Microbiologia

Microbiologia

La microbiologia è la scienza che studia le cellule microbiche per sondare i processi fondamentali della vita. È applicabile in medicina umana e veterinaria, agraria, industriale, e ambientale. La microbiologia medica studia organismi causa di malattia nell’uomo. Le sotto-discipline sono: batteriologia medica, virologia medica (organismi subcellulari), micologia medica e protozoi (organismi procariotici).

Organismi studiati dalla microbiologia

La microbiologia studia i batteri (non archea) ed eucarioti, che derivano entrambi da LUCA (Last Universal Common Ancestor, cioè antenato comune). La branca della batteriologia studia le cellule batteriche, le interazioni tra batterio e cellula dell’organismo ospite, meccanismi infettivi e i farmaci antibatterici. Gli organismi si individuano con la nomenclatura binomiale, ovvero indicando prima genere e poi specie, ad esempio Escherichia coli.

Caratteristiche delle cellule batteriche

La cellula batterica non è visibile ad occhio nudo, circa 1 µm, e la sua forma è in genere regolare per la presenza della parete rigida. Possono essere: cocchi (sferici, a loro volta divisi in streptococchi= 2 cocchi, diplococchi= catenella di cocchi, stafilococchi= grappoli), bastoncini o bacilli (singola oppure a catenelle “streptobacilli”), coccobacilli (via di mezzo tra cocco e bacillo), vibrioni (a virgola), spirilli (filamentosi). I batteri sono visibili con microscopio ottico che utilizza ingrandimento 100x.

Preparazione del vetrino batterico

Come preparare un vetrino da vedere? Metto acqua su vetrino, metto il batterio, asciuga all’aria; passo il vetrino sul fuoco per fissare il campione (le cellule si sfaldano e si attaccano sul vetrino), si colorano le cellule e a quel punto è osservabile al microscopio. Colonie batteriche sono composte da circa 10⁶ cellule. I batteri hanno una organizzazione cellulare procariotica.

Differenze tra cellula procariotica ed eucariotica

I componenti fondamentali delle cellule batteriche devono esserci sempre e sono:

• Cromosoma
• Citoplasma
• Membrana plasmatica
• Parete cellulare

I componenti accessori sono:

• Capsule
• Appendici (flagelli, pili)
• Plasmidi

Strutture fondamentali della cellula batterica

Cromosoma: contiene materiale genetico con disposizione circolare, DNA bicatenario. Ha solo una copia di cromosoma (tranne vibrioni e brucelle che ne hanno 2). È immerso nel citoplasma e si localizza nei nucleoidi (non vi è nucleo). Le diverse dimensioni del genoma nelle varie specie batteriche rispecchiano le diverse esigenze adattative del microrganismo e la sua diversa complessità strutturale. Nell'Escherichia Coli il cromosoma, se disteso, è più lungo del batterio stesso, quindi il DNA viene impacchettato per entrare nella cellula, quindi il DNA subisce superavvolgimenti; nel DNA rilassato viene introdotto un taglio (Nick) che, tramite la DNA-girasi (DNA topoisomerasi II), produce superavvolgimenti. Per replicare il DNA occorre che una parte di esso venga despiralizzato.

Citoplasma: è una matrice con 70% acqua, sali, zuccheri, amminoacidi, nucleotidi, vitamine, coenzimi e altri composti solubili. Contiene cromosoma, sistemi enzimatici e ribosomi (70s); può avere: plasmidi, corpi di inclusione (materiali di accumulo). I corpi di inclusione sono materiale accumulato per essere usato quando non è presente la sostanza in questione nell’ambiente. Non contiene mai: organuli rivestiti (RE, Apparato Golgi, ecc).

Ribosomi 70s: subunità principale (50s) e secondaria (30s), formate da proteine e RNA, 30s composta da 31 proteine e dal 16s rRNA.

Membrana plasmatica: doppio strato fosfolipidico. Ha una struttura trilaminare (sembra formato da tre strati). Serve come barriera selettiva: fa passare alcune sostanze. Non ci sono gli steroli, ma gli OPANOIDI (rendono membrana meno flessibile). Contiene molti tipi di proteine mono e multipasso; trasportatori transmembrana aiutano il trasporto delle molecole da una parte all’altra della membrana e possono essere di tre tipi:

• Uniporto: fanno passare una sola molecola alla volta tramite la membrana plasmatica
• Antiporto: trasportano due molecole diverse in direzioni opposte (una esce dalla cellula e una entra)
• Simporto: sono portare all’interno della cellula due molecole alla volta

Le proteine di membrana possono essere:

• Trasportatori (permeasi)
• Enzimi coinvolti nella replica del cromosoma
• Enzimi deputati alla secrezione di proteine (tossine o molecole coinvolte nella biosintesi di altre strutture cellulari come parete e flagelli)
• Proteine per il metabolismo energetico
• Sensori per parametri ambientali

Metabolismo energetico: nella cellula batterica l’energia viene accumulata sotto forma di un gradiente protonico di membrana (forza proton-motrice). Il gradiente protonico di membrana viene trasformato in ATP dal complesso ATPasi, che è associato al canale transmembrana e possiede un motore molecolare che trasforma il gradiente protonico di membrana in ATP. Fa entrare protoni all’interno della cellula che, essendo con carica, non potrebbero attraversare da soli la membrana.

Risposta agli stimoli esterni

La cellula batterica risponde agli stimoli esterni sfruttando proteine di membrana, per questo dette sensori ambientali; questi sono sistemi a due componenti: il primo è il sensore, ogni segnale avrà uno specifico recettore. Quando il recettore è autofosforilato allora è in forma attiva (prende il fosfato dall'ATP). Una volta fosforilato interagisce con un regolatore della risposta, che si trova nel citoplasma nella sua forma inattiva. Quando il recettore si lega al ricettore di risposta si attiva in quanto viene fosforilato. Facendo così il segnale dall’esterno della cellula viene portato internamente. Il ricettore di risposta è in grado di legarsi al DNA in sequenze specifiche; di fatto attiva o reprime l’espressione genica legandosi a specifiche sequenze (geni).

Esempi di sistemi regolati: assunzione di alcuni nutrienti come l’azoto, fosfato, ecc; risposta a cambiamento di pressione osmotica.

Parete cellulare

La parete cellulare è l’involucro più esterno della cellula batterica; sopra la parete può esserci la capsula. È responsabile della forma della cellula batterica, oltre ad essere essenziale per proteggere la cellula (resistenza da pressione osmotica); inoltre la parete cellulare è la sede di antigeni che reagiscono con anticorpi ed è la sede di vari fattori di virulenza (strutture che permettono al batterio di scatenare una risposta patogena). Antigeni: sostanze riconosciute dal nostro sistema immunitario.

Formata da peptidoglicano, molecola molto importante: è esclusiva delle cellule batteriche ed è un polimero rigido costituito da proteine e zuccheri. Essendo tipico delle cellule batteriche è il bersaglio ideale degli antibiotici, quindi una volta trovato l’antibiotico agirà solo su di esso uccidendo la cellula batterica. Gli antibiotici più usati in medicina sono farmaci in grado di inibire la formazione della parete batterica.

Parete batterica: esterna alla membrana plasmatica; i gram-positivi hanno molti strati di peptidoglicano nella parete, mentre i gram-negativi hanno solo uno strato di peptidoglicano più uno strato membranaceo che prende il nome di membrana esterna (presenta uno spazio abbastanza consistente che si chiama periplasma, nei Gram positivi è molto piccolo o assente).

Gram-positivi e Gram-negativi

Il nome deriva dal fatto che risponde in modo diverso alla colorazione di Gram; i gram-negativi risultano rosso, i gram-positivi diventano blu-violetto. Rispondono in modo differenziale perché hanno una parete strutturata in modo diverso. Colorazione: prendo vetrino con campione che verrà fissato al calore, le cellule batteriche restano attaccate al vetrino e quindi potrò colorarle. Il bagno del vetrino avverrà in un colorante cristal-violetto per 3 minuti; in una fase iniziale sia i gram-positivi che i gram-negativi sono violetti; dopodiché inserisco il vetrino in una soluzione che lega il cristal violetto (lo fissa) e usando un decolorante (alcol) sul vetrino per circa 30 secondi. I gram-negativi perdono completamente il colorante risultando incolore. I gram-positivi perdono colore solo negli strati esterni di peptidoglicano, attivando una reazione che chiude i pori della membrana fissando in questo modo il colore agli strati più interni della parete; per questo motivo risulteranno violetto. Aggiungendo un colorante di contrasto sui gram-negativi (fucsina) li rendono di colore rosa-rosso; in questo modo sono distinguibili al microscopio. I gram-positivi e negativi si differenziano anche in strutture e funzioni, oltre al fatto che reagiscono in modo diverso agli antibiotici. È molto importante sapere che tipo di batteri sono perché questo ne determina l’approccio terapeutico nella scelta del farmaco da somministrare.

Questo test della colorazione di Gram viene utilizzato per la diagnosi della meningite batterica, causata dal passaggio dei batteri nella barriera ematoencefalica e riescono ad arrivare alle nostre meningi (data da otiti, sinusiti, ferite alla testa). Una volta nelle meningi il batterio si divide e provoca una reazione immunitaria del sistema (vi è un rigonfiamento delle meningi impedendo che circoli il liquido cerebrospinale, detto anche liquor cefalorachidiano, con conseguente aumento della pressione intracranica, stato di incoscienza, mal di testa, irrigidimento del collo nella parte sotto il cranio, ecc). Il liquor viene prelevato tramite rachicentesi e processato nel laboratorio di microbiologia per poter determinare se la meningite è dovuta a infezione batterica o virale (batterica: molto grave con cause importanti, virale: più facile da gestire). Si procede con centrifugazione per raccogliere le cellule, si crea uno striscio con il sedimento e si effettua la colorazione di Gram; inoltre viene osservato al microscopio (liquor con infezione batterica è più torbido di quello dovuto a infezione virale). Il meningococco è uno dei pochi gram-negativi a forma di diplococco in una meningite, detto anche Neisseria meningitidis; lo streptococco invece si presenta nei batteri Gram-positivi. Altro fattore che mi fa sospettare l’infezione è la presenza numerica importante di cellule del metabolismo.

Non tutti i batteri hanno parete batterica: per esempio i micoplasmi non ce l’hanno; questo provoca il fatto che non ho farmaci che agiscono direttamente su loro, infatti sono detti resistenti agli antibiotici che agiscono sulla parete batterica; inoltre non sono colorabili con la colorazione di Gram. Riescono a sopravvivere grazie al fatto che contengono nella membrana plasmatica proteine e steroli che la rendono resistente e rigida; i micoplasmi appartengono alla classe Mollicutes (forma non definita e con involucro molle) e sono in grado di infettare molti organismi entrando nelle cellule dell’organismo ospite, il Mycoplasma pneumoniae colpisce l’uomo infettando le vie respiratorie sfociando in polmonite atipica (molto difficile da riconoscere e curare).

Struttura del peptidoglicano

Componente zuccherina con l’N-acetil glucosamina e N-acetil muramico (NAG e NAM) formano legami glucosidici beta 1-4 (il carbonio in posizione 1 del NAG si lega a quello in posizione 4 del NAM) tra loro formando delle catene glicaniche che comprendono da 10 fino a 80 monomeri; il lisozima del corpo ospite riesce a rompere questo legame e quindi riescono a rompere queste catene.

Per avere rigidità strutturale della parete batterica dei Gram-positivi la catena glicanica si affianca alla componente peptidica del peptidoglicano, composta da 4 amminoacidi legato al residuo di N-acetilmuramico: 4 amminoacidi sono in ordine: L-alanina, D-glutammico, L-lisina, D-alanina. La D-alanina è legata all’L-lisina sulla catena glicanica adiacente creando un ponte generalmente formato da 5 L-glicina (amminoacido).

La struttura della parete dei Gram-negativi è diversa; la struttura tetra peptidica cambia e avrà 4 amminoacidi: L-alanina, D-glutammico, Acido diaminopimelico, D-alanina. Il legame è diretto tra due strutture tetra peptidiche, non vi è la formazione di un ponte. Oltre al peptidoglicano, strutture importanti sono gli acidi teicoico e lipotelcoico (propri dei Gram +) che attraversano il peptidoglicano a cui si legano covalentemente (acido teicoico: polimero di glicerolo-fosfato e ribitolo-fosfato); i lipotelcoici arrivano addirittura a legarsi alla membrana plasmatica, oltre la parete del peptidoglicano. Questi acidi rappresentano uno degli strati più superficiali del microrganismo e generalmente sono riconosciuti dal nostro sistema immunitario; aiutano l’adesione delle cellule batteriche gram-positivi su alcuni substrati. La presenza di questi acidi crea una carica negativa sullo strato esterno della cellula, permettendogli di avvicinare sostanze (cationi) molto importanti per la cellula attratti dalla carica data dal gruppo fosfato degli acidi.

Ulteriori elementi importanti sono i polisaccaridi, diversi in base alle specie batteriche (quindi ne consentono la classificazione medica) e le proteine di parete che possono formare strutture fibrillari che sporgono dalla parete verso l’esterno; le fibrille di proteine M servono per l’ancoraggio delle cellule batteriche alla mucosa della faringe umana permettendone il processo patogeno.

LPS e la parete cellulare dei Gram-negativi

La parete cellulare dei Gram-negativi presenta un singolo strato peptidoglicanico con uno strato più esterno contenente uno strato fosfolipidico e lipopolisaccaride (endotossina; porzione di lipopolisaccaride, LPS); nello spazio periplasmatico sono contenuti tutti gli enzimi idrolitici che servono a scindere le macromolecole che passeranno poi attraverso la membrana per arrivare alla membrana plasmatica. Sono presenti anche lipoproteine che fanno da ponte tra lo stato di peptidoglicano e la membrana esterna. Nella membrana esterna ci sono proteine di membrana permeasi (OMP) con la funzione principale di permettere il passaggio di sostanze (compresi nutrienti, macromolecole e antibiotici) fino ai 7000 Dalton.

Endotossina (LPS) lipopolisaccaride: presente solo nei gram-negativi; ha una porzione idrofobica e una porzione idrofilica. Ha tre componenti principali:

• Lipide A: (porzione idrofobica, verso l’interno) contiene acidi grassi si trova attaccato alle N-glucosammina-fosfato (conferiscono carica negativa, importante per portare ioni all’interno del citosol). È la componente conservata, strutturale e tossica; è un ottimo attivatore della risposta del sistema immunitario
• Core polisaccaridico: abbondantemente conservata e si trova in modo diverso a seconda del batterio; è costituito da monomeri zuccherini e conferisce stabilità alla membrana
• Polisaccaride-O (guarda verso l’esterno): unità ripetute di monosaccaridi (20-50 unità variabili nelle diverse specie). Componente altamente variabile e antigenica

NB: L’endotossina è costituita dalla componente tossica (lipide A) e dalla componente antigenica (polisaccaride-O). L’endotossina (LPS) viene rilasciata dalla parete in caso di lisi batterica per intervento del nostro sistema immunitario durante un’infezione batterica. Esistono lipoproteine solubili (LPS-binding protein) prodotte da epatociti che legano il lipide A e attivano la risposta immunitaria; la LPS viene fagocitata dai macroregioni dopo cambiamento conformazionale e legame con il recettore CD14. L’attivazione della risposta infiammatoria provoca la vasodilatazione in corrispondenza della zona interessata in modo tale da facilitare il raggiungimento degli elementi del sistema immunitario per debellare o limitare l’infezione batterica.

Effetti fisiologici del rilascio massiccio di LPS

Quando più microrganismi entrano nel nostro sistema circolatorio il nostro sistema immunitario viene sovra-attivato e non riesce più a regolare normalmente l’afflusso di sangue ai vari organi. Le reazioni nel corpo in caso di rilascio massiccio di LPS includono:

• Ipotensione, shock
• Emorragia
• Insufficienza multiorgano (i diversi organi iniziano a non funzionare più correttamente portando allo shock settico)

Micobatteri

I micobatteri hanno una parete costituita da un singolo o multiplo strato di peptidoglicano contraddistinta dalla presenza di lipidi a lunga catena detti acidi micolici che rendono la parete cerosa, particolarmente impermeabile. Essa causa un’elevata resistenza ad antibiotici, disinfettanti, difese naturali ed una crescita lenta. I micobatteri non possono essere colorati e quindi distinti con la colorazione di Gram; per questo è utilizzata la colorazione di Ziehl-Neelsen che consiste in un procedimento diviso in più fasi: preparazione sul vetrino, applicazione della fucsina fenicata a caldo per 3-5 minuti. Per decolorare viene utilizzato un alcol acidificato; il colorante di contrasto è il blu di metilene (20-30 secondi). I micobatteri, per la natura della loro parete ricca di lipidi, assumono il primo colorante e non vengono decolorati dall’alcol acidificato, per questo motivo vengono anche detti anche: acido-alcool resistenti.

NB: L’agente eziologico della tubercolosi polmonare (malattia potenzialmente letale) è il Mycobacterium tuberculosis, un micobatterio acido-alcol notevolmente resistente all’essiccamento e a molti disinfettanti (resiste a lungo nell’ambiente). Localizzazione dei micobatteri nel parenchima polmonare.

Strutture accessorie della cellula batterica

Pili (Fimbrie): Strutture più corte dei flagelli che sono presenti solo in alcuni momenti della vita della cellula; appartengono sia ai Gram positivi che ai Gram negativi. Hanno una natura protei...