofili

Acidithiobacillu 1.0 2.0-2.8 6.0 Fortemente

s thiooxidans acidofili

Sulfolobus 1.0 2.5 4.0 Fortemente

acidocaldarius acidofili

Baciullus 8.5 9.5 11.5 Basofilo

alcalophilus

Sono gli intervalli di pH che permettono la crescita: pH permessivi hanno variabilità

molto maggiori dell’intervallo di temperatura. Ad esempio Lactobacillus acidophilus è

un batterio moderatamente acidofilo ed è anche uno saprofito della cute: primo

meccanismo di difesa contro i patogeni; pH leggermente acido della cute e questi

batteri contribuiscono a mantenerlo tale con il loro metabolismo, rappresentando una

barriera protettiva. Altri microrganismi sono fortemente acidofili ed hanno un pH

ottimale molto basso: possono appartenere al dominio Bacteria oppure molti sono

degli Archaea. Ambienti naturali: neutrofili ovunque, moderatamente acidofili più o

meno ovunque; fortemente acidofili vivono in ambienti con pH bassissimo ad esempio

nelle solfatare o nelle acque di drenaggio delle miniere. Ci sono molti ambienti con

condizioni veramente estreme che sono popolati esclusivamente o quasi

esclusivamente da microrganismi, questi hanno un loro ruolo in quanto con le attività

contribuiscono e mantengono i cicli biologici. La vita sarebbe possibile in assenza di

batteri, di procarioti? Ad esempio i batteri della flora intestinale hanno un ruolo

importantissimo, svolgono un ruolo essenziale nei cicli biologici. Tabella: ci sono dei

limiti di minimo e di massimo, bisogna tener conto che sono dati che derivano da

esperimenti fatti in laboratorio, dove viene variato un singolo parametro mentre gli

altri parametri vengono mantenuti in condizioni ottimali; in natura non è così. Se vario

di poco i parametri ottimali i valori di pH non saranno gli stessi. In natura c’è anche il

problema delle interazioni tra fattori che in laboratorio non si considera.

Neutrofili: microrganismi con pH ottimale 6.5-7.5, appartengono ai Bacteria

 Moderatamente acidofili: pH ottimale 4.5-5, muffe, lieviti

 Acidofili estremi: pH 1-2, comprende alcuni batteri e un certo numero

 abbastanza importante di Archaea

Basofili: pH 8-11, alcuni batteri e diversi Archaea

OSMOLARITA’

Si parte dalla concentrazione salina, dalla concentrazione di NaCl, fattore importante e

suddivide i batteri in base alla loro alofilia. Si fa un grafico: in x si mette NaCl e in y la

velocità di crescita. Distinguiamo diversi batteri:

Non alofili: sopportano basse concentrazioni di NaCl, esempio E. coli

 Alotolleranti: concentrazione ottimale vicina ad E. coli, può ancora crescere a

 concentrazione di Sali superiori, non richiede NaCl ma ne può sopportare la

presenza, esempio Staphylococcus aureus, Streptococcus

Alofili: richiedono una determinata concentrazione di NaCl per poter crescere,

 al di sotto di questa concentrazione la loro velocità di crescita diminuisce,

esempio Vibrio fischeri, sono microrganismi che vivono nelle acque marine.

Richiedono [NaCl] = 3%

Alofili estremi: sono quasi tutti degli Archaea, al di sotto di una certa

 concentrazione di NaCl (piuttosto alta) questi non riescono a crescere e

crescono addirittura in condizioni di saturazione da NaCl, si trovano nei deserti

salati, nelle saline, nei laghi salati, a volte anche negli alimenti conservati sotto

sale. [NaCl] = 12-30%

Qual è il problema che devono affrontare i microrganismi che vivono in condizioni con

concentrazioni così elevate di sale? Hanno un problema di osmolarità, perché a

concentrazioni molto elevate di un determinato soluto il batterio tende a disidratarsi

perché l’acqua tende ad uscire dalla cellula. Il batterio si può difendere in un ambiente

ipotonico (acqua tende ad entrare) con un sistema di tipo meccanico; c’è qualcosa che

impedisce al batterio di disidratarsi? Dal punto di vista meccanico non c’è niente che

impedisca all’acqua di uscire, per ovviare a questo problema accumulano i soluti

compatibili. Soluti compatibili sono o degli ioni o delle molecole organiche che non

sono coinvolte nel metabolismo, quindi non interferiscono con il metabolismo

batterico, ma semplicemente aumentano la concentrazione di soluti nel citoplasma

portandola il più vicino a quella presente all’esterno della cellula, accumulando o

perché sono in vicinanza e sono composti di natura varia: composti organici (aa

modificati, glicina βina, ectoina), zuccheri (disaccaridi, saccarosio, trealosio), alcoli

(glicerolo, mannitolo), composti differenti (dimetilsulfonio propionato, più comune

nelle alghe marine); in alcuni casi sono degli ioni, in diversi Archaea alofili estremi

+

viene accumulato come soluto compatibile K . Cosa determina il fatto che un

microrganismo viene definito non alofilo? Oltre ad un certo limite non è più in grado di

accumulare soluti compatibili per contrastare l’osmolarità del mezzo. Discorso analogo

per la concentrazione di zuccheri, si parla di questa per le muffe osmofile che sono in

grado di crescere anche ad elevate concentrazioni di zuccheri; un’elevata quantità di

zuccheri è uno dei sistemi di conservazione degli alimenti. Esistono anche i

microrganismi xerofili che proliferano bene negli ambienti secchi, anche in questo caso

si tratta sostanzialmente di muffe. Tutti raggruppabili sotto la voce: acqua realmente

disponibile per il microrganismo, alta concentrazione di sali e zuccheri, può presentare

acqua ma non sufficiente per osmosi -> attività dell’acqua rappresenta l’acqua che è

realmente disponibile per l’organismo. (a ) = P /P dove P = pressione di vapore e

W camp acq

0 > a > 1. Molti microrganismi richiedono attività acqua molto vicina a quella

W

dell’acqua pura; fluidi corporei, come sangue umano, hanno attività molto vicina a

quella dell’acqua pura (0.99); l’acqua marina ha ancora un’attività dell’acqua non

eccessivamente bassa (0.98); man mano che si scende con l’attività dell’acqua, che le

condizioni diventano più restrittive cambiano i tipi di microrganismi che riescono a

sopravviver -> i Gram positivi si trovano tra 0.95 e 0.90; sotto 0.85 iniziano a

comparire muffe, funghi e lieviti; sotto 0.75 si trovano gli alofili estremi.

COLTURE DI ARRICCHIMENTO

Allestite in modo da favorire la crescita del microrganismo a cui si è interessati e

sfavorire possibilmente la crescita degli altri. Come si allestisce? Abbiamo bisogno di

terreni con determinate caratteristiche: composizione chimica, fonte C, fonte energia,

pH; altrettanto importanti le condizioni di incubazione: T, ±O .

2

Come si scelgono le condizioni? In funzioni del tipo di microrganismo che a me

interessa isolare. Voglio isolare dal suolo un microrganismo che sia non esigente per

l’N e capace di degradare il composto X, come si fa? Il terreno non può essere ricco

(LB), uso un terreno minimo a base minerale, non devo aggiungere composti organici

per l’azoto, aggiungo sali, aggiungo il composto che voglio che degradi come unica

fonte di carbonio e di energia. Siamo partiti da un inoculo di suolo, che pH uso?

Neutro, intorno al 7. Poi devo scegliere T e presenza/assenza di ossigeno, come si

scelgono? Visto che parto dal suolo che T uso? Nel suolo trovo la maggior parte dei

mesofili quindi 28-30°C, se invece usiamo un batterio che è abituato a vivere in

simbiosi si usano 37°C. Ossigeno sì o no? Ossigeno sì, si può mettere anche in

agitazione così ho una quantità maggiore di scambi di ossigeno. In sostanza il terreno

lo scelgo io, lo elaboro io in base a cosa mi interessa. Di solito le colture batteriche si

mettono ad incubare al buio. Voglio isolare un cianobatterio azoto fissatore (procarioti

che fanno fotosintesi ossigenica come quelle delle piante), che terreno uso? Terreno

minimo a base minerale, aggiungo azoto molecolare (nessuna fonte di azoto

combinato), come fonte di C uso la CO ad esempio. Lo devo mettere ad incubare in

2

una camera per anaerobiosi? No; non deve essere agitato. A che T? Temperatura

ambiente, si sceglie vicina a quella del suo habitat naturale; va messo alla luce.

Le colture di arricchimento sono tutte fatte in vitro, se diventa torbida vuol dire che

qualcosa è cresciuto, quindi semino in terreno solido (piastro) e vedo una coltura mista

perché con l’arricchimento che procede per cicli, il numero di batteri di interesse

cresce, ma non si isola una coltura pura perché nel campione ci possono essere un

paio di tipi di batteri che possono crescere nelle condizioni che ho stabilito oppure altri

batteri che ci sono non crescono, ma non muoiono. Posso avere tanti batteri di un tipo

e pochi di un altro tipo, ma comunque non ho una coltura pura. Ogni volta che

allestisco un sistema di coltura imposto già un sistema di selezione. Come ottengo la

coltura pura? Si parte da una colonia singola e ben isolata, perché si parte dal

presupposto che una colonia abbia avuto origine da una singola cellula, semino,

striscio un paio di volte e raccolgo l’ultima colonia isolata (così sono abbastanza

certa).

TASSONOMIA E CLASSIFICAZIONE

Metabolismo microbico: tutto il macchinario che serve per la crescita di un

microrganismo sono tutte le funzioni fisiologiche e biochimiche e le funzioni

codificanti.

Metabolismo energetico

I procarioti dal punto di vista metabolico presentano una biodiversità molto molto

maggiore egli eucarioti, il metabolismo di quest’ultimi è “noioso” perché si riduce a

glicolisi, ciclo degli acidi e respirazione; i batteri fanno molto di più. Partiamo dal tipo

di fonte energetica utilizzata:

Alcuni utilizzano i composti chimici -> i chemiotrofici

Composto organico -> chemiorganotrofo

Composto inorganico -> chemiolitotrofi, metabolismo che esiste solo nel procarioti.

Composti organici che possono essere utilizzati dai microrganismi?

Tutti i monomeri che costituiscono le macromolecole biologiche -> zuccheri, aa, acidi

grassi, basi azotate; questa grande capacità di utilizzare composti differenti rende i

procarioti fondamentali nel riciclo della materia organica

Composti organici naturali che non vengono utilizzati da altri organismi (alcuni derivati

del petrolio, monomeri della lignina) e anche alcuni composto organici di sintesi,

xenobiotici sintetizzati dall’uomo

Dove vanno a finire? Se si tratta di ossidazione vuol dire che stanno togliendo gli

elettroni dal composto ossidato, vengono trasportati ad una catena di trasporto degli

elettroni e man mano che apssano da un componente all’altro della catena di

trasporto di catena, si ha l’estrusione di protoni all’esterno della membrana il che vuol

dire che la membrana si carica con la forza motrice dei protoni. Quando la membrana

è carica c’è la possibilità di far rientrare attraverso specifici canali i protoni all’interno

della membrana nel citoplasma. Il tipo di accettore di elettroni al termine della catena

respiratorio definisce il tipo di respirazione, gli elettroni strappati possono finire

sull’ossigeno o su composti diversi dell’ossigeno: se finisce su O si parla di

2

respirazione aerobica, se vanno a finire su composti diversi dall’ossigeno si parla di

respirazione anaerobica. I composti che possono fungere da accettori di elettroni nella

respirazione anaerobica possono essere: nitrato, si parla di denitrificazione che viene

ridotto fino ad azoto molecolare o riduzione dissimilativa del nitrato; alcuni sono

capaci di convogliarli sul solfato SO4 riducendolo ad H2S e si parla di desulfuricazione

o riduzione dissimilativa del solfato; in alcuni Archaea possono andare a finire sulla

CO2 che viene ridotta fina a CH4 e si parla di metanogenesi. Ci sono alcuni casi in cui

nel metabolismo non c’è nessun accettore finale di elettroni esterno e nessuna catena

di trasporto degli elettroni, in questo caso si parla di fermentazione. Nella

fermentazione l’accettore è sempre interno, cioè un intermedio della stessa via

+

biochimica (es nella glicolisi serve riossidazione del NAD in NAD e scarico gli elettroni

sul piruvato che è ridotto in acido lattico: ATP durante la glicolisi è prodotto da due

reazioni (1,3 bifosfoglicerato a 3-fosfoglicerato, da PEP a pyr) in queste il gruppo P è

trasferito ad ADP che diventa ATP tramite fosforilazione a livello del substrato. Mentre

nella respirazione, l’accettore è esterno e il meccanismo per conservare l’energia è

quello della fosforilazione ossidativa.

Chemiolitotrofi: ossidano un composto inorganico deve essere un composto

relativamente ridotto. C’è un gruppo di chemiolitotrofi aerobi che è in grado di

ossidare: 2- 3-

Nitrificanti NH , NO fino a NO ,

 3

Solfo-batteri H2S -> SO4

 Idrogeno-batteri H2 -> H2O

 2+ 3+

Ferro-batteri Fe -> Fe

Ci sono chemiolitotrofi anaerobi:

Metanogeni -> Composto organico può essere ossidato tramite processo di

 fermentazione o di respirazione che si può dividere in aerobica o anaerobica; i

composti inorganici non possono essere fermentati, possono essere ossidati

soltanto con il processo di respirazione (aerobica o anaerobica).

Metabolismo di tipo fotosintetico: ci sono molti procarioti fotosintetici; nei fotosintetici

oltre ad una fotosintesi che è molto simile a quella che avviene nella piante (simile a

quella che fanno i cianobatteri) esiste anche la fotosintesi anossigenica, in questa non

viene prodotto ossigeno, in particolare sono i batteri rossi (o porpora) e batteri verdi

ed entrambi i tipi di batteri vengono ulteriormente divisi in solfurei e non solfurei. Per

distinguere la fotosintesi ossigenica da quella anossigenica bisogna vedere il donatore

di elettroni usato per la produzione di potere riducente. Nella fotosintesi ossigenica si

ha il quanto di luce che eccita la clorofilla del centro di reazione che per tornare al suo

stato fondamentale si ossida cedendo un elettrone che segue un trasporto di elettroni

e prima finisce su NAD per poter riducente, l’ATP viene prodotto tramite

fotofosforilazione, quindi si produce potere riducente, l’elettrone deriva dalla clorofilla

eccitata che rimane con un elettrone in meno che viene recuperato dalla fotolisi

dell’acqua. Quindi il donatore di elettroni è l’acqua che va incontro a fotolisi. Il

donatore di elettroni che viene utilizzato per produrre potere riducente sarà un

composto ridotto diverso dall’acqua (nella fotosintesi anossigenica).

TASSONOMIA E SISTEMATICA BATTERICA

A partire dal dominio Bacteria si scende in phylum, classe, ordine, genere, famiglie,

specie e poi ci sono i ceppi. La classificazione sistematica è come quella zoologica; in

realtà si sente parlare di phylum, la classe e l’ordine sono raramente dominati, si parla

di famiglie ma molto spesso i termini di riferimento sono genere e specie.

In zoologia il concetto di specie biologica è definito come insieme di individui che

possono incrociarsi naturalmente tra loro per dare una progenie fertile; in

microbiologia siccome i batteri si riproducono essenzialmente per scissione binaria,

per specie batterica si intende un gruppo di microrganismi (cioè cloni isolati in

coltura pura) che hanno caratteristiche comuni e che si differenziano

considerevolmente da altri gruppi: è una definizione ambigua perché il concetto di

specie è una semplificazione umana perché in realtà le specie sono sempre in

evoluzione. Comunque abbiamo un bisogno pragmatico di dare un nome alle cose per

poterle identificare facilmente e velocemente.

Criteri che caratterizzano le specie batteriche:

Classificazione per ordinare i batteri in funzione a caratteri comuni

fenetica

Classificazione > si basa sul fenotipo del microrganismo, si va a vedere una

lista di caratteristiche e in base al numero di caratteristiche comuni si fanno delle

classificazioni (tassonomia numerica).

filogenetica

Classificazione > tiene conto dei rapporti evolutivi dei microrganismi

sfruttando la genetica e delle caratteristiche molecolari.

Identificazione per dare nome univoco: applico uno o entrambi i criteri di

classificazione

Analisi di tipo fenetico (analizzo più fenotipi)

Analisi di tipo molecolari (analizzo più molecole)

Nomenclatura: strumento necessario e fondamentale per la comunicazione. La prima

parola è il genere (con iniziale in maiuscolo) e poi c’è il nome della specie (in

minuscolo) sempre scritti in corsivo oppure sottolineati. Associato ai due nomi ci può

essere una sigla che identifica il ceppo perché sono varianti della stessa specie che

hanno delle caratteristiche leggermente diverse ma mantengono tutte le

Pseudomonas aeruginosa

caratteristiche comuni delle specie > es. PAO1.

Caratteri fenotipici

Morfologia del microrganismo: forma, dimensioni (relativamente importati perché

generalmente sono sempre intorno al paio di micron) e reazione di Gram che dice di

che tipo è l’architettura della parete.

Nutrizione e fisiologia del microrganismo: si usano le informazioni riguardo alla fonte di

energia, fonte di carbonio, fonte di azoto, fonte di zolfo; relazione con ossigeno,

temperatura, concentrazione salina, pH > parametri descrittivi.

Motilità: è mobile o immobile, che mobilità ha (flagelli – se si dove, scivolamento,

vescicole gassose).

Altri parametri: pigmentazione, inclusioni cellulari, strati superficiali (capsula, strati S),

è patogeno, fa spore, che habitat ha, è sensibile agli antibiotici.

Come si fanno questi test quando isolo un microrganismo?

Per la morfologia si fa una colorazione di Gram che fa vedere sia la forma della cellula

sia la positività/negatività; per la nutrizione e la fisiologia si ha a disposizione una serie

di test biochimici che individuano microrganismi fermentanti, che fanno respirazione,

test che fanno vedere se possono usare lattosio/maltosio o per le fonti di carbonio e

azoto > si usa la selezione (temperatura…); per la motilità si devono guardare le

cellule vive, quindi non posso usare la colorazione di Gram, ma si usa il microscopio a

contrasto di fase. Nel momento in cui devo dare al batterio il genere e la specie, devo

allestire una serie di prove> seguo una serie di schemi già prodotti, cioè il sistema di

chiavi dicotomiche: sono una sorta di diagramma di flusso in cui si parte da una

domanda iniziale a cui si risponde tra due scelte (sì-no); data una risposta ne

consegue un’altra domanda per cui ci sono ancora solo due risposte possibili. La prima

domanda è sempre sulla colorazione di Gram (è positivo o negativo?), dopodiché si

possono seguire diversi sistemi, spesso già trattati (es. se è bastoncino Gram + ci si

chiede se è sporigeno o no). Così ci si inizia a fare un’idea della famiglia a cui il

microrganismo appartiene, poi ci si avvicina determinando una serie di caratteristiche.

Può essere un lavoro molto lungo che potrebbe richiedere anche prove particolari

(terreni specifici…).

Per le identificazioni rapidi si usano dei sistemi di identificazione rapida: ad

esempio test api è con una serie di pozzetti, ciascuno dei quali rappresenta un

particolare test biochimico > ho la coltura pura, inoculo tutti i pozzetti (aggiungo se

devo aggiungere qualcosa) e poi li metto ad incubare per il tempo consigliato per ogni

test. Alla fine leggo i risultati di ogni pozzetto secondo le indicazioni già fornite. Ad

esempio l’ONPG è un substrato gratuito della β galattosidasi e non può essere

metabolizzato, ma se idrolizzato dà colore giallo > test dice se il microrganismo

sintetizza o meno la β galattosidasi. Dai risultati ottenuti ricostruisco un codice

numerico che inserisco nel database, il quale mi dà la percentuale di probabilità del

tipo del microrganismo che ho studiato (percentuale perché posso avere i ceppi con

caratteristiche che differenziano dal type strain = ceppo tipo, archetipo – indicato

anche con T sopra il numero) > es. P. aeruginosa ATCCnnn (ATCC= american type

coltural collection; nnn= numeri). Il ceppo tipo è sempre uno solo.

I sistemi di identificazione rapida sono stati studiati per essere usati quando si ha già

un’idea della famiglia a cui appartiene il microrganismo d’interesse: questo perché i

test per identificare le famiglie sono molto diversi gli uni dagli altri = devo scegliere il

test rapido corretto, perché se uso quello per un’altra famiglia ottengo dei risultati

assolutamente inattendibili. Prima di scegliere quale test usare devo aver già fatto

delle operazioni con cui ipotizzo il genere o almeno la famiglia (ci si arriva con le chiavi

dicotomiche = bastoncino Gram- faccio il test di ossidasi). Esistono delle percentuali

dei risultati al di sotto delle quali bisogna riconsiderare l’ipotesi di famiglia fatta.

Approcci molecolari

Analisi degli esteri metilici degli acidi grassi

 Ibridazioni DNA-DNA

 Sequenziamento e comparazione di particolari geni, come quello che codifica

 per l’mRNA ribosomiale 16S. È il sistema maggiormente utilizzato.

Analisi degli acidi grassi: ogni specie ha determinati tipi di acidi grassi, quindi uso

per l’identificazione. Estraggo gli acidi grassi dalla coltura batterica e si derivano gli

esteri metilici (che volano) analizzati in gas cromatografica e ottengo un

cromatogramma con picchi corrispondenti ai diversi esteri metilici degli acidi grassi;

confronto i risultati con database che dice che microrganismo è. Questo sistema

richiede una elaborazione del database particolare, ci sono quindi delle strutture

specializzate per le analisi (non ci sono nei laboratori ospedalieri). Se isolo da

ambiente un qualcosa che penso sia una nuova specie, per presentare alla comunità

scientifica il candidatus prima di essere riconosciuto come nuova specie deve superare

il vaglio della comunità scientifica che si occupa di tassonomia e di riconoscimento di

nuove specie: serve un’identificazione polifasica in cui si usano diversi sistemi (non ne

basta uno) per l’analisi.

Ibridazione DNA-DNA: possiamo presupporre che ci sia elevata omologia tra il DNA

di due batteri della specie batterica, e il grado di omologia diminuisce mano a mano ci

si allontana da quella specie. Di solito anche questo è un sistema non usato

comunemente nei laboratori ma quando ho isolato una specie ma non è precisamente

il type strain. Prendo il mio microrganismo e il type strain; estraggo il DNA genomico;

faccio radiomarcatura su uno dei due (di solito il mio); frammento e denaturo il DNA e

li mescolo; poi li metto in condizioni renaturanti > il DNA del mio ceppo può rinaturare

con lui stesso o con le zone di omologie del type strain = più omologhi sono, più

elevata è la percentuale di ibridazione tra i due: 100% di omologia (di ibridazione) nel

controllo; poi misuro la percentuale di ibridi formati nel campione.

Con percentuale di ibridazione dal 70-100% dico che appartengono alla stessa specie;

tra 25-70% sono nello stesso genere ma di specie diverse; meno del 25%

appartengono a generi diversi.

Attenzione: tra il 70% e il 100% si ha una finestra molto ampia (uomo e scimpanzé

differiscono del 2%). Si usa quando voglio avere più dati relativi ad un organismo di

nuovo isolamento. Si prende un intervallo così ampio perché ogni specie batterica ha

un core genomico di geni identici, ma poi ha anche un gruppo di geni che si

differenziano e non ibridano (= sono sequenze specie-specifiche). Può esistere lo

scambio genetico (ricombinazione) tra i batteri che possono portare all’acquisizione di

nuovi geni che vengono integrati nel genoma stesso del batterio > possono originarsi

anche dei patogeni, che però mantengono un core genomico (parte più grande)

identico al batterio non patogeno da cui derivano ma hanno anche delle isole di

patogenicità (geni per essere patogeni).

Utilizzo degli orologi molecolari: sono molecole presenti in tutti gli organismi,

devono essere molecole funzionalmente omologhe e devono avere delle zone

necessariamente conservate per mantenere la funzione e delle zone invece variabili

(cambiano nel corso del tempo) > se le zone variabili sono molto diverse, gli organismi

si sono separati molto tempo prima; altrimenti le specie sono omologhe o appena

divise. Queste molecole quindi riflettono i cambiamenti evolutivi. Nella cellula

procariota ci sono diverse molecole di questo tipo, ad esempio i geni per gli RNA

ribosomiali (di solito per il 16S) perché hanno parti conservate e parti variabili, anche

con mutazioni: su queste molecole hanno effettuato la prima divisione in domini degli

organismi. Anche la proteina RecA perché coinvolta nei meccanismi di ricombinazione.

Nei 16S rRNA hanno otto porzioni variabili: il gene è lungo circa 1200 bp quindi non è

né lungo né corto, è facile da amplificare con una PCR perché le zone al 3’ e al 5’ sono

primers universali per Bacteria

zone conservate su cui possono essere disegnati i =

funzionano come primers per amplificazione del 16S di tutti i Bacteria (magari con

efficienza diversa). Prendo coltura pura, amplifico il gene che codifica per l’rRNA 16S

usando i primers universali; lo controllo con gel di agarosio (devo avere solo una

banda); prendo il DNA e lo mando a sequenziare. Quando ho la sequenza faccio

l’interrogazione di un database (pubblico): immetto la sequenza nucleotidica e mi esce

una tabella, con l’elenco di tanti microrganismi, che dice la percentuale di omologia e

la probabilità di evento della combinazione. Oppure posso anche non saper dire la

specie a cui appartiene perché più specie hanno una percentuale simile intorno al 98%

> prendo le sequenze e costruisco un albero filogenetico in cui mette in relazione una

serie di RNA (compresa la mia sequenza): vedo a quale microrganismo è più vicino.

È tenuta in considerazione anche la percentuale in GC del patrimonio del

microrganismo (GC rispetto a tutte le basi della sequenza): non definisce esattamente,

è usato come conferma.

Specie batterica dal punto di vista molecolare deve avere (non basta un solo

criterio):

Ibridazione DNA-DNA > 70%

Differenza G+C < 5%

Similarità del 16S rRNA almeno del 97%

Isolati clinici: facilmente identificabili con approcci fenetici.

Isolati ambientali: possono avere differenze veramente rilevanti, difficilmente

identificabili con gli approcci convenzionali: uso la tassonomia polifasica e almeno un

metodo molecolare.

Trovo le informazioni sui database pubblici ma la fonte principale è il Manuale di

Bergey: cinque volumi in cui, per tutti i microrganismi procarioti conosciuti, si dà una

descrizione dettagliata anche secondo gli approcci molecolari e anche in relazione alle

altre specie. Il comitato scientifico della rivista a cui ci si rivolge per presentare il

nuovo candidatus, verifica i risultati con il manuale.

All’interno di una stessa specie si possono fare ulteriori suddivisioni:

Biotipo

 Morfotipo: diversa morfologia

 Sierotipo: siero che riconosce un certo antigene non ne riconosce un altro

 Patotipo: quando ho un tipo che in base alla patologia ha delle differenze

 rispetto all’altro

Fagotipo: in base al fago da cui è infettato

In laboratorio: condizioni controllate-nutrienti abbondanti, fattori ambientali ottimali,

nessuna competizione.

In natura:

Il flusso dei nutrienti non è costante, ma intermittente (abbondanza o carestia)

 Lunghi periodi di crescita esponenziale sono molto rari (crescita discontinua)

 Polimeri di riserva

 Forme di quiescenza

Normalmente per far fronte a questi problemi le popolazioni batteriche utilizzando

meccanismi come l’accumulazione di polimeri di riserva (come riserva di carbonio,

glicogeno), altro sistema è quello di utilizzare forme di quiescenza, ossia

differenziamenti cellulari durante i quali il metabolismo è ridotto al minimo essenziale

senza dover affrontare una spesa/richiesta energetica. Una forma di quiescenza sono

le endospore.

Cosa influenza la crescita in natura?

La disponibilità dei nutrienti, secondo la legge di Liebig: la biomassa totale di una

popolazione (microbica) è determinata dal nutriente presente nell’ambiente in

concentrazione più bassa, nella concentrazione limitante. Se ho un ambiente con

grande abbondanza di carbonio, ma magari non c’è disponibilità di azoto o di fosforo,

come fa il microrganismo? In questo caso il nutriente limitate sarà l’azoto o il fosforo.

Fattori ambientali, secondo la legge di Shelford: tutti i parametri devono rimanere

entro i limiti di tolleranza del microrganismo, il superamento del valore minimo o

massimo anche di uno solo dei parametri determina l’eliminazione del microrganismo

dall’ambiente; e le interazioni dei fattori ambientali perché i valori che determino in

laboratorio sono dei range di valori abbastanza ampi, ma questo non succede in

natura, per cui normalmente i range di tolleranza sono più ristretti perché possono

variare simultaneamente, la cellula si trova ad affrontare anche diversi tipi di stress

contemporaneamente.

Dalle interazioni (positive o negativa) con gli altri membri dell’ecosistema, ci sono altre

popolazioni con le quali la nostra popolazione di interesse interagisce (ci possono

essere competizioni per lo stesso nutriente, per la stessa nicchia ecologica).

Come rispondono i microrganismi al variare delle condizioni ambientali?

Se la variazione rimane entro i limiti di tolleranza -> espressione di geni adeguati

(adattamento fisiologico) e la popolazione non viene eliminata, espressione del

patrimonio genetico di cui il microrganismo è dotato.

Se la variazione supera i limiti di tolleranza -> l’ambiente selezione il genotipo più

adatto e la popolazione che occupa quella nicchia viene sostituita (successione di

popolazioni). La popolazione viene eliminata dall’ambiente. La nicchia ecologica

occupata del microrganismo eliminato verrò occupato dalla popolazione di

microrganismi con genotipo adatto a quell’ambiente.

Patrimonio genetico del microrganismo: è costituito, a livello di specie, da un core di

geni comuni a tutti i membri della specie, ma anche da parti che possono variare da

ceppo a ceppo, sono comunque parti importanti che possono favorire il ceppo che è

dotato di quelle capacità in un determinato contesto. Sistemi di ricombinazioni

permettono l’evoluzione della specie.

BIOFILM

Particolare modalità di crescita negli ambienti naturali. In natura si è scoperto che i

microrganismi hanno un’altra modalità di crescita -> biofilm. È una delle modalità

prevalenti. Biofilm = vera e propria comunità microbica, ben strutturata dal punto di

vista architettonico, formata da batteri e cellule eucariotiche racchiuse in una matrice

polimerica prodotta dalle cellule stesse e che cresce su superfici (inerte o biologiche)

soprattutto quando questa superficie è all’interfaccia con una fase liquida.

Dove si trovano?

Sono decisamente diffusi

 La placca dentaria

 Infezioni veramente difficili da debellare

 Protesi mediche

 Sistemi industriali, tubature industriali

 Alcuni particolari ecosistemi

 Bioremediation, biorisanamento di suoli inquinati

 Depurazione acque, fanghi con compiti di depurare l’acqua prima di immetterla

 in un recettore

Fanghi acidi da miniere

 Superficie solida, sopra parte liquida con tutta una serie di specie batteriche

 dove le cellule sono incapsulate dentro la matrice che producono loro stesse. Il

biofilm però non è qualcosa di uniforme. Microscopia a laser con focale che dà

un’idea 3D di com’è fatto un biofilm: strutture a forma di fungo costituite da

matrice all’interno delle quali ci sono i microrganismi che vanno a formare i

biofilm, all’interno ci sono degli spazi vuoti che permettono lo scorrimento del

fungo e vengono definite canali.

Come si forma un biofilm e in quanto tempo? I tempi possono essere anche

relativamente brevi, dipende anche dal tipo di microrganismo. Formazione:

Fase di assorbimento: un batterio natante, forma planctonica, si forma con una

 superficie solida, si attacca in modo reversibile alla superficie, questa

interazione segnala al batterio di cambiare la sua morfologia

Il batterio degrada il flagello e produce delle fimbrie, si attacca in maniera

 irreversibile alla superficie

Il batterio inizia a dividersi e forma una microcolonia, la velocità dipende dalla

 condizioni e dalle caratteristiche del batterio

Una volta che il numero di cellule ha raggiunto un certo valore iniziano a

 produrre la matrice del biofilm -> formata da esopolisaccaridi, molti

microrganismi producono come esopolisaccaride tipico l’alginato, si può trovare

anche del DNA che sembra avere un ruolo strutturale

Biofilm inizia a crescere e maturando forma la struttura a fungo; a questo punto

 possono associarsi al biofilm in crescita anche altre specie batteriche e si va a

formare un biofilm misto. In laboratorio di solito si fa di coltura pura

La maggior parte delle cellule esterne sono cellule non vitali, mentre le cellule interne

sono cellule vitali e sono all’interno della matrice.

I batteri si moltiplicano e parte dei batteri lasciano il biofilm, nuotano via (sono nella

forma flagellata) e vanno a colonizzare altri ambienti, quindi ci deve essere

l’espressione di particolari geni per permettere questa cosa. Oltre che singole cellule ci

possono essere parti del biofilm che si distaccano e si allontanano, ci possono essere

cellule che possono ricostituire i biofilm in una nuova posizione. Quando si rimuove il

biofilm con azione meccanica le cellule possono spostarsi e andare a ricostituire il

biofilm in una nuova posizione, c’è il rischio che i biofilm siano responsabili delle

infezioni croniche.

Come fanno i batteri a fare tutto questo? Comunicano tra di loro tramite segnali

chimici. Sistema di comunicazione tra batteri molto importante, sistema di regolazione

genica -> QUORUM SENSING, sistema di regolazione genica che è controllato dalla

concentrazione cellulare; ci deve essere una soglia minima, concentrazione cellulare al

di sotto della quale alcune attività non sono ritenute produttive, mentre possono

essere produttive se la concentrazione supera una determinata soglia. Ci sono delle

attività che da soli non hanno molto senso perché richiedono uno sforzo talmente

imponente che si rischia il fallimento, ma se ho un gruppo di membri che collaborano

l’aumento del successo è considerevole. Se i batteri sono troppo pochi non iniziano

neanche a produrre i fattori di virulenza, se superano invece una soglia critica iniziano

a produrre. Ogni singola cellula batterica produce una determinata molecola che è un

segnale chimico. Se la concentrazione batterica è molto bassa si diluisce nel mezzo,

aumentando la concentrazione batterica aumenta anche la concentrazione della

molecola segnale che rientra nella cellula e interagisce con dei fattori e inizia la

trascrizione dei geni di quel particolare sistema. Nella produzione di un biofilm. Molti

dei geni che contribuiscono alla formazione del biofilm sono controllati in questo

modo, per cui durante la vita planctonica della cellula questi geni sono inattivati. La

produzione delle molecole segnale c’è sempre, la concentrazione locale della molecola

segnale dipende dalla concentrazione batterica, cambia anche il metabolismo delle

cellula. Ci sono diversi quorum sensing e dipende dal tipo di batterio preso in

considerazione: per esempio pseudomonas ha 3 sistemi di quorum sensing.

I biofilm sono molto difficili da eradicare perché sono ad esempio molto più tolleranti

agli antibiotici rispetto alle cellule planctoniche. Si parla di tolleranza e non di

resistenza perché la resistenza è un carattere ereditabile, può venire acquisita

attraverso delle mutazioni, ma richiede proprio un certo genotipo e di solto è specifica

per un certo tipo di antibiotico o per una classe di antibiotici con una base chimica

comune. Come fa un batterio ad essere resistente alla penicillina? Producono degli

enzimi che tagliano l’anello β-lattamico. Per tolleranza si intende qualcosa che non è

ereditabile e di solito quando si parla di questo è un po’ tolleranza non verso uno

specifico antibiotico, ma un po’ a tutti gli antibiotici o a classi non chimicamente

correlate tra di loro; la tolleranza è più simile ad un adattamento fisiologico; la

presenza della matrice aiuta questa tolleranza in quanto rende più difficile il passaggio

dell’antibiotico. C’è anche una risposta agli stress: più si va avanti dall’esterno

all’interno della matrice c’è meno ossigeno, le cellule che stanno ad una certa

profondità saranno cellule che sono in condizioni più stressate rispetto a quelle che

sono nelle parti più esterne. Come le cellule che sono in fase stazionaria, si attivano

dei sistemi in risposta allo stress. Quindi le cellule in base alla loro posizione all’interno

della matrice hanno un’espressione genica diversa. Quelle più interne vengono

definite persisters, perché sono quiescenti, ma rappresentano il seme per la nuova

generazione, nel momento in cui le cellule intorno vengono eliminate i persisters si

riattivano e possono produrre il biofilm. Le parte più esterne del biofilm tendono ad

assorbire lo stress, ma c’è sempre qualche membro della popolazione che è pronto a

riprodurre in tempo più o meno lungo questo tipo di strutture. Il biofilm può essere

considerato come una prima forma di multicellularità: comunicazione tra le cellule per

un fine comune, diversi tipi di cellule (diverse espressione geniche delle cellule che in

quel momento stanno seguendo diversi programmi di espressione genica) rispondo a

funzioni differenti. Un biofilm va considerato come qualcosa di vivo, è una comunità

viva, il biofilm è continuamente in crescita, nel momento in cui riesco ad uccidere tutte

le cellule presenti nel biofilm quest’ultimo si disgrega, quindi questo richiede proprio

un’attività microbica. Non è semplice eliminare completamente un biofilm; man mano

che i batteri muoiono i biofilm si “affloscia”, si “appiattisce”.

Chemio-organotrofia -> trarre energia da composti chimici.

Fermentazione: metodo per trarre energia quando non sono disponibili accettori

finali di elettroni esterni. Quando gli elettroni fluiscono da una coppia con un

potenziale redox negativo e una coppia con potenziale redox più positivo si libera

energia che viene conservata sotto forma di ATP. Quali sono i meccanismi per la

conservazione dell’energia, che permettono di generare ATP? Nelle fermentazioni l’ATP

è generata mediante fosforilazione su substrato.

Se utilizziamo come sistema modello il glucosio, la prima serie di reazioni che

avvengono nella fermentazione è una serie di reazione che porta a scindere il glucosio,

sono reazioni glicolitiche. Le vie per l’iniziale scissione e ossidazione del glucosio sono

più di una, la glicolisi per eccellenza è quella MB (?). Come funziona? In due stadi:

primo stadio iniziale che consiste in una serie di reazioni preparatoria, seconda serie di

reazioni che sono quelle dell’effettiva ossidazione degli intermedi che si sono formati e

hanno come risultato la formazione di ATP mediante fosforilazione a livello de

substrato e hanno come risultato anche la formazione di trasportatori ridotti. Prima

reazione: da glucosio a glucosio 6 P, fosforilazione. Il glucosio entra con il sistema delle

fosfotransferasi, la prima reazione è catalizzata contestualmente dall’ingresso del

glucosio in cellula non proprio dall’esochinasi, il fosfato utilizzato dalle fosfotransferai

deriva dal PEP; dal punto di vista energetico la cosa è equivalente (come se arrivasse

da ATP). Poi conversione da G6P a F6P, fosforilazione da ATP da F6P a F1,6BP. Poi

reazione catalizzata da aldolasi, scinde F1,6BP in diidrossiacetone fosfato e

gliceraldeide 3P, il diidrossiacetone viene convertito in gliceraldeide 3P. prima reazione

di fosforilazione con introduzione di fosfato inorganico e si crea 1,3 Bifosfoglicerato, il

fosfato in posizione 1 ha un legame ad alta energia, ossidazione e gli elettroni passano

al NAD+ che diventa NADH. Poi formazione del 3-fosfoglicerato e ATP, questo viene

convertito in 2-fosfoglicerato e poi in PEP. Questo è il secondo composto ad alta

energia e può venire sfruttato per produrre ATP mediante fosforilazione a livello del

substrato e poi risultano 2 molecole di piruvato. Le reazioni non si fermano qui per un

bilancio di ossidoriduttivo. Se continuano a convertire il glucosio in piruvato il NAD+

diventa NADH e si esaurisce e la glicolisi si blocca. Quindi serve qualcosa per

rigenerare NAD+ -> si passa al terzo stadio che può essere una fermentazione (con il

termine fermentazione si intende anche la glicolisi). Fermentazione: il NADH viene

riossidato utilizzando un intermedio che si è formato durante la via catabolica stessa,

ovvero il piruvato. A che cosa serve? Serve a mantenre l’equilibrio ossidoriduttivo.

Nella respirazione anche qui abbiamo una riossidazione del NADH, ma viene riossidato

cedendo gli elettroni alla catena di trasporto degli elettroni. Diversi tipi di

fermentazione. Di solito le fermentazioni prendono il nome dai prodotti finali della

relativa via catabolica: lattica (acido lattico), omolattica (solo acido lattico9) alcolica

(alcol), propionica (acido propionico o derivati). Fermentazioni, tutte queste vie

servono per riossidare il NADH:

Omolattica: acido lattico -> batteri lattici omofermentanti

 Alcolica: S. cerevisiae, piruvato in acetaldeide con liberazione di CO2, riduzione

 acetaldeide in etanolo con riossidazione NADH

Propionica: uno dei prodotti principali è l’acido propionico

 Acido mista: tipica un gruppo di batteri enterici, (E. Coli), i prodotti finali sono

 una miscela di prodotti acidi (acido lattico, acido acetico succinato, acido

formico sotto forma di formiato)

Acido mista, esempio, fermentazione del 2,3-butandiolo (uno dei prodotti

 principali di questa fermentazione), condotta da batteri enterici

Isoacetonbutilica: porta alla formazione di butanolo, butirrato, acetone e anche

isopropanolo

Sono fermentazioni che si innescano sulla glicolisi, il piruvato viene utilizzato come

accettore e deriva dalla glicolisi secondo la via di MB.

Fermentazione alcolica

Il piruvato viene decarbossilato a dare acetaldeide e il gruppo aldeidico viene ridotto a

gruppo alcolico con produzione di etanolo e riossidazione del NADH al NAD+ (enzimi:

piruvato carbossilasi e alcol deidrogenasi).

Batteri enterici: gruppo fisiologco di microrganismi, d procarioti, appartengono al

dominio Bacteria, bastoncini gram negativi (dal punto del phylum genetico

appartengono alla classe dei gamma-proteobatteri), asporigeni, immobili o mobili per

flagelli peritrichi, anaerobi facoltativi (è capace di cambiare il suo metabolismo in

presenza o assenza di ossigeno), catalasi positivi, ossidasi negativi. Capaci di

fermentare glucosio con produzione di acidi e riducono il nitrato e nitrito, tuttavia non

vengono classificati come denitrificanti (respirazione anaerobica in cui l’accettore

finale di elettroni è il nitrato che viene ridotto fino ad azoto molecolare).

Fermentazione acido-mista

I prodotti finali sono una miscela non equimolare di prodotti acidi. Il piruvato prodotto

dalla glicolisi con 2ATP e 2NADH, questo va sul piruvato e si producono o lattato

(lattato deidrogenasi) o acido succinico (ossidazione piruvato e diventa ossalacetato e

alla fine dà succinato) o scissione teoclastica del piruvato -> acido piruvico viene

scisso tramite CoA e si forma acetil-CoA e acido formico dal gruppo carbossilico. In

molti enterobatteri l’acido formico piò venire ulteriormente scisso andando a formare

idrogeno e co2. Destino CoA: convertito in acido acetico o se è necessario riossidare

ulteriori molecole di NADH può farlo convertendo il CoA in etanolo; in alcuni casi

quando si forma acetil-CoA, questo legame è ad alta energia e il CoA può essere

sostituito con un gruppo fosfato che può essere utilizzato per formare un’ulteriore

molecola di ATP sempre tramite fosforilazione a livello del substrato. Caratteristica di

questa fermentazione: molti dei prodotti finali sono prodotti acidi, quindi cosa succede

all’ambiente in cui sta l’organismo? si abbassa pH. Interessante è anche la produzione

di idrogeno e anidride carbonico, si forma gas e questo può essere utilizzato a livello

tassonomico. Come si fa a vedere se si forma del gas? Si inserisce nella provetta una

campanella di vetro rovesciata; la CO2 è solubile nel terreno, ma l’H no e tende a

raccogliersi nella campanella e si forma una bolla di gas prodotto dalla fermentazione.

Chi fa la fermentazione acido-mista? E. Coli, Salmonella, Shigella, Proteus, Citrobacter.

Tipico della fermentazione: abbassamento pH sotto 4.5 perché il rapporto tra prodotti

finali acidi e prodotti neutri è di 4:1, mentre CO2:H è 1:1, lo mettiamo in evidenza

utilizzando terreni con indicatori di pH, come rosso metile che diventa rosso verso pH

< 4.3.

Fermentazione 2,3 butandiolo

Variante della fermentazione acido-mista; in questa fermentazione si formano gli stessi

prodotti e in più il 2,3 butandiolo. E’ un bialcol a 3C. primo passaggio è una

condensazione di 2 piruvati e contestualmente una decarbossilazione con

allontanamento di CO2, quindi si forma un composto a 5C che si chiama acido alfa

acetolattico, questa è la molecola che viene utilizare per riossidare NADH. Subisce

un’altra decarbossilazione e diventa acetoino e questo poi subisce un’ossidazione e

diventa 2,3-butandiolo. Cos’ha di diverso? In primo luogo si forma un composto

(acetoino) che non è presente nella fermentazione acido-mista, ci sono dei reagenti

che possono essere utilizzati e la reazione prende il nome di (?), il reagente è alfa-

naptolo…

Carattestiche: il rapporto tra acidi e prodotti neutri è 1:6, si formano molti meno acidi,

utilizzando il test del rosso metile rimane di colore rosso, perché pH rimane superiore

al valore di viraggio; cambia rapporto tra CO2 e H, perché per formazione di 2,3

butandiolo da 2 piruvato devono venire allontanati due gruppi carbossilici sotto forma

di CO2 e quindi si libera molta più CO2. Quali sono gli enterobatteri? Enterobacter,

Serratia (questi non hanno habitat intestinale, sono nelle acque e nei suoli), Klebsiella

(contiene sia membri patogeni che patogeni opportunisti).

Genere Habitat

Escherichia Microbiota normale del trattto intestinale

di animali a sangue caldo

Salmonella, Shigella e Providencia Patogeni intestinali di essere umani e di

altriprimati

Hafnia Feci di esseri umani, altri animali ed

uccelli

Edwardsiella Animali a sangue freddo, possono essere

patogeni per anguille

Proteus Tratti intestinali di esseri umani ed altri

animali, anche suolo ed acque inquinate

Morganella

Yersinia

Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter e

Serratia

Erwinia

Vibrionacee

Bastoncini leggermente curvi e di solito possono avere flagellazione o polare o mista,

anaerobi facoltativi fermentanti, sono ossidasi positivi. Vivono in acque dolci o marini,

producono bioluminescenza. Catalizzano utilizzando ossigeno la riduzione di

un’aldeide all’acido corrispondente ed emettono luce. Fenomeno regolato dal quorum

sensing, la trascrizione dei geni necessari per la produzione della luce dipende dalla

densità cellulare.

BATTERI LATTICI

Cocchi o bastoncini, gram + basso contenuto in GC, immobili, anaerobi ossigeno

tolleranti (il loro metabolismo energetico è anaerobio, ma possono vivere anche in

presenza di ossigeno), fermentanti, catalasi negativi. Non sanno fare la catalisi perché

sono del tutto incapaci di produrre il gruppo eme, non sanno fare vitamine.

Actinomiceti -> alto contenuto GC. Lattici e sporigeni -> basso contenuto Gc.

Mantengono forme di aggregazione dopo la divisione cellulare, la morfologia e tipo di

fermentazione che fanno sono caratteristiche fini e profilo tassonomico. Fanno tutti

fermentazione omolattica.

Fermentazione omolattica

Glucosio degradato secondo glicolisi quindi 2piruvato, 2 ATP, 2 NADH, quest’ultimo

riossidato a spese del piruvato tramite lattato deidrogenasi. Resa netta: 2ATP.

Fermentazione eterolattica

I prodotti finali sono: acido lattico, etanolo (acetato), CO2. Non si innesta sulla via

glicolitica di MB, utilizza un’altra strategia per il catabolismo del glucosio. Glucosio 6P

non viene convertito in F6P ma viene ossidato a 6 acido fosfogluconico, si produce

NADH. L’acido passa a … poi si arriva a ribulosio e poi xilulosio…

Da una molecola di glucosio viene prodotta lattato, etanolo, CO2, 1 ATP, non c’è resa

netta di NADH perché tutto quello prodotto è stato riossidato. Se è una fermentazione

sfavorevole perché i batteri l’hanno conservata? Perché non possono fare altro. Molti

batteri hanno tante esigenze nutrizionali e hanno perso alcune capacità, in particolare

non sanno fare i citocromi, hanno bisogno di acido organico e vitamine e mancano di

enzima aldolasi e quindi non possono scindere il fruttosio nei due triosi. Quanta

biomassa produce un batterio lattico che fa la fermentazione omolattica con uno che

fa la fermentazione eterolattica, a parità di substrato cosa ci si aspetta? Una maggiore

produzione di biomassa.

Dove si trovano? In habitat ricchi di sostanze organiche, materiali di piante in

degradazione, caseificio, tratto gastro-enterico di animali, vagina di mammiferi.

Leuconostoc: produzione di esopolisaccaridi (capsula) quando crescono su saccarosio

(destrani) o fruttosio (levani). Tra i batteri lattici ci sono anche dei patogeni.

Genere Gruppi Specie Emolisi su agar Habitat

antigenici rappresentativ sangue

(Lancefield) a

Streptococch

i

Sottogruppo A, B, C, F, G S. Pyogenese Β (lisi) Tratto

Pyogenes respiratorio,

sistemico

Sottogruppo - S. mutans Alfa Cavo orale,

Viridans (decolorazione intestino

)

Enterococchi D E. faecalis Β, alfa, Intestino,

nessuna vagina, piante

(gamma)

Lattococchi N L. lactis Nessuna Piante, latticini

Genere Motilità Arrangiamento Rapporti con O2 Altro

cellule

Micrococcus No Gruppi, tetradi Aerobio stretto Alto GC,

(o da 2 o da 4) habitat suolo

Staphylococcu No Gruppi, paia Anaerobio S. aureus è

s facoltativo patogeno

(fermenta)

Listeria Si (fl. Coccobacillo Microaerofili/anae Alcuni

Peritrichi) catenelle da 3 robi facoltativi patogeni

a 4 cellule

Sarcina Di solito no Gruppi di 8 Anaerobi obbligati Habitat suolo

cellule (cubo) e feci

Sthapylococcus: è un genere che ricorre molto spesso soprattutto nel caso di

determinate patologie. Presenta dei raggruppamenti non ordinati, si presentano come

grappoli -> al momento della divisione cellulare il piano di divisione varia di volta in

volta. Altri come micrococco o come sarcina hanno raggruppamenti più regolari. Tra gli

stafilococchi ci sono diversi patogeni, anche tra le listerie.

Streptococcus pyogenes e staphylococcus auerus: patogeni abbastanza diffusi,

possiamo trovarli come commensali nell’organismo (tratto respiratorio superiore e

anche sulla cute). Sono due microrganismi abbastanza noti per produrre infezioni di

natura diversa. Sono caratterizzati dal fatto di avere una trasmissione aerea e

infezione e intossicazione alimentare. Infezione: quando il microrganismo riesce ad

insediarsi e proliferare all’interno dell’ospite. Intossicazione: quando un individuo

riesce ad ingerire una molecola prodotta dal microrganismo. Cosa causano? Entrambi

possono causare delle infezioni cutanee (impetigene), possono dare luogo a infezioni

con produzione di pus, entrambi possono dare la sindrome da shock tossico (sindrome

causata dal contatto con alcune tossine batteriche che causa una super reazione

immunitaria, per cui l’organismo va in shock; la reazione può essere talmente violenta

che in alcuni casi può portare alla morte dell’individuo; è simile allo shock anafilattico).

Le diverse patologie dipende da qual è il distretto corporeo che il microorganismo

riesce a raggiungere e colonizzare: ad esempio streptococcus che si insidia nelle vie

aeree superiori abbiamo della faringiti o delle otiti, anche delle mastiti. Entrambi

possono addirittura causare delle meningiti. In più streptococcus quando è lisogeno

per un determinato tipo di fago può causare l’esantema tipico della scarlattina

(chiazze rosse sulla pelle, questo esantema è dovuto ad una tossina prodotta dagli

streptococcus che è lisogeno per un determinato fago; ci sono determinati fagi che

portano nel loro genoma che conferiscono all’organismo che li lisa delle caratteristiche

particolari di cui normalmente non è dotato).

Via di Entner-Doudoroff

Modalità di ossidazione del glucosio, piuttosto comune tra i batteri. Modalità che in

alcuni, ma abbastanza rari, può essere preliminare ad una fermentazione; in molti

organismi è invece preliminare ad una respirazione aerobica.

Inizia sempre dal glucosio 6 fosfato, che a seconda del tipo di trasporto a seconda

dell’organismo può entrare già fosforilato o viene fosforilato da una chinasi. Il glucosio

6 P subisce una deidrogenazione e diventa 6-fosfogluconolattone poi subisce idratasi e

diventa 6 fosfogluconato, questo vene deidratato e diventa KDPG, poi ad opera

dell’aldolasi avviene una scissione e si formano piruvato e gliceraldeide-3P, questa

gliceraldeide entra nella parte bassa della via glicolitica e va a produrre piruvato.

Quindi il prodotto dell’ossidazione di una molecola di glucosio tramite questa via è

costituita da 2 molecole di piruvato; cosa cambia dall’altra via? La quantità di potere

riducente prodotto è analogo ad entrambe le vie; in questa 1 molecola arriva da

questa via e l’altra molecola arriva dalla glicolisi. Abbiamo una resa inferiore perché

abbiamo solo una molecola di gliceraldeide 3P, resa netta 1ATP.

Fermentazione alcolica di Zymomonas

Fermentazione alcolica per lo più è prodotta da lieviti, poi ci sono anche alcuni batteri

(come quelli lattici eterofermentanti che possono produrre etanolo anche insieme ad

altri composti). In questa vengono prodotti etanolo e CO2, le due molecole di potere

riducente vengono riossidato a spese dell’acetaldeide che viene ridotta in etanolo,

l’acetaldeide deriva dalla decarbossilazione del piruvato. È una fermentazione alcolica

tipica dei prodotti della fermentazione dell’agave.

Bifidobacterium

Le cellule sono biforcute, sono bastoncini più o meno ramificati e fanno parte dei Gram

+ ad alto contenuto di GC (ci sono anche i batteri filamentosi), sono microrganismi

molto comuni nell’intestino dei lattanti. (Non la chiede quasi mai nei dettagli). 2

molecole di glucosio 6P viene convertite in fruttosio 6P poi ci sono riarrangiamenti di

zuccheri con la produzione di zuccheri a 4,5 o 7C, fino ad arrivare allo xilulosio 5P.

questo è l’intermedio che subisce la scissione. I prodotti finali sono acetato (3

molecole) e lattato (2 molecole); questa parte è necessaria per la riossidazione del

potere riducente. Questi microrganismi sono abbastanza efficienti dal punti di vista

energetico. Abbiamo 5 ATP per due molecole di glucosio, quindi riescono a ricavare più

energia rispetto ad altre fermentazioni, anche se l’energia di ricavata è sempre poca.

Fermentazione propionica

Tipica dei batteri propionici, sono Gram +. (Non la chiede nei dettagli). 3 molecole di

lattato da cui viene prodotto piruvato che entra nel ciclo degli acidi tricarbossilici, va a

produrre propionil-CoA che viene riutilizzato e anche 2 metilmalonil-CoA viene

riutilizzato e il prodotto finale è il propionato. I batteri propionici sono anche quelli che

danno l’aroma caratteristico e l’occhieggiatura dell’Emmental.

Da sapere: che non sono solo il glucosio o gli zuccheri i substrati fermentescibili.

Anche gli aa possono essere fermentati.

RESPIRAZIONE AEROBIA

I microrganismi chemioeterotrofi possono utilizzare come fonte di energia di C tutti i

composti di origini naturale. Quindi lipidi, saccaridi e proteine. Il primo step è la

scissione nei monomeri che costituiscono la macromolecola (proteasi -> aa, enzimi

che scindono i polimeri del glucosio, lipasi -> lipidi in acidi grassi e glicerolo). Tutti

questi monomeri possono essere indirizzati verso il ciclo degli acidi tricarbossilici verso

la completa riduzione in CO2. Aa: il primo step è l’eliminazione gruppo amminico,

scheletro carbonioso indirizzato tramite vie al ciclo. Monosaccaridi: glucosio convertito

fino al piruvato, da questo diventa acetil-CoA. Glicerolo: condotto tramite

conversazione in piruvato. Acidi grassi: β-ossidazione. Questo ciclo serve per

mineralizzare la molecola: prodotti finali CO2 e si ricava molta più energia rispetto ad

un fermentazione. Dal ciclo per ogni molecola di acetil-CoA escono 2 CO2 e una certa

quantità di piridinucleotidi ridotti. La riossidazione si ha scaricando gli elettroni dal

NADH alla catena di trasporto degli elettroni in cui tutti gli elementi associati alla

membrana in modo ordinato per passare da potenziale più negativo a potenziale più

positivo: NADH deiodrogenasi permettono di cedere elettroni al complesso I che poi

cede elettroni ai chinoni. Permette di produrre ancora più energia.

Ciclo: piruvato subisce decarbossilazione ossidativa, si forma acetil-CoA che entra nel

ciclo, subisce reazioni, punti in cui esce CO2 è da isocitrato a alfa-chetoglutarato con

formazione di potere riducente e da alfa-chetoglutarato a succinil-CoA, potere

riducente anche da alfa-chetoglutarato a succinil-CoA, da succinil-CoA a succinato, da

succinato a fumarato e da malato all’ossalacetato.

Catena di trasporto degli elettroni sulla quale il NADH scarica gli elettroni. Varie

componenti: NADH deidrogenasi che permettono al NADH di cedere elettroni al

complesso delle flavoproteine e delle proteine ferro-zolfo (complesso I); queste cedono

gli elettroni ai chinoni e in alcuni punti della catena contestualmente al trasporto degli

elettroni all’accettore successivo abbiamo anche l’estrusione di elettroni. I chinoni

cedono gli elettroni al complesso III con estrusione di protoni, seguono altri citocromi

(c e a) e nell’ultimo punto con estrusione di protoni. Accettore terminale è l’ossigeno

che si riduce ad acqua. Si è formato il gradiente protonico transmembrana con cariche

+ all’esterno e cariche – all’interno. Questo gradiente protonico può venire sfruttato:

gli elettroni possono rientrare nel citoplasma tramite ATPsintasi (costituiti da diverse

proteine che formano un canale per il reingresso dei protoni e una parte

citoplasmatica responsabile della formazione di ATP da ADP e Pi. Per ogni 3 protoni che

rientrano in cellula può venire sintetizzata una molecola di ATP.

Bilancio generale della respirazione aerobica per fare il confronto con le fermentazioni.

Nella glicolisi abbiamo 2 ATP per fosforilazione del substrato e 2 NADH. Per 2 NADH

che entrano nella catena di trasporto degli elettroni vengono prodotti 6 ATP (ci sono 3

“punti” per la produzione di ATP, per ogni NADH riossidato si formano 3 ATP). Ciclo di

Krebs (da piruvato) vengono prodotti 4 NADH (3 nel ciclo di Krebs, una nella

decarbossilazione del piruvato), 1 FADH e 1GTP (fosforilazione a livello del substrato,

per ogni molecola di glucosio). La somma di queste dà 15 ATP per piruvato quindi ne

abbiamo 30 + 8 ATP -> 38 ATP.

Le vie biosintetiche impiegano più o meno la stessa quantità di ATP (di energia in

generale). Per un microrganismo che usa un composto organico per energia e C, la

differenza tra fermentazione e respirazione è diversa. Se fa fermentazione dovrà

ossidare il composto per avere energia e ne rimarrà di meno per le biosintesi. Un

microrganismo che fa respirazione servirà poca ossidazione per avere energia e la

restante parte di composto serve come fonte di C. Quindi si produce più biomassa con

la respirazione, è molto più vantaggiosa di qualsiasi fermentazione.

Il ciclo di Krebs è quindi il nodo centrale del metabolismo cellulare.

Come arrivano i composti al ciclo?

Carboidrati

 Disaccaridi, vengono incanalati verso la formazione di glucosio quindi entra

 nella via glicolitica o altri zuccheri (maltosio, lattosio)

Glicogeno, composto di riserva, enzima per la demoliazione del glicogeno si

 chiama fosforoliasi (taglia una subunità di glucosio e lo va a fosforilare in

posizione 1)

Amido, diversi enzimi amilasi, glucoamilasi, glucosidasi, la scissione avviene in

 diversi modi. Da amidodestrine a maltosio a glucosio

Cellulosa

Aa: possono entrare in modi diversi, primo passaggio sempre deamminazione:

Alcuni vanno a dare acetil_CoA (acidi grassi, tirosina, triptofano, lisina,

 fenilalanina)

Altri (glutammina, glutammato, arginina, prolina) vanno a dare alfa-

 chetoglutarato

Altri entrano a livello del succinil_CoA (isoleucina, timina, metionina, valina,

 acidi grassi, triptofano, propionato)

A livello del fumarato (fenilalanina, tirosina)

 A livello del piruvato (cisteina, serina, lattato, alanina, carboidrati)

 A livello dell’ossalacetato (aspartato)

 Acidi grassi: dal trigliceridi si stacca glicerolo, gli acidi grassi subiscono

 un’ossidazione e ad ogni ciclo si staccano 2C sotto forma di acetil_CoA.

PSEUDOMONADALI

Gruppo molto rilevante. Sono dei bastoncini gram -, asporigeni, solitamente sono

mobili per flagelli polari singoli o multipli, la maggior parte sono aerobi stretti, in ogni

caso sono del tutto incapaci di fermentazione, non sono mai fermentanti, sono catalisi

e ossidasi positivi. Questo gruppo è interessante perché considerate le diverse specie

e i diversi generi nel loro insieme sono capaci di utilizzare centinaia di differenti

composti del C (organici). Molti di questi sono capaci di utilizzare come fonti di C e di

energia dei composti che utilizzano pochissimi microrganismi e nessun eucariote

(idrocarburi alifatici e aromatici) ed utilizzano anche alcuni xenobiotici (composti

sintetizzati dall’uomo la cui struttura non esiste in natura). Possono essere utilizzati

per risanare suoli o acque contaminate. Il gruppo è molto versatile perché ci sono

alcuni specie che possono comportarsi da chemiolitotrofi facoltativi (utilizzano come

fonte di energia un composto inorganico ridotto), alcune specie (poche) sono dei

denitrificanti (nitrato come accettore finale di una respirazione e lo convertono in

azoto molecolare). Tipicamente questo genere non utilizza il sistema delle

fosfotransferasi per l’ingresso del glucosio, utilizzano permeasi specifiche, utilizzano

per l’ossidazione del glucosio la via di E-D. il destino del piruvato prodotto verrà

ossidato ad acetil_CoA per degradarlo definitivamente, in questo caso la via è

preliminare al ciclo di Krebs.

Appartengono al gruppo dei proteobatteri (quelli che vengono suddivisi in alfa, β,

gamma), appartengono a sottogruppi diversi, ci sono dei generi diversi (pseudomonas,

commamonas, burkholderia, ralstonia). Tra gli pseudomonas ci sono molti

microrganismi che vivono nei suoli, alcuni possono comportarsi da patogeni per le

piante, molti sono dei saprofiti; pseudomonas aeruginosa -> patogeno opportunista

(possono causare problemi negli organismi debilitati), rilevante nelle infezioni

nosocomiali. Gli pseudomonas producono pigmenti fluorescenti che danno colorazione

tra il blu e il verde. Pseudomonas ambientali vivono intorno ai 30°C mentre

pseudomonas aeruginosa vive anche sopra i 30°C. burkholderia -> diversi patogeni

per animali e piante, causa la morva negli animali. Ralstonia -> comprende diversei

microrganismi patogeni per le piante.

Molti di questi microrganismi sono in grado di degradare gli idrocarburi, questi non

contengono ossigeno, non hanno gruppi funzionali, sono apolari, poco o per nulla

solubili in acqua, a temperatura ambiente sono molecole poco reattive. Tuttavia ci

sono diversi procarioti che sono capaci di utilizzare questi composti come unica fonte

di carbonio e di energia degradandoli fino a CO2 e H2O. Sia gli idrocarburi alifatici che

aromatici sono degradati in ambiente aerobico (degradazione decisamente efficiente

però richiede l’ingresso di ossigeno molecolare nella molecola per renderla reattiva) e

anaerobico (poco efficiente). Gli enzimi deputati all’introduzione di ossigeno

molecolare all’interno di una molecola sono chiamati ossigenasi, distinti in:

monoossigenasi e diossigenasi.

Monoossigenasi: uno dei due atomi di O viene ridotta ad H2O mentre l’altra arriva a

livello del substrato, a seconda del tipo di enzima si distinguono in: di gruppi alchilici

(ossigeno introdotto nel metile terminale convertendolo in OH), dell’anello aromatico

(ad esempio toluene, la posizione in cui viene introdotto l’ossigeno dipende dalla

specificità dell’enzima). Quando si ha la formazione di una composto del genere segue

la β-ossidazione perché si vanno a formare gli acidi grassi. Non lo fanno tutti i

microrganismi perché non tutti hanno le monoossigenasi. Quando si ha un anello

aromatico deve intervenire una seconda monoossigenasi

Diossigenasi: catalizzano l’incorporazione di entrambi gli atomi della molecola di

ossigeno sul substrato, due tipi: di attivazione dell’anello aromatico, ossidazione della

molecola di NADH i 2° vengono introdotti in posizione orto tra di loro, si perde

l’aromaticità dell’anello -> ci-diidrodiolo; di apertura dell’anello aromatico,

l’introduzione di ossigeno causa la rottura del legame tra i due carboni quindi la

rottura dell’anello aromatico. Queste due reazioni possono avvenire una dietro l’altra o

anche separatamente. Perché sono importanti queste reazioni? Perché gli idrocarburi

non avendo gruppi funzionali non si possono attaccare gli enzimi, l’introduzione di

ossigeno rende questi substrati più reattivi e poi li rende anche un po’ più solubili.

Il catecolo viene aperto con due modalità diverse: apertura intradiolo (tra i 2C che

portano il sostituente ossidrilico), apertura extradiolo (tra C che porta sostituente e C

adiacente non sostituito), entrambe le aperture sono catalizzate dalle diossigenasi di

apertura. Entrambi i composti che si ottengono entrano in vie che danno come

prodotti acetaldeide e piruvato o acetil_CoA e succinato. Tanti composti aromatici

differenti passano attraverso vie metaboliche periferiche che portano sempre ad un

intermedio (catecolo) -> strategia ad imbuto. Strategia molto comune perché molto

efficace, perché è più conveniente incanalare i composti in una sola via metabolica.

Il sistema in aerobiosi il modo per rendere biologicamente attive queste molecole è di

introdurre ossigeno, ossigeno molecolare e gli enzimi che introducono l’ossigeno sono

chiamati ossigenasi. Tipo di metabolismo che può avvenire esclusivamente in

ambiente aerobico. Possono introdurre o 1 ossigeno o 2 ossigeni e i substrati possono

essere idrocarburi alifatici, dove un metile viene convertito in gruppo alcolico e si

arriva poi alla formazione di un acido. Per i composti di tipo aromatico: devono essere

attivati o con due monoossigenazioni o con una diossigenazione, si forma il cis-

diidrodiolo, molecola poco stabile perché ha perso l’aromaticità, questa viene

ristabilita e si formano degli intermedi poi intervengono altre diossigenasi che aprono

l’anello (apertura in meta o apertura in orto). Alla fine del processamento di queste

molecole che diventano lineari si formano dei composti che entrano nel ciclo di Krebs.

Questi composti sono naturali perché sono dei derivati del petrolio. Alcuni di questi

microrganismi sanno utilizzare anche gli xenobiotici (composi di sintesi che hanno una

struttura che in natura non esiste). Com’è possibile che microrganismo sappia usare

un composto che in natura non esiste? La degradazione di uno xenobiotico è tanto più

probabile quanto la sua struttura è simile a quella di un composto presente in natura.

Microrganismi che riescono a degradare composti xenobiotici lo possono fare perché

gli enzimi coinvolti nella degradazione di quel substrato sono enzimi che hanno

specificità per il substrato rilassata. Quanto più è ristretta è la specificità dell’enzima

tanto sarà più difficile degradare. Gli enzimi coinvolti hanno specificità per il substrato

piuttosto ampia. Spiega perché è tanto facile degradare uno xenobiotico. È importante

perché i microrganismi possono svolgere un ruolo ecologico sia naturale sia perché

possono essere selezionati e specificatamente utilizzati per questo scopo.

Microrganismi che fanno un’ossidaizone incompleta: batteri acetici. Sono in grado di

processare, degradare composti come zuccheri (della frutta), etanolo (prodotto dalla

fermentazione dei lieviti) e sono in grado di ossidarli fino ad acido acetico. Sono due

gruppi: gluconobacter, sono subossidanti che si fermano alla produzione di acido

acetico, e gli acetobacter, sono superossidanti, trasformano fino ad acetato e poi lo

ossidano fino a CO2 e H2O. i subossidanti hanno il ciclo di Krebs che è incompleto,

mancano di alcuni enzimi, non riescono a terminare l’ossidazione.

[Panoramica respirazione aerobica]

I microrganismi chemioorganotrofi (ossidano composto organico per ricavarne energia)

molte volte sono eterotrofi (che utilizzano composto organico come fonte di C per le

biosintesi). Come si utilizza questa fonte di C per fare le biosintesi della cellula? Un

microrganismo per costruire le strutture cellulari ha bisogno di DNA, RNA, proteine

(strutturali ed enzimatiche), peptidoglicano, lipidi, polisaccaridi. Cosa serve per fare

queste cose? Servono i monomeri. Se sono presenti già preformati nell’ambiente in cui

cresce li preleva da lì. Ad esempio E. coli che vive in un terreno minimo dove ha solo il

glucosio come fonte di energia e di C, quindi deve ricavare tutto questo dal glucosio,

dobbiamo aggiungere fonte di azoto, di fosforo, di zolfo. Con uno zuccheri e alcuni

composti inorganici essenziali un microrganismo si può costruire. Come lo fa? Utilizza

una serie di molecole che sono definite precursori metabolici. Quali sono? Sono poche,

una dozzina: glucosio 1P, glucosio 6P, ribosio 5P, eritrosio 4P, PEP, piruvato,

3fofosglicerato, alfa-chetoglutarato, succinil_CoA, ossalacetato, diidrossiacetone

fosfato, acetil_CoC. Le vie metaboliche centrali servono non solo per l’ossidazione a

fini energetici ma anche per formare i precursori delle macromolecole. Il glucosio viene

catabolizzato e parte dei composti verranno ossidati completamente fino a CO2 per

trarre energia, altri verranno prelevati e utilizzato come scheletro carbonioso per le

biosintesi delle molecole cellulari. Sono via anaplerotiche. Gli eterotrofi trovano questi

composti dall’ossidazione del composto organico che gli è stato fornito, gli autotrofi se

li costruiscono ex novo. Esempio: dall’alfa-chetoglutarato si possono formare aa come

glutammato, anche dall’acetil_CoA. Sono delle vie interconnesse. Nel momento in cui

questi compsoti vengono sottratti ad una via sintetica devono essere rimpiazzati, i

sistemi con cui vengono rimpiazzati sono tatni, ma essenzialmente ci sono due

importanti reazioni anaplerotiche nella cellula: Riguardano la carbossilazione del

piruvato e del PEP a dare ossalacetato. Nel primo caso con spesa di ATP nel secondo

caso con spesa di legame ad alta energia.

Altro aspetto importante è il ciclo del gliossilato: è un ciclo che serve per rigenerare i

composti del ciclo di Krebs nel momento in cui un microrganismo cresce a spese gli

acidi grassi. Isocitrato subisce una scissione a dare succinato e gliossilato, questo

funge da accettore dell’acetil_CoA e va a formare L-malato.

BATTERI METOFILI

Sono dei microrganismi che usano composti a 1C e vengono suddivisi in:

Metanotrofi: in grado di utilizzare il metano come unica fonte di C e di energia,

 oltre ad altri composti 1C come il metanolo, sono metofili obbligati.

Appartengono tutti allo stesso phylum, sono dei proteobatteri, quindi Gram -

Metilotrofi: sono metofili facoltativi, sanno usare composti 1C come metanolo,

 acido formico, ma non sanno usare il metano. Appartengono a diversi phyla,

possono essere gram – o gram +

Qual è la difficoltà di questi microrganismi? Qual è la difficoltà di un microrganismo

che usa ad esempio etanolo? Deve ricostruire il legame carbonio-carbonio.

Degradazione di questi composti: perché i metilotrofi non sanno usare il metano?

Questo è l’idrocarburo alifatico più semplice, deve essere attivato con l’ossigeno

molecolare convertendolo in metanolo. I metilotrofi non possono utilizzare il metano

perché non hanno la metano monoossigenasi. I metanotrofi sono microaerofili, il

metano viene prodotto negli ambienti anaerobici, è un gas che tende a risalire verso la

parte aerobica, questi microrganismi devono avere accesso al loro substrato, ma

devono avere anche disponibilità di ossigeno. Dove possono stare quindi?

All’interfaccia tra ambienti aerobici e ambienti anaerobici, dove la concentrazione di

ossigeno è più bassa rispetto a quella dell’atmosfera; la reazione chiave è quella

catalizzata dalla metano monoossigenasi che sfruttano il potere riducente introduce

un atomo di ossigeno convertendo il metano in metanolo e riduce il secondo atomo di

ossigeno in acqua. Una volta che è stato prodotto il metanolo le reazioni degradative

sono semplici, sono delle ossidazioni progressive. Dove vanno a finire gli elettroni che

derivano da questi ossidazioni? Alla catena di trasporto degli elettroni in parte

attraverso il NAD. Cosa succede nei metilotrofi? Manca uno step, ma la via

degradativa è la stessa. Il composto che viene utilizzato per la sintesi del materiale

cellulare è l’aldeide. Che tipi di substrati usano? Utilizzano molti substrati differenti

purchè non abbiano legami diretti C-C, quindi metanolo, metilammina, dimetilammine

(ma non c’è un legame diretto C-C). Tipico esempio con uno spettro di substrati

piuttosto rilassato. La metano monoossigenasi è in grado di ossidare composti come

ammonio, etilene, clorometano, che però non vengono utilizzati per la crescita. Come

viene assimilata la formaldeide? In due modi:

Via del ribulosio monofosfato dove viene prodotta gliceraldeide 3P. utilizza come

 accettore della formaldeide il ribulosio 5P che accetta la formaldeide e viene

convertito in una molecola a 6C, da qui ci sono 3 molecole di formaldeide in

modo da formare complessivamente 3 molecole di fruttosio (2 6P e 1 1,6BP).

Una molecola di fruttosio viene scissa e dà la gliceraldeide quello che rimane

viene riarrangiato in modo da rigenerare le 3 molecole di ribulosio 5P.

complessivamente quello che si ottiene da 3 formaldeide e ATP è gliceraldeide

3P e ADP.

Via della serina dove viene prodotto acetato. Chiamata cosìperchè il primo

 accettore della formaldeide è la serina, questa viene convertita in

idrossipiruvato e poi segue una serie di riduzioni fino a dare PEP, poi

ossalacetato poi malato e qui c’è la scissione del malil_CoA in acetil_CoA che

viene dirottato verso le biosintesi e gliossilato che unito alla glicina va a dare la

serina. La reazione complessiva: 1 formaldeide, 1 CO2, 1 CoA-SH convertite in

acetil_CoA con l’utilizzo di 2NADH e 2ATP

Tutti questi microrganismi sono dotati di sistemi molto ampi di membrane interne, che

possono essere disposti come fasci di vescicole e queste vengono chiamate

membrane interne di tipo 1, oppure possono essere disposte come lamelle alla

periferia della cellula e sono chiamate membrane interne di tipo 2. Come mai ci sono

sistemi di membrane interne così sviluppati? Dal metano non ricavano tantissima

energia quindi hanno bisogno di consumare tanto substrato, hanno bisogno di tanti

sistemi respiratori quindi serve tanta membrana per contenere tutti i sistemi

respiratori. Confrontando le due reazioni qual è la via più efficiente? Quella del

ribulosio, consuma poco ATP e poco potere riducente.

Sono tutti proteobatteri che si dividono in gamma e alfa:

Alfa: membrane interne di tipo 2, utilizzano la via della serina e hanno ciclo

 Krebs completo

Gamma: membrane interne di tipo 1, utilizzano la via del ribulosio, hanno ciclo

 incompleto

Formano forme di quiescenza che possono essere cisti o esospore, forme di

quiescenza piuttosto resistenti all’essicamento (non come le endospore) e che sono

forme di quiescenza piuttosto comuni tra tutti i microrganismi che vivono nel suolo.

Molti di questi batteri sono anche degli azotofissatori (utilizzano l’azoto molecolare

come fonte di N per le biosintesi, per produrre aa e basi azotate).

Eterotrofi: chemiorganotrofi e chemiolitotrofi. Batteri che sono chemiolitorofi

sono parecchi.

Proteobatteri chemiolitoautotrofi aerobi: batterio che usa composto inorganico per

ricavare energia ha bisogno anche di C per le biosintesi, assimilano la CO2, fanno

anche respirazione aerobica (accettore finale elettroni è l’ossigeno) di un composto

inorganico. Utilizzano il ciclo di Calvin, sono necessarie delle elevate quantità di ATP e

di potere riducente.

Che tipo di composti usano? Utilizzano tanti composti diversi:

Nitrificanti -> composti dell’azoto, si distinguono in ammonio ossidanti e nitrito

 ossidanti (ossidano nitrito fino a nitrato)

Solfobatteri incolori -> utilizzano diversi composti dello zolfo

 2+ 3+

Ferrobatteri -> da F a Fe

 Idrogenobatteri

 Carbossidobatteri

Sono degli aerobi, alcune specie possono comportarsi da denitrificanti, quindi in

mancanza di ossigeno usano come accettore finale di elettroni il nitrato. Potenziale

4+ 2- +

ossigeno = + 0.82 V. Potenziale NH /NO = + 0.34 V. Potenziale NAD /NADH = - 0.32

V. Gli elettroni strappati dall’ammonio non possono entrare nella catena con NADH

perché i potenziali non sono compatibili, gli elettroni possono andare da potenziale più

negativo a potenziale più positivo, quindi dovranno entrare ad un livello più basso

della catena di trasporto -> ci sarà minor energia nella cellula. Se dall’ossidazione del

composto non viene prodotto NADH (visto che i potenziali non sono compatibili), se

usano il ciclo di Calvin come fanno? Hanno il problema di procurarsi il potere

riducente. Per formare il potere riducente che gli serve devono utilizzare un trucco ->

gli elettroni entrano ad esempio nel citocromo c o citocromo a, come faccio ad avere

NADH? Devo far fluire gli elettroni contro gradiente quindi deve essere spesa

dell’energia. Quanta biomassa ci si aspetta che producano e quanto substrato usano?

Usano tanto substrato e producono poca biomassa. Sfruttano substrati che altri

microrganismi non sono in grado di sfruttare. Svolgono anche un ruolo ecologico

fondamentale nei cicli biogeochimici degli elementi. (Spingono elettroni contro

gradiente -> trasporto inverso di elettroni -> sono poco efficienti dal punto di vista

energetico. Sono mantenuti perché utilizzano substrati che non utilizzano altri, sono

importanti nei cicli biogeochimici dell’ambiente)

BATTERI NITRIFICANTI

Due gruppi:

Ammonio ossidanti, donatore di elettroni = ammonio, accettore di elettroni =

 4+ 2- +

ossigeno, NH + 1/2 O -> NO + 2H + H O, hanno un metabolismo acidificante

2 2

perché si produce acqua ma anche idrogenioni, nome = nitroso-, 2+

Nitrito ossidanti, nome = nitro-, il metabolismo non è acidificante, NO + ½ O

 2

3-

-> NO

Questi microrganismi vivono associati, il nitrito in ambiente acquoso dà molto

facilmente l’acido nitroso che è un mutagene che è tossico, quindi gli ammonio

ossidanti hanno qualcuno che allontana un composto tossico in ambiente acquoso.

Questi batteri sono importanti insieme ai batteri denitrificanti per depurare le acque

reflue dai composti azotati.

Ammonio ossidanti: il primo enzima che interviene è un’ammonio monoossigenasi,

aggiunge un atomo di ossigeno ad ammonio mentre l’altro viene ridotto ad acqua e

produce l’idrossilamina -> viene ossidata, enzima HAO, da questa ossidazione con

produzione di nitrito vengono prodotti 5 protoni e 4 elettroni. 5 protoni acidificano

l’ambiente esterno. 4 elettroni: accettati da un citocromo c, 2 vengono portati verso

l’ossigeno tramite il citocromo a (estrusione di protoni), gli altri 2 vengono ceduti

all’ammonio monoossigenasi come potere riducente per farla funzionare. Di

conseguenza l’efficienza di questo metabolismo è veramente molto bassa perché di

fatto per ogni molecola di ammonio ossidata si recuperano solo 2 elettroni. Sono

batteri che ossidano tantissimo substrato e producono quantità di biomassa

veramente esigue.

Nitrito ossidanti: la reazione è nitrito + acqua, viene ossidato a nitrato.

Trasferimento elettroni fino a citocromo, estrusione di protoni, sistema semplice.

(QUESTA PARTE LA CHIEDE)

Dove si trovano? Suoli, acque dolci o marine, reflui urbani, vivono in associazione,

hanno ruolo importante nel ciclo dell’azoto, caratterizzati da numerose introflessioni

della membrana -> o appiattite o come lamelle alla periferia. Come mai hanno così

tante membrane? Consumare tanto substrato per produrre quella poco energia che

serve.

Solfobatteri

Possono utilizzare diversi tipi di composti dello zolfo: idrogeno solforato e lo possono

ossidare fino a solfato o in alcuni microrganismi questa ossidazione avviene in due

tappe -> prima si produce e si conserva zolfo elementare e poi viene ossidato fino a

solfato. Utilizzano anche composti parzialmente ossidati: bisolfito. Alcuni metabolismi

sono acidificanti. A che livello entrano questi composti nella catena di trasporto degli

elettroni? Dipende dal tipo di composto che prendiamo in considerazione: H2S entrano

a livello delle flavoproteine, producono una maggiore energia rispetto a quelli che

entrano a livello del citocromo c. Potere riducente prodotto mediante il trasporto

inverso degli elettroni. Producono poca biomassa.

Appartengono a generi differenti e alcuni sono chemiolitotrofi obbligati, incapaci di

crescere su terreni che contengono composti inorganici. Alcuni sono fortemente

acidofili. Sono aerobi, ma alcune specie possono comportarsi da denitrificanti. Ci sono

altri generi che utilizzano composti parzialmente ossidati dello zolfo, sono dei

facoltativi quindi crescono bene sui composti organici. Un gruppo di batteri sono

definiti filamentosi prima accumulano lo zolfo elementare e poi lo ossidano. Oltre ad

avere le ossidazioni in due tappe possono comportarsi da mixotrofi: hanno un

metabolismo energetico da chemiolitotrofo, ma se c’è disponibilità di composti

organici invece di assimilare CO utilizzano i composti organici per le biosintesi

2

cellulari. I corpi di inclusioni sono dei carbossisomi (corpi di inclusione costituite da

forme cristalline della rubisco), nei thiobacillus.

Idrogenobatteri (facoltativi)

Utilizzano come donatore di elettroni l’idrogeno molecolare e lo riducono ad acqua e

sono chemiolitotrofi facoltativi. Il tipo di metabolismo di questi microrganismi dipende

dagli enzimi di cui sono dotati, perché alcuni di questi sono dotati di due tipi di

idrogenasi:

Idrogenasi (Ni) di membrana e solubili, utilizzano il primo enzima a scopi energetici

+

(ossidazione per produzione di energia), mentre il secondo per la riduzione di NAD

Solo idrogenasi di membrana, hanno problema di approvvigionamento di potere

riducente, se hanno bisogno di potere riducente in quantità utilizzano un trasporto

inverso di elettroni o molti di questi si comportano come organismi mixotrofi, possono

essere gram negativi (paracoccus denitrificans, acidovorax) o gram positivi (bacillus)

L’idrogeno è l’unico con potenziale d’ossidoriduzione compatibile con quello della

+ +

coppia NAD /NADH. L’idrogeno può ridurre il NAD mentre gli altri substrati no.

2 tipi di idrogenasi: idrogenasi di membrana per far fluire elettroni nella catena di

trasporto, idrogenasi solubile deputata a riduzione del NAD.

Ferrobatteri, sono aerobi

2+

2 Fe + ½ O2 + 2H+ -> 2Fe 3+ + H2O

Due gruppi:

Acidofili, a pH acido: acidithiobacillus ferrooxidans

 A pH neutro: Gallionella ferruginea (no flagello, prosteca), Sphaerotilus natans

 (cellule singole chiuse in una guaina)

Fe2+ rimane bene in soluzione in pH acido, mentre a pH neutro è molto instabile, a

contatto con l’ossigeno tende ad ossidare. I microrganismi che sono capaci di ossidare

il ferro (i secondi) hanno la caratteristica di essere prevalentemente microaerofili

(perché altrimenti il ferro precipiterebbe). Questi microrganismi presentano delle

incrostazioni con il caratteristico colore della ruggine. Alcuni di questi sfruttano (a pH

neutro) un gradiente protonico transmembrana che è dovuto più all’ambiente che non

all’ossidazione del substrato; alcuni sono capaci di trasferire elettroni a un accettore

che non è l’ossigeno creando una sorta di corrente, per cui alcuni di questi possono

essere utilizzati per creare una corrente elettrica -> cella a combustibile.

Carbossidobatteri

Sono facoltativi, usano come donatore di elettroni il monossido di carbonio che

ossidano a CO2, l’enzima è il monossido di carbonio deidrogenasi. Esempi

Pseudomonas carboxydovorans, bacillus, arthrobacter.

I chemiolitotrofi per assimilare CO2 utilizzano il ciclo di Calvin in questo ciclo ci sono

3fasi:

Fissazione della CO2, ove intervengono 6 molecole di ribulosio 1,5 difosfato e questo è

l’accettore della CO2, accettano 6 CO2

Formazione di 12 molecole di 3 fosfoglicerato, da questo si segue la via glicolitica in

senso inverso fino a produrre 12 molecole di gliceraldeide 3P. Qui vengono chiesti ATP

e potere riducente.

Di queste 12 molecole -> 2 utilizzate per produrre fruttosio, le altre 10 vengono

riarrangiate per rigenerare le 6 molecole di ribulosio 5 fosfato.

Complessivamente vengono consumate 12 NADPH e 12 + 6 ATP -> quindi la resa

energetica è molto scarsa.

RESPIRAZIONE ANAEROBICA

È una respirazione in cui il donatore di elettroni può essere un composto organico o

inorganico (dipende dal microrganismo), ma l’accettore finale di elettroni è un

composto diverso dall’ossigeno. Ci sono tantissimi composti che possono fungere da

accettore, sia organici (quello più usato è il fumarato) che inorganici.

Denitrificazione, dove l’accettore di elettroni è il nitrato che viene ridotto fino ad

 azoto molecolare, accettando 10 elettroni con l’intervento di 12 protoni. È un

processo alternativo alla respirazione aerobica, questi microrganismi sono tutti

anaerobi facoltativi (+ acqua)

Desulfuricazione, l’accettore è il solfato e può accettare 8 elettroni e il prodotto

 finale è H2S (+ acqua)

Metanogenesi, metabolismo presente esclusivamente negli

 Archaeametanogeni, l’accettore è la CO2, che con l’intervento di 8 elettroni e 8

protoni viene ridotta a metano (+ acqua)

Omoacetogenesi, l’accettore è la CO2, ma il prodotto finale del metabolismo è

 acetato, non sono Archaea, producono acetato come prodotto di scarto del

metabolismo energetico

Gli ultimi 3 sono anaerobi stressi, obbligati.

Potenziali di ossidoriduzione:

Coppia ossigeno/acqua ha potenziale più positivo

 Tutte le altre hanno potenziale che è via via meno positivo

Resa energetica: più bassa, a parità d substrato, della respirazione aerobica, perché il

delta di potenziale tra il donatore e l’accettore di elettroni è sempre più basso di quello

che si ha con l’ossigeno.

Denitrificazione

Processo alternativo alla respirazione aerobica, servono enzimi associati alla

membrana che sono deputati a scaricare gli elettroni sul nitrato. La reazione

complessiva dice che 2 nitrato riescono ad accettare 10 elettroni e danno azoto

molecolare e 6 molecole di acqua. Questa reazione avviene a steps. Servono una serie

di enzimi che servono nei diversi steps: nitrato reduttasi, nitrito reduttasi, NO

reduttasi, nitroso ossido reduttasi. Gli enzimi vengono repressi in presenza di ossigeno,

se non c’è l’ossigeno è conveniente produrre questi enzimi per continuare

respirazione. I prodotti (ossido nitrico, ossido nitroso, azoto molecolare) sono gas che

vengono dispersi in atmosfera. Processo chiamato anche riduzione dissimilativa del

nitrato: perché il nitrato può essere utilizzato come fonte di azoto per i processi

biosintetici e anche in quel caso deve essere ridotto. I due metabolismi hanno scopi

differenti infatti gli enzimi sono diversi. In questo caso utilizziamo il termine dissilativo

per indicare il fatto che i prodotti finali del metabolismo non vengono utilizzati dalla

cellula, per la cellula sono prodotti di scarto che vengono riversati nell’ambiente ed

eliminati.

Ci sono diversi microrganismi che utilizzano il nitrato come accettore finale di elettroni:

come E. coli, ma vengono definiti denitrificanti solo gli organismi che riducono il nitrato

fino ad azoto molecolare.

Quali sono i batteri in grado di fare la denitrificazione? Batteri fotosintetici,

chemioautotrofi, metofili, gram negativi che respirano, scivolanti, gram positivi

(sporigeni, gruppo degli attinomiceti, anaerobi).

Desulfuricazione o riduzione dissimilativa del solfato

Metabolismo dove gli elettroni vengono scaricati sul solfato

SO4- + 9e- +10H+ -> H2S + 4H20

Il solfato è un composto molto stabile per cui per poter accettare elettroni deve essere

attivato e viene attivato legandolo, sfruttando ATP, tramite ATP solforilasi e viene

prodotta adenosina 5 fosfosolfato, equivale a spendere due legami ad alta energia per

attivare il solfato. Solo a questo punto il solfato può essere utilizzato e anche in questo

caso abbiamo una serie di riduzioni progressive: nella prima si forma solfito e si libera

AMP e si utilizzano 2 elettroni, poi interviene solfito reduttasi che riduce il solfito ad

H2S accettando 6 elettroni 2 per volta, l’H2S così prodotto viene liberato

nell’ambiente. Che tipo di substrati usano? Possono utilizzare dei composti organici

semplici (lattato, piruvato, acetato) che sono i prodotti finali di metabolismi di altri

microrganismi o possono comportarsi da litotrofi ossidando l’idrogeno molecolare. Con

enzimi associati alla membrana possono ossidare il lattato a piruvato (ricavano

idrogenioni) o possono ossidare l’idrogeno molecolare, gli elettroni derivanti

dall’ossidazione vengono scaricati sull’APS. Come si genera l’energia? Il sistema fa sì

che si formi un gradiente protonico transmembrana. Quali sono questi batteri? Sono

proteobatteri (gamma) e sono divisi in due gruppi a seconda che sappiano o non

sappiano ossidare l’acetato:

Gruppo I, non ossidano acetato, utilizzano come donatore di elettroni lattato,

 piruvato e idrogeno

Gruppo II, ossidano l’acetato e per ossidarlo usano per lo più la via metabolica

 dell’acetil_CoA, possono utilizzare come accettore l’acetato, acidi grassi e

idrogeno molecolare

Tutti usano il solfato come accettore finale, pochissimi possono usare lo zolfo

elementare (in realtà usato di più dagli Archaea). Dove li troviamo? Sono anerobi

stretti quindi ambiente anaerobico, si trovano nei sedimenti lacustri e nei sedimenti

marini. La produzione di idrogeno solforato (questo è un composto tossico) può essere

dannosa per organismi circostanti se in quantità elevate. Utilizzano per l’ossidazione

dell’acetato non il ciclo di Krebs, però usano la via dell’acetil_CoA -> serve sia per

l’ossidazione dell’acetato che per la sua sintesi. Questa via è fatta da due rami

(sintesi):

Nel primo ramo si ha la riduzione della CO2 a gruppo metilico e per questo

 passaggio servono dell’idrogeno molecolare (funge da donatore di elettroni),

ATP e serve come coenzima il formil tetraidrofolato (THF), il gruppo formile

viene ridotto a gruppo metile che funge da trasportatore di gruppi C1, il metile

viene ceduto alla vitamina B12 e si forma la metilcobalamina.

Nel secondo ramo la CO2 viene ridotta a gruppo carbonilico e l’enzima coinvolto

 è una monossido di carbonio deidrogenasi (enzima che contiene ferro e nichel).

La CO2 si lega al ferro come CO e libera molecola di acqua. Si ha quindi

l’enzima Fe-CO, a questo punto la B12 cede il gruppo metilico sul nichel e

l’enzima catalizza la reazione e lega il carbonile al metile.

Abbiamo i due mattoni: gruppo metilico legato alla B12 e gruppo carbossilico legato

alla monossido di carbonio deidrogenasi -> CH3 viene ceduto al sistema enzimatico,

entra coenzima A, avviene il legame e si forma acetil_CoA. Il legame con coenzima A è

un legame altamente energetico e viene sfruttato per la formazione di ATP con

liberazione di acetato. Questa via può essere percorsa sia per andare a formare

acetato sia nel senso inverso per ossidare l’acetato che dovrà essere attivato. Il

percorso in senso inverso è quello che usano la maggior parte dei desulfuricanti capaci

di ossidare l’acetato. Quand’è che la via viene percorsa nel senso di sintesi? In diverse

occasioni dagli omoacetogeni che producono come prodotto finale l’acetato che è un

prodotto di scarto.

Acetogenesi

Da chi è utilizzata questa via? Da un certo numero di microrganismi tutti anaerobi

stretti e appartenenti a generi diversi (Acetobacterium woodi, Clostridium aceticum).

Dove viene prodotta l’energia durante l’omoacetogenesi? Viene prodotta da acetil_CoA

ad acetato con la fosforilazione a livello del substrato, nei passaggi che portano alla

formazione di acetil_CoA si forma una forza sodio motric, gradiente di sodio sfruttato

per la sintesi di ATP. Questi batteri quando utilizzano idrogeno e CO2 (respirazione

anerobica), ma possono comportarsi anche da chemiorganotrofi perché fermentano il

glucosio. Il glucosio segue la via glicolitica di HM fino a produrre 2 piruvato e 4 protoni,

il piruvato viene decarbossilato a dare acetato, 2 CO2 e 4 H+, le 2 C02 e i 4H+

vengono indirizzati alla via dell’acetil_CoA e producono un’ulteriore molecola di

acetato. Quindi la reazione netta è che da una molecola di glucosio si formano 3

molecole di acido acetico (sempre prodotto di scarto del metabolismo energetico).

Oltre all’energia recuperata dalla sintesi di acetil_CoA c’è anche un po’ di energia

derivante dalla via glicolitica. La via dell’acetil_CoA è molto utilizzata sia a scopo

energetico che a scopo biosintetico. A scopo energetico: in questo caso viene

sintetizzato acetil_CoA dai batteri omoacetogeni, in alcuni casi l’acetato viene ossidato

a scopo energetico (solfato riduttori), ma questo avviene anche in alcuni metanogeni

che sono i cosiddetti metanogeni acetotrofici, che dall’acetato producono CO2 e

metano. Tutti questi microrganismi hanno anche bisogno di carbonio per biosintesi,

che cosa producono? Utilizzano l’acetato come carbonio per le biosintesi, quindi

questa via viene utilizzata a scopo biosintetico.

Ci sono diversi microrganismi che posso utilizzare il Fe3+ come accettore finale di

elettroni per la respirazione.

Tutti questi microrganismi hanno una catena di trasporto degli elettroni (con

componenti che possono variare). L’ultimo gruppo di microrganismi che fanno

respirazione anaerobica sono gli archaea metanogeni, sono gli unici capaci di produrre

metano, sono molto particolari perché non hanno una catena di trasporto degli

elettroni come gli altri. Due gruppi (Euryarchaeota e Crenarchaeota) sono molto

studiati, mentre i Korarchaeota non sono stati coltivati, sono stati ipotizzati estraendo

DNA dal campioni ambientali. Gli archaea metanogeni sono tra gli Eryarchaeota, tra i

metanogeni ci sono dei termofili, degli alofili, è un gruppo molto vasto, non è un

gruppo dal punto di vista delle caratteristiche fisiologiche non è un gruppo ristretto ->

gli accumuna il fatto che sono tutti anaerobi stretti e sono in grado di produrre

metano, sono molto sensibili all’ossigeno. Habitat:

Sedimenti anossici: paludi, acquitrini, sedimenti di laghi, risaie, discariche

 umide

Tratto digestivo di vari animali: rumine di bovini e ovini, erbivori cecali

 (coniglio), intestino crasso di animali monogastrici (uomo, maiale, cane),

intestino tenue di insetti cellulosolitici (termiti)

Sorgenti geotermali

 Digestori anaerobici, grandi silos che servono per smaltimento di reflui ricchi di

 composti organici

Endosimbionti di vari protozoi

Utilizzano per la metanogenesi (per loro è un processo energetico) diversi tipi di

substrati:

Tipo CO2, sono la CO2 il monossido di carbonio e il formiato (quelli più ossidati)

 4H2+CO2->CH4+2H2O

Tipo metilico, metanolo e serie di composti con gruppo metilico legato ad altro

 Acetaclastici, acetato e piruvato (in alcuni casi)

I metanogeni presentano degli enzimi che esistono solo in questo particolare

gruppo di Archaea. Come sistema modello quelli che utilizzano CO2.

Ci sono gruppi di coenzimi che trasportano solo C1: hanno formule complesse, sono

il metano forano, metano pterina, coenzima M e coenzima F430 (contiene un

atomo di Ni, che è un micronutriente essenziale). Poi ci sono coenzimi coinvolti

nelle reazioni di ossidoriduzione: coenzima F420 e coenzima B. come avviene la

riduzione di CO2 a metano? Primo enzima che interviene è il metano furano che

lega CO2 e la riduce a gruppo formilico. Il gruppo formile viene ceduto alla metano

pterina e subisce due riduzioni progressive prima a metilene e poi a metile (CH2-

>CH3), sempre rimanendo legati alla metano pterina. Il metile viene ceduto al

coenzima M e nell’ultima riduzione da metile a metano il coenzima M si lega al

coenzima B e questa è una delle reazioni coinvolte nella produzione di energia. I

due coenzimi vengono scissi. Da dove deriva il potere riducente? Deriva dall’

ossidazione F420 che a sua volta è stato ridotto per ossidazione dell’idrogeno

molecolare. L’ultimo passaggio di riduzione coinvolge il coenzima F430. Anche in

questi microrganismi la conservazione dell’energia avviene perché si crea un

gradiente protonico transmembrana (si crea anche un gradiente di sodio

transmembrana). Come avviene? Riduzione del F420, interviene un altro coenzima

(tutto nella membrana) che è la metano fenazina, nel passaggio degli elettroni da

questa al citocromo c c’è anche un’estrusione di elettroni. Gli elettroni vengono

ceduti alla eterodisolfuro reduttasi che ha il compito di scindere il complesso

coenzima M-B, questa scissione avviene utilizzando dell’acqua e il risultato è che la

parte interna della membrana (si liberano due OH-) si carica negativamente,

aumentando la differenza di potenziale tra interno ed esterno. Come in tutte le

respirazioni ‘ATP viene prodotto per rientro di elettroni tramite l’ATPasi di

membrana. Il coenzima F420 dà fluorescenza. Cosa cambia con le altre

ossidazioni? La CO2 rimane legata ai coenzimi fino alla fine della riduzione, il

meccanismo in generale è sempre lo stesso della conservazione energia che

troviamo in una normale respirazione. Quando un metanogeno cresce ossidando

l’idrogeno molecolare, ha il problema dell’approvvigionamento di carbonio, perché

si sta comportando da chemiolitotrofo (Ossida un composto inorganico). Come

avviene l’assimilazione di carbonio nei metanogeni che usano questo

metabolismo? Avviene sfruttando la via del coenzima A. in questo caso il gruppo

metilico può derivare direttamente dalle reazioni tipiche della metanogenesi. Nella

via è attivo il ramo carbonilico, nella monossido di carbonio deidrogenasi è

presente il Ni. Da questa via abbiamo la sintesi di acetato. Regolazioni di tipo

allosterico perché sono enzimi di tipo costitutivo, quindi serve una regolazione che

regoli l’attivi enzimatica stessa. Cosa succede quando viene utilizzato come

substrato non l’idrogeno, ma il metanolo o l’acetato? Metanolo: H2+CH3OH-

>CH4+H2O, donatore è l’idrogeno e l’accettore è il metanolo, prodotto finale della

respirazione è CH4; la seconda reazione è 4CH3OH -> 3CH4 + CO2 + 2H2O, il

metanolo è sia accettore sia donatore di elettroni, una molecola viene ossidata fino

a CO2. Acetato: CH3COO- + H20 -> CH4 + HCO3-, in questo caso il metile viene

ridotto a CH4 e il carbossile viene ridotto a bicarbonato. Come avvengono le

reazioni? Il metanolo viene legato ad una proteina particolare, viene utilizzato

potere riducente per ridurre metanolo a metano, seguendo le reazioni della

metanogenesi, il potere riducente viene generato dall’ossidazione del metanolo a

CO2. Se necessario parte della CO2 viene convogliata verso la via dall’acetil_CoA

per biosintesi. Qualcosa di simili avviene nei metanogeni che usano l’acetato:

primo passaggio è un’attivazione, viene consumata ATP, da qui si forma acetil_CoA

che può essere utilizzato direttamente per biosintesi se è necessario oppure

seguendo a ritroso la via dell’acetil_CoA la molecola viene spezzata (monossido di

carbonio deidrogenasi, dove rimane legato il gruppo COO-, da questo si produce

CO2 e potere riducente), mentre il gruppo metilico tramite questa proteina

particolare viene ceduto al coenzima M e funge da accettore degli elettroni

generato ed è ridotto fino a metano. In conclusione, una molecola come il metanolo

può fungere sia da donatore che da accettore, quindi parte di questo composto

viene ossidato e parte ridotto; nel caso dell’acetato i due gruppi che compongono

questa molecola uno viene ossidato e uno viene ridotto. Chi sono gli Archaea

metanogeni? Vengono divisi in diverse famiglie, si chiama tutti metageno-etc, le

morfologie sono le più varie. Più interessante è il tipo di substrato: la maggior parte

dei metanogeni utilizzano idrogeno e CO2 e/o formiato. Quelli che utilizzano

composti diversi (metanolo, acetato) appartengono a questa famiglia che è quella

delle metanosarcinales, l’acetato è utilizzato in particolare dal metanosaeta. Sono

presenti anche ipertermofili tra i metanogeni e ci sono anche degli alofili.

ARCHAEA

Il ramo degli Archaea si biforca in due rami principali: euryarchaeota e

crenarchaeota. Si suppone che esistano anche i Korarcheaota. Tra gli euryarchaeota

troviamo i metanogeni, alcuni ipertermofili, termoplasma (termofilo e privo di

parete), halobacterium, halococcus, natronococcus (questi 3 sono alofili),

microrganismi marini. Tra i crenarchaeota troviamo termofili, ipertermofili, molti dei

quali utilizzano diversi tipi di composti dello zolfo nel loro metabolismo e dei

crenarchaeota marini, che sono psicrofili.

Caratteristiche generali Archaea:

Non hanno mai peptidoglicano nella parete, quindi può essere composta da

 eteropolisaccaridi, proteine o glicoproteine o da pseudomureina (costituita

da filamente di aminozuccheri come N-acetilglicosamina e con legame β1,3

che è insensibile all’azione dell’isozima), tutti gli aa che compongono questa

parte sono tutti L.

La membrana ha un’architettura bistratificata o monostratificata (sempre

 glicerolo che compone le due facce esterne, la parte idrofobica è composta

da fitano o bifitano che sono degli idrocarburi isoprenoidi quindi sono

ramificati e legati con un legame etere)

Ribosomi 70S, il pattern assomiglia molto di più a quelli degli Eucarya

 RNA polimerasi complessa (circa 10 subunità), [Guarda RNA polimerasi di

 Eucarya e di Bacteria], gli Archaea hanno una sola RNA polimerasi,

complessa, molto differente da quella dei Bacteria

Fattori di allungamento nella sintesi proteica più simili a Eucarya

 tRNA d’inizio: metionil-tRNA

 Diversa sensibilità agli antibiotici. Ci sono diversi antibiotici che agiscono ad

 esempio sulla sintesi proteica in diverse reazioni relative alla sintesi,

riconoscendo proteine particolari dei ribosomi. Se questa proteina ha negli

Archaea una sequenza aminoacidica diversa da quella presente nei batteri

l’antibiotico non può agire. Tutti gli antibiotici sugli Archaea non hanno

effetto, quindi gli Archaea sono intrinsecamente resistenti agli antibiotici,

non hanno il bersaglio.

Da un punto di vista molecolare sono più simili agli Eucarya.

ALOFILI

Vivono in ambiente ipersalini e richiedono (hanno necessità per vivere) di una

concentrazione di NaCl 1.5M (9%) e possono vivere fino a 5.5M (massima

saturazione), possono vivere nei laghi e nelle saline, dove molto spesso danno un

colore rosa intenso-rosso dovuto ai pigmenti che possono produrre. Li possiamo

suddividere:

Alofili estremi, alo-

 Aloalcalofili, oltre ad essere alofili sono anche alcalofli.

Dal punto di vista metabolico sono aerobi e chemiorganotrofi (utilizzano sostanza

organica) e fanno parte di una catena trofica molto breve composta da organismi

alofili (alghe o piccoli crostacei). Dal punto di vista morfologico, la morfologia è

molto vasta (bastoncelli, dischi piatti, dischi irregolari, sferoidi); si trovano dove c’è

un’elevata concentrazione di sale (laghi salati, Mar Morti, suoli con elevata

concentrazione salina), gli aloalcalofli (natro-) si trovano nei laghi con elevata

concentrazione salina, ma di composti basici -> laghi alcalini. Sono associati anche

al pellame, anche sugli alimenti conservati sotto sale (possono formare colonie che

macchia l’alimento). Questi microrganismi sono interessanti per il loro adattamento

all’ambiente che è difficoltoso per altri organismi: gli adattamenti possono essere

di tipo diverso, ma sono principalmente basati su soluti compatibili. Come modello

è stato preso Halobacterium che accumula ioni potassio come soluto compatibile

(5.3M), ha bisogno di sodio per stabilizzare le proteine della parete, perché queste

proteine sono molto ricche di aa acidi, quindi per stabilizzare ha bisogno di un

contro-ione che è il sodio. Il potassio è utile per la stabilità dei cromosomi. Alcuni d

questi sono in grado di accumulare dei pigmenti che vanno dal rosa intenso al

rosso, questi pigmenti sono un sistema di sopravvivenza, vengono accumulati nella

membrana (viene chiamata membrana purpurea) e il pigmento principale

(accumulano anche carotenoidi che proteggono dalle radiazioni luminose piuttosto

intense) è una batteriorodopsina, è una proteina, il pigmento è il retinale che esiste

in due conformazioni: cis e trans. Nel momento in cui la conformazione trans viene

colpita da una radiazione luminosa può passare alla conformazione cis e tornando

poi alla conformazione trans (più stabile) estrude un protone, quindi funziona come

una pompa protonica azionata dalla luce, crea un gradiente protonico

transmembrana che può venire sfruttato per la produzione di ATP. Il sistema però è

molto poco efficiente quindi riesce a produrre una quantità di ATP appena

sufficiente per mantenere l metabolismo basale della cellula, in effetti è un sistema

di emergenza; halobacterium è un batterio chemiorganotrofo aerobio, l’ambiente in

cui vive può andare incontro a carenza di ossigeno. Il microrganismo non ha

ossigeno sufficiente e utilizza questo sistema come un sistema di emergenza, in

effetti la batteriorodopsina viene prodotta quando l’ossigeno è limitante.

IPERTERMOFILI

Tipo terrestre: si trovano nelle solfatare, negli impianti geotermici, zone profonde

della crosta terrestre (anche fino a 300metri al di sotto della superficie terrestre).

Tipo marino: sorgenti calde sottomarine, sedimenti caldi (fumarole nere), depositi

combustibili. Quindi vivono in ambienti dove la temperatura può superare anche i

100°C. Ci sono crenarchaeota che vivono anche nelle acque fredde, zone dove la

temperatura media non supera i 4°C. Tutti quelli marini sono anche alofili.

Si possono suddividere in due grandi gruppi:

Isolati da ambiente vulcanici terrestri, temperature minime intorno ai 60°C,

 temperature massime sono di qualche grado inferiore ai 100°C e le

temperature ottimali si aggirano intorno ai 90°C

Isolati da ambienti vulcanici sottomarini, le temperature minime qualche

 decina superiore a quelle terrestri, le temperature massime possono

superare anche il punto di ebollizione dell’acqua, le temperature ottimali

sono più elevate di quelle terrestri

Ad elevate temperature c’è anche una rotture meccanica delle cellule (bolle dei

gas, come quando l’acqua bolle); nelle acque sottomarine c’è la pressione

idrostatica, la pressione aumenta di 1atm ogni 10 metri di profondità, questi i fluidi

che escono (molto ricchi in minerali) a causa della pressione idrostatica si

immettono nell’acqua marina senza giungere ad ebollizione. Il pyrodictium è quello

che vive a temperature più alte (115°C). Il pH ottimale di quelli sottomarini è vicino

alla neutralità, quelli terrestri alcuni hanno pH ottimale che è vicino alla neutralità o

leggermente acido, gli altri hanno il pH estremamente acido. Adattamenti alle alte

temperature: membrana più resistente (monostratificata con tetraedro del

glicerolo, rende la membrana più rigida), le proteine non si devono denaturare con

la temperatura quindi devono essere proteina con estrema termoresistenza, DNA il

tipo di struttura in cui viene compattato e le proteine alle quali questo è associato

lo rendono puù termoresistente. Metabolismo:

Chemiorganotrofi

 Chemiolitotrofi

Si distinguono in aerobi, anaerobi e fermentatori (chi usa composti organici). Quelli

che fanno respirazione aerobia cosa usano come accettore finale di elettroni

(nitrati, Fe3+, ossigeno quelli aerobi, solfati), come donatori (idrogeno, zolfo,

composti del ferro).

Potenzialità biotecnologiche

Metanogeni, produttori di metano, vengono utilizzati negli impianti reflui

 zootecnici e industriali

Ipertermofili, produzione di enzimi resistenti alle alte temperature, alcuni

 enzimi come pfu polimerasi resiste a temperature molto alte (più alte della

Taq polimerasi), questo enzima è dotato di attività di correzione di bozze

(utilizzato per garantire la correttezza dell’amplificato).

FOTOTROFI

Utilizzano la luce come fonte di energia. Tra i fototrofi distinguiamo dei gruppi in base

al tipo di carbonio che usano per biosintesi:

Fotoautotrofi, usano CO2

 Fotoeterotrofi, usano carbonio organico

Due tipi di fotosintesi:

Fotosintesi ossigenica, producono ossigeno. Stesso tipo di fotosintesi attuata

 anche dalle piante, i cianobatteri (alghe verdi-azzurre) hanno questo tipo di

metabolismo. Può avvenire grazie alla presenza di due fotosistemi: fotosistema

deputato alla fotolisi dell’acqua, responsabile della produzione del potere

riducente e tramite il passaggio degli elettroni attraverso due fotosistemi si

genera anche un gradiente protonico transmembrana per produrre ATP. Quindi

si producono sia ATP che potere riducente. Il donatore di elettroni è l’acqua che

viene ossidata ad ossigeno molecolare; potere riducente ed energia vengono

utilizzati per produrre CO2 e composti organici.

Fotosintesi anossigenica, non producono ossigeno. Attuata da batteri rossi e

 verdi, sulfurei e non sulfurei; in questa è presente un solo fotosistema e di solito

il fotosistema funziona o in modo da produrre ATP o in modo da produrre potere

riducente. La fotosintesi viene definita così perché il donatore di elettroni

necessario per produrre potere riducente è un composto diverso dall’acqua e di

solito si definisce come H2D (può essere ad esempio l’idrogeno solforato che

viene ossidato a zolfo elementare o addirittura a solfato e in questo modo si

produce potere riducente). Il fotosistema può essere utilizzato per produrre

energia, il carbonio viene assimilato per dare materiale organico.

Punto chiave della fotosintesi (reazioni alla luce) è la presenza dei pigmenti

fotosintetici, sono di vario tipo: centro di reazione (pigmenti che vengono eccitati e

grazie all’assorbimento di un fotone eccitano un elettrone che viene ceduto alla

catena di trasporto), questi pigmenti sono la clorofilla A (nelle piante verdi e nei

cianobatteri) e le batterioclorofille nei fototrofi anossigenici. Differenza tra clorofilla A e

le batterioclorofille? Entrambi sono dei tetrapirroli che contengono un atomo di Mg,

differiscono nei sostituenti presenti, in particolare nel CH=CH2 e nel CH3-C=O; in

funzione del tipo di sostituenti l’assorbimento della luce varia. Basta la variazione di

alcuni sostituenti presenti sul nucleo centrale per variare lo spettro di assorbimento di

questa molecola. La batterioclorofilla ha i picchi intorno agli 800nm, mentre il picco

della clorofilla A è intorno ai 600nm. Abbiamo delle clorofille antenna che catturano la

luce e la trasferiscono ai centri di reazioni dove hanno inizio le reazioni fotosintetiche

del trasporto degli elettroni. Le molecole dei pigmenti sono fissate nella membrana da

specifiche proteine di legame ai pigmenti. Quali sono i pigmenti antenna? Di

batterioclorofille ce ne sono molte (a, b, c, d, g, e) cambiano nel tipo di sostituzione

nel tetrapirrolo. La presenza di batterioclorofille differenti consente al batterio che ne è

dotato di assorbire luce a diverse lunghezze d’onda. Altri pigmenti importanti sono i

carotenoidi: hanno ruolo di protezione dai danni fotossidativi, dovuta alla loro capicità

di assorbire lo stress ossidativo determinato dalla luce grazie al sistema di doppi

legami coniugati. Anche i carotenoidi variano nei diversi tipi di microrganismi, sono

uno dei pigmenti che contribuisce a dare delle colorazioni particolari: caroteni,

xantofille (gruppo metiossilico a una o ad entrambe le estremità della molecola). Ogni

gruppo di microrganismi è caratterizzato dall’avere un certo di carotenoidi, la presenza

di questi dipende dall’assenza o presenza di ossigeno.

CIANOBATTERI

Il pigmento del centro di reazione è la clorofilla A, i pigmenti antenna sono costituite

da delle particolari proteine coniugate a dei cromofori che prendono il nome di

ficobiliproteine, quindi possono essere coniugate ad esempio alla ficocianina (struttura

tetrapirrolica lineare), questa assorbe a 620nm. In questo caso i sistemi fotosintetici

sono organizzati: la membrana che porta i pigmenti fotosintetici si chiama membrana

tilacoide (continua con la membrana citoplasmatica), all’interno delle membrane sono

collocati i centri di reazioni (PSII) e questo è in stretto contato con i pigmenti antenna

(alloficocianina nella parte più interna e ficocianina nella parte più esterna) -> tutta

questa struttura prende il nome di ficobilisoma e sulle membrane tilacoidi si

presentano come dei granuli. Come avviene il flusso di elettroni? Nel centro di

reazione la clorofilla si eccita e allo stato eccitato è in grado di cedere un elettrone alla

catena di trasporto. Abbiamo fotosistema II (P680) e fotosistema I (P700). Quando un

centro di reazione del fotosistema I viene eccitato, la clorofilla del centro di reazione è

in grado di cedere elettroni a una catena di trasporto che inizia con i chinoni, poi Fe-S

proteine, poi ferrodossina, fino al NAD che viene ridotto a NADH. In questo modo si

produce del potere riducente, ma se la clorofilla ha ceduto un elettroni questa rimane

con un buco elettrone, come viene riempito questo vico? Viene riempito da un

elettrone che deriva dall’eccitazione del P680, questo cede un elettrone alla catena di

trasporta e lo riporta alla clorofilla del fotosistema I. Rimane un buco elettronico nel

P680, occupato da un elettrone derivante dalla fotolisi dell’acqua. [Schema Z]. Flusso

di elettroni (non ciclico) dal fotosistema I al fotosistema II permette l’estrusione di

protoni, la membrana si carica e si crea un gradiente protonico transmembrana

utilizzato per produrre ATP. Quindi si producono sia ATP che potere riducente. Se non è

necessario produrre determinate quantità di potere riducente, il fotosistema I ha anche

capacità di funzionare in maniera ciclica: l’elettrone dalla ferrodossina viene trasferito

al complesso di citocromi e rientra nel sistema fotosintetico. Questa fotosintesi non è

differente dalla fotosintesi delle piante, il sistema è lo stesso. I cianobatteri non

rappresentano l’antenato ancestrale dei cloroplasti. Una volta che il cianobatterio ha

prodotto ATP e NADH (reazioni alla luce), questi composti possono essere utilizzati per

organicare la CO2 tramite il ciclo di Calvin (reazioni al buio). Nei batteri quando si parla

di fotosintesi si parla solo delle reazioni alla luce. Il ciclo di Calvin richiede oltre a 6

CO2 chiede anche 12NADPH e 18ATP, è un investimento energetico rilevante, tuttavia

questi microrganismi hanno accesso ad una fonte energetica che è praticamente

illimitata, devono posizionarsi nell’ambiente giusto. Chi sono i cianobatteri?

Costituiscono un phylum del dominio dei bacteria, di solito vengono suddivisi in diversi

gruppi in funzione di alcune loro caratteristiche. Possono essere:

Unicellulari: cellule singole o aggregati di cellule singole

 Pleurocapsa: cellule più o meno tondeggianti, si riproducono per scissione

 multipla, formando tante piccole cellule sferiche

Oscillatoria: cellule filamentose che si riproducono per scissione binaria su un

 unico piano, quindi formano un unico grande filamento, sono tutte cellule di

grandi dimensioni

Nostoc: cellule filamentose che però producono delle strutture particolari

 chiamate eterocisti, quindi sono filamentosi con eterocisti (differenziamenti

cellulari e sono delle strutture che sono deputate alla fissazione dell’azoto

molecolare, molti cianobatteri sono anche in grado di fissare l’azoto molecolare-

>quindi sono organismi con grandissimo potenziale per essere organismi

pionieri)

Ramificanti: le cellule si dividono e formano ramificazioni perché il piano di

 divisione non è sempre lo stesso

Dove vivono i cianobatteri? Nei suoli purchè raggiunti dalla luce e con umidità

sufficiente, molto più probabilmente si trovano nelle acque (marine e dolci); sono

dotati di vescicole gassose (gusci rigidi costituiti da 2 tipi di proteine differenti, che

costituiscono questi gusci rigidi/semirigidi fusiformi che vengono riempiti con gas

preso dall’ambiente, servono per spostarsi in una colonia d’acqua per spostarsi nella

zona ottimale di crescita per questi microrganismi). Molti cianobatteri formano delle

cellule specializzate:

Beociti, piccole cellule sferiche che si originano da una divisione multipla (da

 pleurocapsa)

Acineti, forme di quiescenza che sono tipiche dei batteri azotofissatori quando

 vanno in carenza di nutrienti; sono dei differenziamenti di alcune cellule per

garantire di superare un periodo di avversità e poter dar di nuovo origine a delle

cellule vegetative che si riprodurranno quando le condizioni saranno favorevoli

Tricomi, filamenti di cellule più o meno avvolte da guaine

 Ormogoni, brevi catene di cellule che si distaccano per formare delle nuove

 colonie

Sono tutte forme di disseminazione della specie.

Eterocisti, come esempio anabena. Sono cellule specializzate per l’azoto

 fissazione. Azoto fissazione: processo molto costoso, ma dà vantaggi al

microrganismo perché gli permette di utilizzare l’azoto come fonte di energia ed

è una risorsa illimitata. Nel momento in cui non c’è disponibilità di azoto

combinato, una cellula ogni 15 cellule vegetative, innesca un differente

programma di trascrizione genica e va a differenziarsi a dare un eterociste,

cellula deputata alla fissazione dell’azoto. Eterocisti e cellule vegetative sono

collegate tra di loro da dei microplasmodesmi, in particolare nelle eterocisti non

avviene più la fotolisi dell’acqua quindi viene degradato il fotosistema II; non

avviene più la fotolisi perché l’enzima deputato alla fissazione dell’azoto è

estremamente sensibile alla presenza di ossigeno. Ulteriore adattamento: la

parete dell’eterocisti è molto più spessa della parete delle cellule vegetative.

Grazie a questo sistema l’eterociste è deputata a produrre composti azotati, in

cambio riceve dalle cellule adiacenti in cambio della glutammina che ha ceduto,

carbonio in forma organica e potere riducente; quindi un’eterociste è un primo

esempio molto embrionale di collaborazione tra cellule, dove una cellula svolge

una determinata funzione e una cellula ne svolge un’altra.

Fototrofi anossigenici

Sono i batteri rossi o porpora (sulfurei e non sulfurei, appartengono al phylum dei

proteobatteri) e i batteri verdi (due phyla distinti: sulfurei e non sulfurei). La

batterioclorofilla del centro di reazione: nei rossi può essere a o b, mentre nei verdi è

la a. Presentano differenze nei pigmenti antenna: nei rossi sono la a e la b, nei versi

sono c, d o e. Presentano differenze anche nei carotenoidi: nei rossi sono alifatici,

spesso metossilati, nei versi sono arilcarotenoidi. Localizzazione: nei rossi si formano

delle introflessioni lamellari o tubolari della membrana citoplasmatica, nei verdi

localizzazione nei clorosomi. Presentano differenze per l’assimilazione dei carbonio:

rossi, usano ciclo Calvin, batteri verdi assimilano CO2 tramite Krebs percorso in senso

riduttivo (al contrario). Differenza delle varie batterioclorofille: differenti assorbimenti a

diverse lunghezze d’onda. In una colonna d’acqua i cianobatteri si posizionano nella

parte più alta, i rossi e i verdi si posizionano nella parte più sottostante.

Batteri rossi

Sistemi di membrane: lamelle o tubuli che sono costituiti da introflessioni della

membrana citoplasmatica stessa, quindi sono in continuo con essa. I batteri rossi sono

dotati di un centro di reazione di tipo I, P870. Come funziona questo sistema? Quando

il RC viene colpito dalla luce di lunghezza d’onda opportuna, abbiamo l’eccitazione con

l’espulsione di un elettrone che viene trasportato su una catena di trasporto e poi

rimesso nel ciclo. Per avere potere riducente l’elettrone deve essere allontanato da

questo ciclo. I primi accettori dell’elettrone sono i chinoni e un citocromo che non

hanno un potenziale redox compatibile con NAD/NADH, quindi cosa succede? Si crea

un gradiente. Il potere riducente nei batteri rossi viene prodotto grazie ad un trasporto

inverso di elettroni. Quando l’elettrone viene allontanato ci sarà una clorofilla con un

buco elettronico, per ripristinare il suo stato elettronico serve un donatore di elettrone

esterno e non può essere l’acqua (perché potenziale redox P680 non è compatibile con

potenziale redox acqua), potrebbe essere l’H2S o altri composto ridotto dello zolfo o

anche del ferro. Il fotosistema funziona o in maniera ciclica per produrre ATP o

funziona per produrre potere riducente, se produce questo ha bisogno di un donatore

esterno per ripristinare lo stato elettronico della clorofilla, in questa caso però non si

produce energia anzi viene consumata.

Batteri rossi sulfurei

Sono proteobatteri, dal punto di vista morfologico si presentano con forme differenti.

Alcuni hanno la caratteristica di poter accumulare (all’interno della cellula) dei granuli

di zolfo elementare (in questo caso è un composto di riserva). Possono essere dei

bastoncini con flagelli, spirilli con flagelli, cocchi più o meno aggregati, sarcina. Criteri

di classificazione: tipo di deposito di zolfo -> se all’interno o all’esterno della cellula,

tra quelli che depositano all’interno si distinguono quelli che riescono a produrre

vescicole gassose o no.

Batteri rossi non sulfurei

Sono proteobatteri, di solito si chiamano Rhodo-. Dal punto di vista morfologico sono

batteri con morfologie diverse: spirilli, bastoncini più o meno curvi, forme più o meno

coccoidi più o meno regolari. Non accumulano mai zolfo né all’interno né all’esterno

della cellula; sono più sensibili all’H2S (composto velenoso) di quanto non lo siano i

batteri rossi sulfurei, quindi tollerano concentrazioni inferiori di H2S. Tant’è vero che

questi batteri sono fototrofi anossigenici, dove si collocano in una colonna d’acqua?

Tra la zona al di sotto della zona aerobica e si distribuiscono nella zona di tolleranza

con i sulfurei più in basso (dove ricevono H2S) e quelli non sulfurei più in alto.

I batteri rossi considerati nel loro insieme sono forse uno dei gruppi di batteri più

versatili che esistano: tutti sanno fare fotosintesi anossigenica e alla luce ci sono

specie che possono comportarsi sia da fotoautotrofi che da fotoeterotrofi (possono

assimilare direttamente carbonio organico, alcuni lo possono utilizzare come donatore

di elettroni per la fotosintesi). Diverse specie di questi batteri rossi possono

comportarsi quando sono al buio e in aerobiosi sono anche capaci di respirare

(chemiorganotrofi); alcuni al buio ma in anaerobiosi sono dei fermentanti o sono

capaci di respirazione anaerobia.

Batteri verdi

Sulfurei e non sulfurei. La cosa più importante è che i batteri verdi sulfurei hanno un

fotosistema che è il P840, eccitato dalla luce, ceduto a batterioclorofilla e a una Fe-S

proteina, da qui l’elettrone prende due strade diverse: o va a ferrodossina per produrre

potere riducente, senza necessità di u trasporto inverso di elettroni perché questa Fe-S

proteina ha un potenziale redox compatibile con potenziale redox NAD/NADH,

necessità di donatore elettroni esterno che è H2S; oppure il fotosistema piò funzionare

in maniera ciclica quindi viene ceduto da Fe-S proteina a chinoni poi citocromi per poi

tornare alla batterioclorofilla. Differenze tra i due fotosistemi: capacità di creare potere

riducente in maniera diretta o indiretta e il potenziale del centro di reazione. Quello

che non si trova mai negli anossigenici è lo schema Z, perché sono dotati di un unico

fotosistema. Nei batteri verdi l’apparato fotosintetico ha una localizzazione diversa da

quelli rossi: alcuni elementi del fotosistema, i centri di reazione e alcune serie di

pigmenti antenna localizzati nella membrana e una parte di pigmenti antenna

localizzati in strutture particolari che sono appiccicate alla membrana con una placca

basale che sono come delle vescicole piene di batterioclorofilla antenna. Non lo

considero un organello perché sono formati da un monostrato lipidico. Distinguiamo

forme differenti: mobili o non mobili, presenza o assenza di vescicole gassose.

Batteri verdi non sulfurei

Chloroflexus: batterio filamentoso, fototrofo ibrido (tra batteri rossi e batteri versi

sulfurei), ha i clorosomi e le batterioclorofille come i verdi sulfurei, ma il centro di

reazione è come quello dei rossi. È dotato di una versatilità metabolica piuttosto

notevole, può comportarsi come fotoeterotrofi e al buio è chemiorganotrofo. Tutti i

batteri verdi utilizzano per l’assimilazione del carbonio il ciclo di Krebs, ma in senso

riduttivo. Il ciclo consuma potere riducente, usa CO2 per sintetizzare molecola di

acetil_CoA che poi può venire indirizzato a formare piruvato (con assimilazione di una

terza molecola di CO2 e consumo di ATP e GTP) e segue inverso glicolisi. Per la

produzione in un trioso vengono usano 3 CO3, 12 equivalenti di riduzione (H), 5 ATP.

Nell’ambiente si collocano in una parte intermedia della colonna d’acqua tra parte

aerobica superiore e sedimenti. Nei laghi particolari formano delle fasce dove c’è una

fascia di acqua che risulta colorata. Un sistema di riprodurre questo ambiente è la

colonna di Winogradsky che è un microambiente e un microcosmo: microambiente

autosostentante con tutti i nutrienti del microrganismo, ha bisogno solo di luce questo

ambiente nel quale si ricreano i cicli degli elementi. Come si prepara questa colonna?

Cilindro: sul fondo sedimento di lago, arricchendolo con sostanze organiche o solfati;

sedimento ricoperto con acqua di lago utilizzata come inoculo, si copre con foglio di

alluminio, si lascia spazio gassoso di testa, si chiude per evitare evaporazione, lo si

colloca alla luce evitando la luce solare diretta (se no si cuoce tutto) e lo si lascia a

riposare per un po’. Cosa succede? Se nell’acqua di lago ci sono batteri rossi o veri o

ossigenici come cianobatteri, grazie alla luce si possono sviluppare e si dispongono

con: cianobatteri in alto, favoriscono a mantenere l’ambiente ossigenato, producono

materia organica che cade sul fondo dove viene utilizzata, ci sono quindi

chemiorganotrofi; si sviluppano anche desulfuricanti che producono H2S che tende a

salire, l’H2S viene consumato dai rossi e verdi che lo ossidano fino a solfato che cade

sul fondo e viene riutilizzato dai desulfuricanti. Con questo sistema ho fatto due cose:

l’ho usato come sistema di arricchimento e come microcosmo perché si sono instaurati

i cicli degli elementi principali.

METABOLISMI ASSIMILATIVI

Chemioeterotrofi assimilano carbonio organico. I microrganismi hanno bisogno anche

di azoto e zolfo, nutrienti essenziali per sintetizzare le molecole oltre al carbonio.

ZOLFO

Solfato: ottima fonte di zolfo, si presenta nella forma ossidata, ma nella cisteina lo

zolfo è presente in SH (forma ridotta). Quindi deve passare attraverso una riduzione,

diversa dalla sulfuricazione, ma è riduzione assimilativa. Il composto finale è l’H2S, ma

con scopi diversi. Riduzione dissimilativa: metabolismo energetico (respirazione

anaerobica), si produce tanto H2S perché sul solfato vengono scaricati tanti elettroni.

La riduzione assimilativa ha uno scopo completamente differente, non ha una funzione

energetica, ma ha funzione biosintetica, quindi come in tutte le biosintesi per non

sprecare energia e/o potere riducente ne viene prodotta giusta quella quantità

necessaria per permettere le biosintesi. Sono molti i microrganismi che possono

assimilare il solfato (E. Coli ad esempio). Non solo ne viene prodotto poco per motivi di

risparmio, appena viene prodotto viene subito utilizzato perché per la maggior parte

degli organismi l’H2S è tossico. Dal punto di vista chimico entrambe le vie sono delle

riduzioni, ma con scopi diversi. Gli enzimi coinvolti nelle vie biosintetiche sono enzimi

citoplasmatici solubili. Il solfato è un composto estremamente stabile e perchè possa

venire ridotto deve essere attivato. Per l’assimilazione è necessaria un’ulteriore

attivazione, viene utilizzato un secondo ATP e in questo caso l’adenosinfosfosolfato

viene ulteriormente attivato con l’aggiunta di un secondo gruppo fosfato in posizione

5’ a dare PAPS (fosfoadenosinfosfosolfato). A questo punto il composto è indirizzato

alla via assimilativa, avvengono delle riduzioni progressiva: prima riduzione porta alla

formazione di solfito con utilizzo di potere riducente (NADPH), successivamente

mediato dall’intervento della solfito riduttasi assimilativa e con utilizzo di 6elettroni si

produce l’H2S. Questo viene immediatamente incorporato in un composto organico.

[Domanda d’esame: differenze tra la via assimilativa e dissimilativa] Come viene

assimilato l’H2S? viene assimilato sulla serina, questa reagisce con acetil_CoA a

formare l’acetilserina e questa funge da accettore dell’H2S grazie alla solfoidrolasi che

sostituisce il gruppo acetilico con il gruppo SH, quindi dalla reazione esce acido acetico

e si forma la cisteina. Da questa si formeranno gli altri composti solforilati necessari

alla cellula.

AZOTO

Ci sono microrganismi che si definiscono “esigenti per l’azoto” ai quali bisogna dare

azoto già in forma organica, batteri lattici; microrganismi “non esigenti”, sono in grado

di utilizzare nitrati o ammonio; azotofissatore, utilizzano l’azoto molecolare presente in

atmosfera quindi N2.

Negli aa in che forma è presente l’azoto? Come gruppo amminico, quindi in una forma

ridotta, ma se l’azoto lo forniamo in una forma diversa da quella ridotta dovrà essere

per forza ridotto. Qual è la forma di azoto che può essere incorporata nell’organismo

senza subire reazione? NH3, le altre forme NO3 o NO2 devono essere ridotte.

Assimilazione NH3:

I sistemi per assimilare l’ammonio son sostanzialmente due:

Uno che funziona bene ad elevate [] di ammonio che è il sistema della

 glutammato deidrogenasi (ha bassa affinità per l’ammonio quindi questo deve

essere in concentrazioni elevate per far sì che avvenga la reazione) Α-

chetoglutarato + NH3 + NADPH + H+ -> glutammato + NADP+ + H2O

L’altra è a basse [] di ammonio, glutammato sintasi. Azione coordinata di due

 enzimi: GS e GOGAT. Acido glutammico funge da accettore di NH3 con spesa di

una molecola di ATP e va a formare la glutammina, reazione catalizzata dalla

glutammina sintetasi, la glutammina poi dona gruppo amminico all’alfa

chetoglutarato e si formano due molecole di acido glutammico. Reazione netta:

alfa-chetoglutarato, +NH3+ATP -> acido glutammico + ADP + Pi

Differenza tra le due reazioni: spesa energetica, nella prima si spende solo potere

riducente, mentre nella seconda si spende ATP, quindi la cellula tende a fare la prima

reazione quando è possibile, in base alle [] di ammonio. La glutammina sintetasi è

regolata in maniera molto fine per evitare spreco energetico per assimilazione di

azoto: è regolata allostericamente e regolata mediante una modificazione post-

traduzionale, l’attività può venire inibita in funzione della concentrazione di ammonio.

Dal glutammato partono una serie di reazioni di transaminazione che sono quelle che

portano a dare aa, utilizzando scheletri carboniosi differenti:

Glutammato + ossalacetato->alfa-chetoglutarato + aspartato

 Glutammato + piruvato -> alanina + alfa-chetoglutarato

 Glutammato + fenilpiruvato -> fenilalanina + alfa-chetoglutarato

 Si utilizzano anche intermedi del ciclo di Krebs e della glicolisi

Biosintesi delle basi

Precursore delle purine: i vari atomi di azoto possono derivare dal gruppo amminico

dell’aspartato, glicina e amide di glutammina. Per le pirimidine: da ammoniaca o acido

aspartico. Una volta che la cellula è in grado di produrre glutammato può fare tutto.

Riduzione assimilativa del nitrato -> per poter essere assimilato deve essere ridotto ad

ammoniaca. [Diversa da riduzione dissimilativa che è un metabolismo energetico,

dove nitrato funge da accettore finale di elettroni, il prodotto finale di questo

metabolismo è l’azoto molecolare]. Prodotto della riduzione assimilativa è ammoniaca,

però ne viene prodotta poca. Gli enzimi hanno lo stesso nome, ma si aggiunge

l’aggettivo assimilativa, catalizzano una reazione simile, ma indirizzano ad una via

biosintetica invece che ad una via dissimilativa, sono enzimi citoplasmatici. Nitrato

reduttasi assimilativa produce nitrito, è un enzima complesso e contiene molibdeno, il

nitrito viene ulteriormente ridotto dalla nitrito reduttasi assimilativa in NH2OH

(idrossilammina) e questa viene poi convertita in NH3. I due enzimi sono entrambi

repressi dalla presenza di ammonio. Gli enzimi dissimilativi da cosa vengono repressi?

I denitrificanti sono gli unici anaerobi facoltativi quindi se c’è ossigeno lo utilizzano

perché energicamente è più vantaggioso, quindi vengono inibiti dall’ossigeno. [Da

sapere benissimo]

Fissazione azoto molecolare: processo biochimico presente esclusivamente nei

procarioti. N2 è un composto estremamente stabile, perché è un triplo legame e per

venire assimilato deve essere ridotto fino ad ammoniaca, è una riduzione piuttosto

spinta. Cosa determina la capacità di un microrganismo di fissare l’azoto? La presenza

di geni NIF che codificano per una serie di enzimi coinvolti nel processo, l’enzima

chiave è l’enzima che catalizza la conversione da azoto molecolare in ammoniaca e si

chiama complesso della deidrogenasi: nitrogenasi riduttasi (omodimero) e nitrogenasi

(eterotetramero e contiene sito catalitico). Questo complesso ha il compito di trasferire

gli elettroni dalla ferrodossina al sito catalitico della nitrogenasi, dove avviene la

riduzione di N2 a NH3. Per convertire una molecola di N2 in due molecole di NH3 sono

necessari 8 protoni e 8 elettroni, perché contestualmente alla riduzione dell’azoto

avviene anche la produzione di azoto molecolare, caratteristica intrinseca dell’enzima.

In più c’è la spesa di 16 ATP (anche 24 ATP), elevata spesa energetica. In assenza di

azoto combinato questi microrganismi sono in grado di crescere una fonte di azoto

immensa. Dato che il processo è così dispendioso questo è regolato in maniera

estremamente fine. La nitrogenasi riduttasi contiene come cofattore il ferro, mentre la

nitrogenasi contiene un cofattore ferro-molbdeno. Come avviene la riduzione?

Abbiamo la produzione di una flavodossina (ferrodissina) ridotta e questo avviene

mediante ossidazione piruvato ad acetil_CoA, la flavodossina cede elettroni alla

dinitrogenasi riduttasi, questa cede elettroni al sito catalico della nitrogenasi, per fare

questo deve innalzare il suo potnziale redox e per farlo idrolizza ATP, a questo punto

trasferisce elettroni al sito catalitico dove avviene la reazione di riduzione di N2 a 2

NH3. Come mai servono 8 elettroni e 8 protoni? Servono perché sembra che la

dinitrogenasi in realtà sia una idrogenasi in cui l’idrogeno viene spiazzato dall’azoto.

La reazione si ipotizza che avvenga: prima tappa produzione di idrogeno molecolare e

si producono anche NH=NH, nella seconda tappa si produce H2N-NH2 e nell’ultima si

producono 2 NH3. Si ritiene che il substrato rimanga legato all’enzima finchè non è

prodotta totalmente l’ammoniaca. La reazione complessiva è : 8H+ + 8e- + n2 -> 2

nh3 + h2, 16-24 ATP-> 16-24 ADP + 16-24 Pi. La nitrogenasi è anche un enzima

estremamente sensibile alla presenza di ossigeno molecolare nel senso che il contatto

con questo inattiva l’enzima, probabilmente perché ossida i cofattori, quindi la

nitrogenasi può lavorare in un microambiente anaerobico. La nitrogenasi è un enzima

dotato di uno spettro di substrato piuttosto rilassato, riduce anche acetilene ad

etilene, la reazione non ha nessun significato biologico, ma fa comodo perché

permette di avere un buon saggio per valutare l’attività diidrogenasica. Come faccio

un saggio enzimatico? Saggio colorimetrico se ho a disposizione di un substrato

promogeno, o misuro la scomparsa del substrato o la comparsa di uno dei prodotti.

Non sono in grado di misurare quando N2 consuma la coltura batterica, non sono

nemmeno in grado di misurare NH3 perché viene subito assimilato. Utilizzo l’acetilene

perchè non ha significato biologico. Come faccio l’esperimento? Preparo una

beuta/fiala contenente la sospensione cellula/campione ambientale chiusa con un

tappo a chiusura ermetica e lo spazio di testa sarà costituito da aria o da CO2, con una

siringa inetto acetilene e ad intervalli vado a prelevare il gas di testa o lo analizzo in

gas cromatografia, man mano che passa il tempo il picco dell’acetilene diminuisce e

ad aumento il picco dell’etilene.

Il sistema è codificato dai geni NIF, sono più o meno 17/18 raggruppati in 7 operoni

diversi, 7 unità trascrizionali indipendenti, sono unità trascrizionali ma costituiscono un

rebulone (più operoni sono sotto controllo degli stessi regolatori): abbiamo due

regolatori che sono NIF a e NIF n, regolatori positivo e negativo. Ci sono altri geni che

codificano quegli enzimi coinvolti nel trasporto degli elettroni fino al complesso della

nitrogenasi. Tutti questi geni, nonché l’attività della nitrogenasi sono regolate dalla

presenza di azoto combinato e dalla presenza di ossigeno. La presenza di azoto

combinato inibisce la trascrizione dei geni NIF, la presenza di ossigeno inibisce la

trascrizione dei gei NIF perché la nitrogenasi è sensibile all’ossigeno e quindi se non

c’è un modo di liberarsi dall’ossigeno molecolare è inutile produrre la nitrogenasi

perché verrebbe inattivata. Possiamo avere una regolazione a livello delle attività

enzimatiche e a livello che agisce sulla trascrizione. Il significato di queste due

regolazioni è quello di rendere il sistema maggiormente efficiente.

Quali sono gli azotofissatori?

Aerobi a vita libera: chemiorganotrofi, comuni nei suoli, alcuni enterobatteri,

 cianobatteri (fototrofi ossgenici, producono loro stessi l’ossigeno),

chemiolitotrofi

Anaerobi liberi: diversi clostridi, diversi batteri desulfuricanti, molto batteri

 fototrofi anossigenici, soprattutto tra i batteri rossi, diversi Archaea metanogeni

Simbionti: in grado di instaurare simbiosi con le radici di determinate piante,

 rendendo la pianta indipendente dalla presenza di azoto combinato nel terreno,

il che per la pianta è un gran vantaggio (soprattutto sotto forma di nitrato).

Simbiosi tra le rizobiacee e le leguminose.

L’azoto fissazione non è una capacità limitata ad alcuni generi particolari, è una

capacità abbastanza diffusa in quanto non sono organismi che appartengono allo

stesso phylum. Cosa suggerisce questo riguardo all’evoluzione? È un metabolismo

antico che si è conservato che a quanto pare ha dei vantaggi, questo è confermato

dall’analisi dei geni NIF. Alcuni geni NIF hanno delle parti estremamente ben

conservate in tutti questi microrganismi.

Protezione della nitrogenasi

Anaerobi facoltativi: alcuni, non tutti, fissano l’azoto solo quando sono

 anaerobiosi

Azotobacter: ha un tasso di respirazione estremamente elevato, quindi consuma

 l’ossigeno molto rapidamente, in che regione della cellula viene consumato

l’ossigeno? Nella membrana. La nitrogenasi è mantenuta al centro della cellula

ed è protetta da alcune proteine che proteggono i cofattori dall’ossidazione

Beijerinckia: si circonda la cellula con un’abbondante quantità di materiale

 capsulare in modo da sfavorire la penetrazione dell’ossigeno, quindi

mantengono bassa la [] locale dell’ossigeno, devono essere organismi

microaerofili

Azospirillum: associazioni con le radici di graminacee, nel mucigel della

 rizosfera, tende a colonizzare la parte esterna della radice, coperta da gel

mucoso e si piazza in condizioni di microaerofilia. Non c’è una specificità per

questo si parla di associazione

Riguarda i cianobatteri: ci possono essere strategie differenti, alcuni fissano

 l’azoto nei periodi notturni, durante il periodo diurno fanno fotosintesi

ossigenica, alternano i metabolismo in funzioni del buio e della luce. Ma i

cianobatteri filamentosi che producono eterocisti, sono interessanti perché

l’eterociste rappresenta un sistema di differenziamento della cellula, si utilizza

come esempio anabena a zolle. La simbiosi si instaura quando la felce inizia a

crescere, forma delle cavità che vengono chiuse e il microrganismo vive in

questa cavità.

Nella cellula vegetativa c’è la fotosintesi ossigenica, nell’eterocisti la fotosintesi non

deve avvenire e deve essere limitato il contatto con l’ambiente extracellulare e questo

si ha con l’ispessimento della parete. Come non si produce ossigeno? Si elimina

fotosistema II, ma come funziona il fotosistema I se non c’è un donatore di elettroni? Il

fotosistema I diventa ciclico producendo ATP, ma non potere riducente. Riceve il

donatore di elettroni che riduce la ferrodossina e cede elettroni alla nitrogenasi. Dato

che non produce potere riducente non riesce neanche a far funzionare bene il ciclo di

Calvin quindi riceve azoto già fissato sotto forma di glutammina, quindi già combinato

in un composto organico.

Batteri azotofissatori

Simbiosi rhizobium-leguminose

Estrema specie specificità: ogni particolare leguminosa è infettata da un determinato

batterio -> riconoscimento specifico tra pianta e simbionte. Nella radice ci sono i

NODULI RADICALI, sede per l’azoto fissazione, prodotto specifico della simbiosi. Per

chemiotassi il batterio infetta la pianta, canale di infezione -> questo si allunga

attraversando le cellule del cortex fino a cellule tetraploidi, le quali formano vescicole

con i pochi batteri che si moltiplicano attivando la nitrogenasi e si forma il nodulo

maturo con batteri.

Flavonoidi: escreti dalla pianta (specifici) effetto chemiosmotico e induttori dei geni

nod, governano la forma del nodulo, alcuni sono quelli che formano il ripiegamento del

pelo radicale e canale d’infezione. Le cellule smettono il programma vegetativo e

inducono quello per la fissazione, geni NIF.

Plasmidi sym: geni per la formazione del nodulo nod e spesso NIF -> non vengono

espressi finchè il nodulo radicale non è maturo e il batterio è diventato batterioide.

Non è più in grado di moltiplicarsi, ha cambiato morfologia e solo ora può produrre

nitrogenasi. Con metabolismo aerobio come fa? Produzione di Ley-emoglobina,

prodotto specifico simbiosi:

Geni globina -> pianta

 Geni EME -> batterici

La Ley-emoglobina lega l’ossigeno, si va a creare una colorazione rossa in maniera

reversibile -> cede ossigeno giusto per la respirazione alla catena di trasporto degli

elettroni.

Cicli biogeochimici degli elementi:

BIOSINTESI MATERIA ORGANICA MINERALIZZAZIONE

COMPOSTI ORGANICI

CICLO DEL CARBONIO

(CH O) -> respirazione -> CO -> fotosintesi ossigenica -> (CH O)

2 n 2 2 n

CO -> fotosintesi anossigenica -> (CH O) -> respirazione anaerobica e fermentazioni

2 2 n

-> CO 2

I microrganismi sono gli agenti principali di questo processo perché:

Ubiquitari

 Abbondanti

 Elevata versatilità metabolica

 Elevato tasso metabolico, cioè metabolizzano più rapidamente

Composti di origine naturale degradati a monomeri e convogliati nel ciclo acidi

tricarbossilici, il quale produce energia e CO . Quelli non presenti in natura dipende dal

2

range di grandezza degli enzimi per degradarli.

Anossigenici:

Fase idrolitica: polimeri -> monomeri (es. glucosio)

 Fase acidogena: fermentazione primaria (piruvato/lattato), fermentazioni

 secondarie che usano come substrato il prodotto di quelle prime (H , CO ,

2 2

acetato e 3C e 4C)

Fase metanica: metanogenesi CH e CO , prodotti finali della degradazione

 4 2

composti organici in ambienti anaerobici

Batteri sintrofici

Fermentato acidi grassi ed alcoli a corta catena con produzione di acetato e H . ΔG°’ =

2

positivo, sono batteri che sono obbligati a vivere con altri batteri che sottraggono H 2

prodotto, ma variando la [] li permette di trarre energia.

ATTINOMICETI (da fare dal libro)

Microrganismi SPORIGENI

Sporulazione: formazione delle endospore, si formano nella cellula vegetativa. Da una

cellula si forma una spora e dalla spora si forma una cellula vegetativa, non è una

modalità di riproduzione né di disseminazione della specie (al contrario delle esospore

degli attinomiceti). Le endospore sono molto più resistenti ad agenti di stress di

quanto non lo siano le esospore. Quando si formano le endospore? L’inizio della

sporulazione avviene nel momento in cui si transita da una fase esponenziale ad una

fase stazionaria, la formazione dell’endospora è una risposta agli stress, si formano nel

gruppo di batteri che hanno il programma genetico per questo tipo di differenziamento

cellulare. La spora matura è rifrangente, quindi al microscopio ottico a contrasto di

fase si vedono come dei tondini, è disidrata, è quiescente metabolicamente e presenta

una serie di resistenze: resistente all’essicamento, al calore, alle radiazioni e a dei

composti chimici. Quali sono i generi batterici che sono in grado di produrre

endospore? Possono essere aerobi, anaerobi facoltativi, anaerobi acidofili, alcalofili,

fototrofi. Facciamo riferimento a due geni principali:

Bacillus, gram +, a basso contenuto GC, aerobi o anaerobi facoltativi, catalisi +

 Clostridium, anaerobi, con metabolismo fermentativo

Degli sporigeni sono anche presenti in altri generi: sporolactobacillus, solfato riduttore,

acidofili, alcalofi, fototrofi (Heliobacterium), sporosarcina. La capacità di produrre

endospore è presente in moltissimi generi. Più o meno tutti appartengono al gruppo

dei Firmicutes, sono filogeneticamente affini a questo gruppo.

Spora: Molto rifrangenti

 Dimensioni e morfologia possono variare nelle diverse specie, alcuni con spora

 tondeggiante con diametro maggiore rispetto alla cellula vegetativa o spora con

diametro più piccolo e può essere in posizione centrale o terminale rispetto alla

cellula vegetativa

Sono molto difficili da colorare per loro caratteristiche, per colorarle si usa una

 colorazione differenziale particolare: a caldo con un colorante verde malachite.

Perché a caldo? Perché permette al colorante di penetrare nelle spore. Vetrino

preparato fissato alla fiamma, si mette il verde, si scalda fino a che il colorante

non fuma (non si deve seccare), si lava con acqua e si fa una colorazione di

contrasto di solito con safranina. Le spore che hanno assunto il colorante lo

trattengono anche durante il lavaggio con acqua, le cellule vegetative poi

vengono contro colorate con la safranina.

Molto disidrata, non è l’unica differenza con le cellule vegetative:

 Cellula vegetativa Spora

Acqua 78-80% 15-20%

% PESO SECCO % PESO SECCO

Β-idrossibutirrato 28 0

Carboidrati 18 5

Proteine 40 60

Dipicolinato di Ca 0 15

Le spore contengono il dipicolinato di Ca è un sale dell’acido dipicolinico (anello

 eteroaromatico con due gruppi carbossilici disposti in meta tra di loro); la

presenza di questo è un altro aspetto essenziale: perché questo, si ritiene, che

sostituisca l’acqua, creando un ambiente della consistenza di un gel piuttosto

denso all’incirca.

Com’è fatta una spora?

Core: parte più interna, contiene quello che rimane del citoplasma, contiene:

 assetto genomico completo, DNA, ribosomi, acido fosfoglicerico (come

materiale energetico da utilizzare nel momento della germinazione), dipicolinato

di Ca.

Membrana citoplasmatica interna: circonda il core, deriva dalla membrana

 citoplasmatica della cellula germinativa.

Corteccia: circondata dalla membrana citoplasmatica esterna, formata dal

 peptidoglicano più lasso e con sostituenti differenti rispetto al peptidoglicano

della membrana.

Membrana citoplasmatica esterna: caratterizzata dal fatto di avere una polarità

 inversa alla membrana citoplasmatica, il lato che era rivolta al citoplasma ora è

rivolto verso l’esterno.

Tuniche sporali: strato di proteine caratterizzate dalla presenza di parecchi

 residui di cisteina che permettono la formazione di ponti di solfuro, queste

tuniche rappresentano 30-60% delle proteine presenti nella spora, per questo

aumenta il contenuto della proteine rispetto alla cellula vegetativa. Proteine

ricche di cisteina, formano una serie di strati fibrillari e lamellari molto poco

permeabili, formano strutture simili alla cheratina.

Esosporio: parte più esterna, struttura facoltativa, non tutti gli sporigeni

 formano esosporio e a volte quelli che lo formano si possono trovare in

situazione particolari in cui non lo formano o lo formano in maniera ridotta.

Costituito da zuccheri o da piccoli peptidi, in microrganismi differenti, di solito

costituiti da un tipo unico di aa (poliglutammato).

A cosa servono questi strati che rivestono il core? A proteggerlo in quanto è quello che

darà origine alla nuova cellula vegetativa.

Caratteristiche:

Rifrangenza: perché è disidrata

 Resistenza al calore: isolamento mediante pastorizzazione e resistono ai

 trattamenti di sterilizzazione casalinga; non resistono a trattamento a 125°C per

15 minuti. Caratteristica utilizzata se vogliamo isolare degli sporigeni. Dove li

troviamo? Sono comuni nei suoli, alcuni anche nell’intestino, alcuni sono anche

patogeni, come si isolano? Si prende campione di suolo, si mette in

acqua/terreno/diluente, si pastorizza (80°C per 10 minuti), sufficiente per

eliminare forme vegetativa presenti, ma non sufficiente per danneggiare

endospore, quindi si mettono ad incubare e se nasce qualcosa si è quasi certi

che sia uno sporigeno. Questa resistenza al calore è dovuta al fatto che la spora

è disidratata perché fa sì che le macromolecole risultino fortemente impaccate

e più lo sono e più sono insensibili alla denaturazione termica

Resistenza agli agenti chimici: comuni antisettici che usiamo per disinfettare

 una ferita, agenti chimici per disinfettare agli ambienti. Resistenza dovuta

all’impermeabilità delle tuniche sporali

Resistenza agli antibiotici, dovuta alle tuniche sporali e al fatto che gli antibiotici

 agiscono solo su particolari reazioni metaboliche e il fatto che le spore siano

quiescenti aiuta nel resistere agli antibiotici

Resistenza alle radiazioni; ultraviolette, perché DNA è in una forma talmente

 impaccata da nascondere il bersaglio della radiazione; il DNA in questa forma è

“protetto” dalle SASP, tutti i batteri che producono endospore hanno sistemi di

riparazione ai danni del DNA che vengono attivati nel momento della

germinazione e sono sistemi molto efficienti. Resistenti anche alla radiazioni

ionizzanti: molto dannosi perché possono produrre rottura a singola/doppia elica

del DNA, rotture dovute alla produzione di radicali, ma in ambiente disidratato

la formazione dei radicali è molto ridotta

Sporulazione

Processo piuttosto lungo, come microrganismo modello è stato utilizzato bacillus

subtilis (equivalente di E. coli), molto facile da coltivare ed è stata studiata isolando

una serie di mutanti che hanno permesso di identificare i diversi stadi del processo di

sporulazione (circa 200 geni). In bacillus subtilis l’intero processo richiede circa 8 ore

di tempo. Il processo è diviso in 7 stadi:

1. Stadio zero: la cellula vegetativa ha duplicato il suo cromosoma

2. Cromosomi si dispongono in lungo per la cellula formando quello che è stato

chiamato filamento di cromatina assiale (chiamato così per associazione degli

eucarioti)

3. Inizia il vero e proprio processo, la linea nera all’esterno rappresenta la parete

batterica, la parte in blu rappresenta la membrana. All’interno dello stesso

involucro di parete batterica c’è un’invaginazione della membrana cellulare (e

costruzione nuova membrana) asimmetrica che divide il cromosoma che si è

duplicato, una va a finire nella parte più piccola e uno nella parte più grande. Si

forma un setto che divide una cellula più piccola (prespora) e una cellula più

grande (cellula madre, destinata poi a lisare)

4. La cellula madre fagocita la prespora, la cellula madre cresce e va a circondare

tutta la prespora, si forma la membrana con polarità inversa. A questo punto il

processo è diventato irreversibile, cellula costretta a terminare la sporulazione.

Cominciano a formarsi i rivestimenti della spora matura: si deposita per prima la

corteccia

5. Inizia il processo di disidratazione contemporaneamente viene prodotto l’acido

dipicolinico e viene assunto calcio dall’esterno

6. Si ha la maturazione della corteccia, comincia la formazione dell’esosporio

7. Si producono le proteine delle tuniche sporali, produzione di una spora matura

chiusa all’interno della cellula vegetativa

8. Ciò che rimane della cellula vegetativa lisa e libera la spora matura

nell’ambiente

Cosa succede alla spora? Rimane lì e aspetta che cambino le condizioni, per quanto

rimani lì? Dipende, può rimanere lì anche per decenni, però potrebbe esserci un

momento in cui le condizioni ambientali sono favorevoli allo sviluppo vegetativo e

quindi germina. Germinano più facilmente spore vecchie rispetto a spore giovani, si

ritiene che sia perché le spore vecchie hanno comunque subito un qualche tipo di

danno agli involucri esterni e questo permetta eventualmente all’acqua e a

determinate sostanze (nutrienti, percepite come segnale positivo) di superare la

barriera. O si scaldano (per ledere i rivestimenti superficiali) o si agitano con delle

microsfere di vetro, in questi casi la germinazione è più efficiente.

Cosa succede nel momento in cui ci sono le condizioni favorevoli per lo sviluppo

vegetativo? Inizia la germinazione e c’è un primo periodo che viene chiamato il

processo di attivazione, processo reversibile, è quello che sulle spore giovani viene

fatto con trattamento con calore o meccanico. Questo processo dura 2-3 minuti, è un

evento molto più rapido della sporulazione. Come avviene? La spora perde molto

rapidamente le sue resistenze, rilascia dipicolinato di Ca e assume acqua

dall’ambiente, perde anche rifrangenza, comincia ad idrolizzare la corteccia, reidrata

completamente il core fino ad assumere il tenore d’acqua di una cellula vegetativa

(80%) e riattiva le attività metaboliche. Di fatto demolisce solo parzialmente le

tuniche, la cellula che sta assumendo acqua e a riattivare il metabolismo fuoriesce da

una sorta di guscio costituito dalle tuniche. Si parla infatti di esocrescita. La prima

sintesi che parte è quella degli mRNA, poi sintesi proteica (utilizzando anche gli aa che

derivano dalla degradazione delle proteine SASP), sintesi DNA e riproduzione cellulare.

Regolazione del processo: è un processo complesso a cui partecipa tanto la cellula

madre quanto la prespora, collaborano nella produzione di questa struttura, alcune

cose vengono prodotte dalla prespora altre dalla cellula madre. Tutto il processo di

sporulazione è regolato sia nel tempo che nello spazio (nella prespora e nella cellula

madre). È un sistema di regolazione positivo.

Come fa la cellula sa se è meglio produrre un’endospora o piuttosto produrre cellule

vegetative? Come fa a regolare? L’inizio della sporulazione avviene mediante una

serie di segnali che portano a spegnere i geni necessari per la vita vegetativa e

trascrivere invece i geni necessari per la sporulazione. Ma deve arrivare il segnale,

come arriva? Arriva mediante un sistema di trasduzione che sfrutta una cascata di

fosforilazioni, questa parte da alcune chinasi (identificate almeno 5, alcune di

membrane e altre solubili intracellulari). Nel momento in cui queste chinasi (sensori)

captano un segnale specifico si autofosforilano e trasferiscono il gruppo fosfato ad una

seria di proteine che sono Spo0F, Spo0B, Spo0A. Tutti i geni coinvolti nella

sporulazione sono geni Spo, seguiti da un numero che è relativo allo stadio in cui sono

presenti, poi seguiti da un’identificazione alfa-numerica. Spo0A nella forma fosforilata

funziona da attivatore trascrizionale, va ad attivare la trascrizione dei geni Spo0.

Contemporaneamente è un inibitore di un’altra proteina regolatrice è che è AbrB, che

è un repressore dei geni Spo0, inattivando AbrB il primo gene che viene trascritto è

Spo0H, questo codifica per un fattore σ che è il fattore σH. A cosa servono i fattori σ? A

riconoscere dei gruppi di promotori specifici, quindi qui c’è un sistema dove una serie

di geni possono essere trascritti solo se vengono prodotti o attivati i fattori σ specifici,

altro modo di regolazione. Servono la produzione di Spo0H, come fattore di produzione

σ specifici, e produzione di Spo0A fosforilato, attivatore trascrizionale. Come prosegue

tutto ciò? C’è un continuo scambio di informazioni tra cellula madre e la prespora. La

regolazione temporale e spaziale avviene grazie alla produzione di fattori σ differenti

nelle cellula madre e nella prespora. Il primo fattore σ che viene prodotto nella

prespora è il fattore σF, questo fa due cose principali: serve per trascrivere il gene che

codifica per un ulteriore fattore σ che è il fattore σG, che viene inizialmente prodotto

come un pro σG, prodotto, ma non attivo, e contemporaneamente segnala alla cellula

madre di produrre σE, comunica alla prespora di attivare σG e permette di trascrivere

il gene che codifica per σK, anche questo viene prodotto, ma non è ancora attivato.

Man mano che gli eventi procedono σK viene attivata. Quindi ci sono fattori σ specifici

prodotti o nella cellula madre o nella prespora, quindi servono entrambe le parti per

produrre la spora matura. Temporalmente il processo è segnato dai segnali che

comunicano alle due cellule che è venuto il tempo di produrre o di attivare il fattore σ

necessario per la continuazione del processo.

È un primordio di multicellularità, perché c’è un’espressione differenziale che permette

di realizzare uno scopo comune.

GENERE BACILLUS

Comprende tutti i microrganismi di forma bastoncellare, sono aerobi o anaerobi

facoltativi, posso formare spore morfologicamente differenti (sferiche, ovali o

cilindriche) e possono essere in posizioni diversi nella cellula (terminali o centrali). È

un genere molto vario perché all’interno sono compresi microrganismi termofili e

acidofili, molti sono mesofili, ci sono anche specie patogene (bacillus anthracis),

comprende anche specie che sono patogene per gli insetti, possono essere utilizzati

come bioinsetticidi.

Durante la sporulazione possono essere prodotti dei metabolismi secondari.

Bacillus thuringensis: produce una proteina depositata sotto forma di cristallo vicino

alla spora, quando viene introdotta dai lepidotteri questa che contiene protossina

viene attivata nell’apparato digerente alcalino della larva. Forma dei pori a livello

dell’apparato digerente: la larva non riesce più a nutrirsi e dall’altra favorisce la

disseminazione del bacillus e causa la morte. Perché viene utilizzato come

bioinsetticida? La protossina non viene attivata nell’apparato digerente dell’uomo che

non contiene un pH alcalino.

Diversi bacillus producono degli antibiotici:

Tirocidina

 Gramicidina

 Polimixina

 Bacitracina, attiva contro la sintesi del peptidoglicano

Sono antibiotici di natura aminoacidica, contengono aa in forma lineare o ciclica.

GENERE CLOSTRIDIUM

Sono tutti anaerobi, la maggior parte sono fermentanti e sono caratterizzati da una

versatilità metabolica molto elevata. Complessivamente possono fermentare:

Carboidrati (cellulosa, amido, pectina, zuccheri di varia natura, alcuni pentosi o

 metilpentosi)

AA (singoli o in coppia, tra questi ricordiamo due patogeni C. tetani e C.

 botulinum)

Purine

 Etanolo con produzione di acidi grassi

A seconda del tipo di composti che fermentano possono produrre vari tipi di acidi.

REAZIONE DI STICKLAND

Fermentazione accoppiata di due aa, è una delle poche fermentazioni in cui c’è un

accettore esterno di elettroni. Dei due aa della coppia di fermentazione uno funge da

donatore di elettroni (per cui si ossida) e uno funge da accettore di elettroni (per cui si

riduce). Ci sono diversi aa che possono essere fermentati a coppie: esempio che

utilizziamo è alanina-glicina. L’alanina subisce una deaminazione ossidativa e forma

piruvato, con riduzione del NAD+ a NADH. il piruvato subisce decarbossilazione

ossidativa e si forma acetil_CoA, NAD+ ridotto a NADH. l’acetil_CoA è un composto ad

alta energia per cui viene sostituito da un gruppo fosfato, l’acetilfosfato cede il gruppo

fosfato ad ADP andando a formare ADP e acetato. Il NADH prodotto deve essere

riossidato per poter essere riciclato, viene riossidato a spese di una deaminazione

riduttiva di due glicine (gruppo NH2 allontanato e sostituito da H). Si formano due

molecole di acetilfosfato e queste vengono ridotte formando 2ATP e 2 acetati. La

conservazione di energia avviene mediante fosforilazione a livello del substrato.

[Guarda slide, manca qualcosa]

Interazioni microrganismi-uomo, cosa fanno i microrganismi che interagiscono o in

maniera positiva o in maniera negativa. Interazioni che avvengono con tutti gli

organismi (piante, con azotofissazione). Invasività dei microrganismi: capacità di

mettere in atto delle strategie volte ad insediarsi in un organismo, non

necessariamente la capacitò di entrare all’interno delle cellule; molti patogeni non

sono intracellulari, riescono a penetrare e ad insediarsi nell’organismo. Anche capacità

di entrare all’interno delle cellule dell’ospite. Esistono due meccanismi per entrare

nelle cellule:

Meccanismo ZIPPER: basato sulla capacità di un microrganismo di riconoscere

 determinati recettori ai quali aderisce con le molecole di adesina presenti su

certi tipi di fimbrie. Questa adesione stimola un rimodellamento dei filamenti di

actina della cellula eucariote, che spinge la cellula ad includere il microrganismo

all’interno di un vacuolo. Quali sono i microrganismi che utilizzano questo

meccanismo? Yersinia, Listeria con due meccanismi differenti, poi ce ne sono

anche tanti altri. Il contatto tra le adesine e il recettori specifici presenti sulla

membrana della cellula eucariote che scatenano un sistema di trasduzione del

segnale che causa il rimodellamento dell’actina.

Meccanismo TRIGGER: i microrganismi usano degli apparti di secrezione di

 tipo 3 (accennato con i sistemi di secrezione ad inizio corso) con il quale

iniettano nella cellula ospite degli effettori che vengono chiamati invasine.

Anche questi effettori scatenano una serie di risposte che fanno sì che si vada a

creare un rimodellamento moto più spiccamento dal meccanismo zipper, il

microrganismo viene inglobato in un vacuolo e portato nella cellula.

Rimodellamento molto più consistente rispetto al primo meccanismo. Morfologia

a “calice di fiore” che dura pochi secondi.

Una volta che il batterio è nella cellula possono succedere diverse cose:

La cellula tenta di distruggere i microrganismi nel vacuolo e questi devono

 avere dei meccanismi di difesa

Microrganismi intracellulari facoltativi: possono vivere anche bene all’esterno

 della cellula ospite. Ad esempio: Salmonella, Shigella, Legionella, Listeria

Microrganismi intracellulari obbligati: che possono proliferare solo all’interno

 della cellula ospite. Ad esempio: Chlamydia, Rickettsiae (una di questa è quella

che causa il tifo), Mycoplasma (privi di parete)

Cosa succede quando sono entrati nella cellula? Dipende dal loro modo di vita,

possono causare la lisi del vacuolo e trasferirsi nel citoplasma, altri invece sono capaci

di moltiplicarsi e di vivere all’interno del vacuolo. Nel vacuolo avvengono molto spesso

delle reazioni che sono mirate ad eliminare il microrganismo.

TOSSIGENICITA’

Quanto sono più potenti sono le tossine che il microrganismo produce tanto meno è

invasivo o viceversa.

Endotossine vs esotossine

Endotossine: sono tossine tipiche dei batteri gram negativi perché fanno parte del

lipopolisaccaride della membrana esterna, sono costituite dalla lipide A (parte più

interna del lipopolisaccaride, quello che costituisce il foglietto esterno della membrana

esterna). Vengono chiamate così perché sono parte integrante del microrganismo e

vengono liberate solo alla morte della cellula, quando questa lisa. Sono molto

termostabili, non hanno un bersaglio specifico e i loro sintomi sono generici (febbre e

possono dare dei disturbi di caratteri generale, vomito, diarrea, malessere generale).

Quanto sono tossiche? Sono poco tossiche e molto raramente risultano essere letali,

se non nell’infante o in individui con debilitazioni consistenti dell’organismo. Sono

anche poco immunogeniche, stimolano poco la risposta immunitaria, il che significa

che è poco sensato produrre un vaccino.

Esotossine: vengono secrete dalla cellula batterica e riversate nell’ambiente. Dal

punto di vista chimico sono delle proteine, quindi possono essere denaturate e quindi

perdono la loro efficacia. Prodotte sia da gram positivi che gram negativi. Non

costituiscono una parte integrante della cellula batterica. Hanno un bersaglio

specifico, la loro modalità di azione e i sintomi che determinano sono tutti specifici:

anche la sintomatologia è caratteristica di quella determinata tossina. Possono essere

più o meno tossiche, sono sempre più tossiche delle endotossine, alcuni possono

essere letali anche a livello di pochi nanogrammi. Essendo delle proteine hanno anche

un’elevata capacità immunogenica, stimolano il sistema immunitario per la produzione

di ab che possono neutralizzare completamente la tossina. Essendo delle proteine e

avendo questa elevata capacità immunogenica è anche possibile produrre dei vaccini

che possono essere molto efficaci; trattando la proteina con qualche sistema che tolga

la tossicità pur mantenendo l’elevata immunogenicità. Vaccinazioni non durano tutta

la vita, danno immunità passiva. Normalmente non causano la febbre le esotossine.

Le esotossine possono essere classificate in base al bersaglio o in base al sito in cui

agiscono. Classificazione in base al bersaglio:

Enterotossine, attive sulle cellule della mucosa intestinale, causano disturbi di

 tipo intestinale (diarrea). Tossina colerica, enterotossina stabile o instabile al

calore

Neurotossine, attive sul sistema nervoso centrale e periferico, causano disordini

 nella trasmissione del segnale. Tossina botulinica e tossina del tetano

Citotossine, attive su diversi tipi di cellule, non necessariamente sulle cellule di

 uno specifico distretto, purché queste cellule abbiano il recettore adatto al

riconoscimento della tossina; possono causare la morte della cellula. Tossina

difterica e streptolisina

Classificazione in base al sito di azione:

Agiscono dall’esterno e trasmettono il segnale all’interno

 Entrano nella cellula: tossine di tipo AB, sono polipeptidi, la parte B è quella

 deputata all’interazione con il recettore specifico presente sulla superficie della

cellula e la parte A è quella che penetra nella cellula ed è la parte attiva; altre

tossine (invasine) vengono iniettate nella cellula ospite con sistema di

secrezione di tipo 3.

Alcuni scatenano attraverso l’interazione con recettore specifico un segnale cellulare

che determina un certo tipo di risposta, altri vanno a formare dei pori perché agiscono

su un bersaglio intracellulare.

Agiscono all’esterno: i superantigeni -> esempio prodotto da Staphylococcus

 aureus che causa la sindrome da Shock Tossico. Cosa fa un superantigene?

Normalmente un antigene deve essere presentato da delle cellule particolari

che hanno sulla loro superficie il solco di legame dell’antigene.. un

superantigene disturba l’interazione causando l’attivazione di numerose linee

clonali delle T helper, in maniera scarsamente specifica, quindi è generalizzata,

quella che causa la cosiddetta sindrome da shock tossico.

Altre tossine che agiscono dall’esterno: tossine RTX (erano chiamate emolisine,

 non sono necessariamente specifiche per il globuli rossi) e tossine chiamate

citolisine (che si legano al colesterolo). Le prime producono pori piccoli, le

secondi producono pori con dimensioni maggiori, l’effetto è che vanno a

squilibrare la cellula rispetto all’ambiente esterno.

Tossine di tipo AB, con bersaglio intracellulare: sono costituite da almeno due

 peptidi (anche più di due) legati o con ponti disolfuro o con legami deboli, la

parte B è quella deputata al riconoscimento del recettore presente sulla parte

della cellula che verrà danneggiata e può essere più di una subunità, mentre la

parte A è quella attiva con attività catalitica. Attività enzimatica della parte A:

una delle più comuni è dell’ADP-ribosultransferasi, glicosilazione, deamidazione,

proteasica, attività che vanno ad influenzare l’adenilato-ciclasi cellulare.

Problemi causati da tossine di tipo AB:

Botulismo: intossicazione alimentare, Clostridium botulinum (anaerobio

 fermentante comune nel suolo), perché può contaminare gli alimenti? Perché si

trova nelle conserve ad esempio, le spore che sono presenti negli alimenti che

vengono messi a conservare. Non colonizza l’uomo, è un microrganismo per

nulla invasivo. La tossina supera la barriera acida dello stomaco, viene

assorbita, dall’apparato digerente viene trasportata fino ai motoneuroni, va ad

agire a livello della connessione tra il motoneurone e il muscolo. Come agisce?

Agisce impedendo la maturazione delle vescicole presinaptiche, di conseguenza

impedisce il rilascio dell’acetilcolina e se non viene rilasciata acetilcolina il

muscolo non si contrae. La tossina botulinica causa quella che viene definita

una paralisi flaccida. È una tossina estremamente efficiente, bastano pochi

nanogrammi per causare la morte nell’uomo. Perché si arriva a questa morte?

Perché non si ha più il movimento del muscolim quindi anche del cuore.

Tossina tetanica: il tetano è una malattia causata dall’infezione di ferite

 profonde con Clostridium tetani. Perché una ferita profonda? Questo

microrganismo è anaerobio, quindi deve trovare un posto con condizione

adeguate per proliferare, le ferite profonde possono diventare anaerobiche. C.

tetani si sviluppa, ma rimane localizzato a livello della ferita, non è invasivo,

secerne la tossina che arriva al midollo spinale tramite il circolo e tramite i

motoneuroni arriva ad agire sui muscoli. Come agisce? La tossina tetanica fa il

contrario di quello che fa la tossina botulinica, inibisce il rilascio di glicina o di

GABA dai motoneuroni inibitori, questi continuano a rilasciare acetilcolina anche

quando non c’è un impulso volontario -> si hanno spasmi tetanici, non

controllati, quindi ha una paralisi spastica.

Tossina difterica: prodotta da Corynebacterium diphtheriae. È una citotossina,

 agisce su qualunque cellula dotata del recettore specifico, è dotata di attività di

ADP-ribosilazione che viene effettuata sul fattore di allungamento della

traduzione EF-2. Cosa fa la tossina? Catalizza il trasferimento dal NAD al fattore

EF-2, che diventa ADP-ribosil-EF-2, quindi abbiamo il blocco della sintesi

proteica, questo blocco porta alla morte della cellula.

Tossina colerica: prodotta da Vibrio cholerae (affine agli Enterobatteri), batterio

 che può stare bene nelle acque salmastre e l’infezione avviene tramite il circuito

oro-fecale. Quando vengono ingeriti cibi o bevande che sono state contaminate

da cellule che contengono Vibrio cholerae che vengono espulsi con le feci. Ad

esempio le cozze sono dei trasportatori di questo batterio. Questo

microrganismo deve essere in grado di superare la barriera dello stomaco

perchè prende contatto con le cellule dell’epitelio dell’intestino tenue. Una volta

che Vibrio cholerae si è insediato inizia a produrre la sua tossina, prendono

contatto con un ganglioside delle cellule epiteliali e la parte A viene traslocata

all’interno della cellula. La parte A va ad interagire con la parte regolativa

dell’adenilato-ciclasi (sempre tramite ADP-ribosilazione), che è sregolata quindi

inattiva e continua a produrre cAMP. Questo causa un rilevante squilibrio

osmotico, dove aumenta il trasporto di ioni cloro nel lume dell’intestino dalla

cellula al verso del lume e diminuisce il trasporto di sodio dal lume verso la

cellula, questo causa il richiamo di acqua da parte del sangue e ciò causa la

diarrea.

La patogenicità è dovuta da tanti fattori differenti. Quali sono i vari sistemi dei batteri

patogeni? La presenza di flagelli che permettono il movimento, presenza di fimbrie con

adesine, capacità di produrre tossine, presenza di enzimi specifici per le fimbrie. Quali

sono i geni che si possono associare alla virulenza? I geni specifici che codificano per

una serie di enzimi che sono assenti nei patogeni, implicati direttamente

nell’interazione con l’ospite, direttamente responsabili dei danni di interazione

specifica. Possiamo avere geni associati alla virulenza: regolano trascrizione e

traduzione dei geni di virulenza o ne è chiesta l’attività per questi fattori e possono

essere associati alla virulenza una serie di geni che contribuiscono allo stile di vita del

microrganismo. Questi sono geni ad esempio che mediano la colonizzazione di un

ospite, mediano anche i meccanismi di evasione immune, mediamo la sopravvivenza

intracellulare dei patogeni, sfruttano i fattori dell’ospite per implementare la

sopravvivenza.

I batteri patogeni (per l’uomo) sono sempre esistiti? Si sono evoluti con l’evoluzione

dell’uomo; si ritiene che si siano evoluti da dei batteri commensali -> acquisizione di


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elaisa9

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6 mesi fa


DETTAGLI
Esame: Microbiologia
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze e tecnologie biologiche
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher elaisa9 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Insubria Como Varese - Uninsubria o del prof Barbieri Paola.

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