Metodologie Speciali in Chimica Farmaceutica

FORNO

Porta istantaneamente

in fase vapore tutto

l’eluato (molecole di

UGELLO DI USCITA DALL’ LC soluto + molecole di

Ultimo punto prima del passaggio solvente).

degli ioni verso l’orifizio di

ingresso ORIFIZIO DI INGRESSO

DELLO SPETTROMETRO

L’eluato arriva come spray all’interno del forno ed evapora completamente. Il passaggio in fase vapore di una grande

quantità di solvente toglie calorie e quindi raffredda perché serve tanta energia: la sorgente deve essere ben calda in

modo da determinare la vaporizzazione nel più breve tempo possibile). Per fare in modo che vada tutto in fase vapore,

il forno deve essere estremamente caldo 400-600°C. Solo le molecole in fase vapore riescono ad interagire tra di loro.

L’eluato esce dal forno in fase vapore. Sul cammino di uscita delle molecole dell’eluato è posto un ago che ha una

superficie della punta estremamente piccola. Se si applica una differenza di potenziale tra l’ago e l’orifizio di ingresso,

nella punta dell’ago c’è un’elevata densità di carica tale che, essendo estremamente piccolo, crea un flusso di elettroni

detto “scarica corona”. Questi elettroni vanno ad interagire con le molecole in fase vapore, ionizzandole.

Per definizione, in una soluzione, il solvente è il componente più abbondante. Gli elettroni vanno a ionizzare

preferibilmente il solvente e non il soluto, perché il soluto è presente in quantità molto minore rispetto al solvente. Il

solvente prende gli elettroni e si comporta come nella PCI: prima si ha una ionizzazione elettronica ma, siccome siamo

a pressione atmosferica e quindi le molecole interagiscono molto tra di loro, si crea poi un plasma reagente in cui le

+ -

specie interagenti sono tante ma in gran parte costituiscono gli ioni [M+H] oppure gli ioni [M-H] , dove M è il peso

molecolare del solvente. Sono sempre gli elettroni che catalizzano la reazione, ma il tutto avviene a pressione

atmosferica.

Il gas reagente è l’eluato che noi scegliamo, mentre la fase mobile è l’HPLC.

Il soluto, che si trova all’interno del plasma reagente, scambia il protone oppure perde il protone a seconda che si

abbia una ionizzazione positiva o negativa. Una volta ionizzato, il soluto viene aspirato dalla differenza di potenziale

che si crea all’orifizio di ingresso. Rimane comunque sempre una differenza di potenziale tra l’ugello di uscita dell’LC e

l’orifizio di ingresso dello spettrometro.

L’APCI è identica all’ESI ma in più possiede:

• un vaporizzatore che vaporizza tutto l’eluente

• gli elettroni vengono forniti dalla scarica corona e costituiscono il plasma reagente del solvente

• il plasma reagente trasferisce la carica al soluto

Vantaggi e Limiti dell’APCI

 ionizza le molecole non ionizzabili in ESI

 la ionizzazione avviene in fase vapore perché solo in fase vapore si ha interazione bimolecolare tra il plasma

reagente (= molecole di solvente attivate per reagire con il soluto) e il soluto stesso

 le sostanze devono essere volatili e stabili termicamente altrimenti non si possono né analizzare né vedere.

Devo essere stabili ad alte temperature perché, se si degradano, non si ionizzano

 come nell’ESI, gli eventuali processi di frammentazione possono essere controllati. Gli ioni che si formano in

ESI (= ione addotto) si ritrovano anche in APCI

 rispetto all’ESI, con l’APCI non possiamo generalmente avere ioni multicarica. Si tornano ad avere ioni

monocarica.

Per ioni multicarica: Più il valore di z aumenta, maggiore è la possibilità di monitorare e analizzare molecole

grandi (es: proteine). Si arriva fino a circa 200000 Da

Per ioni monocarica: il range di massa è compreso tra 50-1500 Da. Ci sono però poi gli analizzatori che lavorano

in limiti prefissati di range di massa. Anche se la sorgente è in grado di analizzare molecole grandi, non abbiamo

però un analizzatore per poterle separare. Molecole molto grandi e ionizzabili sono molto poche: più si

aumenta il peso molecolare e più la sostanza è termodinamicamente instabile

 è sensibile alla quantità di flusso di solvente. Più si diminuisce il flusso della cromatografia liquida, meno

plasma reagente si ha e quindi si ha meno possibilità di ionizzare il soluto. La cosiddetta “NANO LC” non

funziona in APCI ma può lavorare solo con l’electronspray

Ricapitoliamo…

Abbiamo interfacciato la GC con la massa e la sorgente è sottovuoto. Abbiamo visto la ionizzazione elettronica, le

biblioteche spettri e la possibilità di riconoscere un composto dal suo spettro di massa.

La ionizzazione elettronica è un’importa digitale perché va a rappresentare gli orbitali molecolari, i quali sono una

caratteristica propria di ogni molecola. La ionizzazione elettronica viene definita anche “hard ionization” perchè

utilizza troppa energia e, molto spesso, si perdono le informazioni sul peso molecolare della molecola stessa

Per avere informazioni sul peso molecolare si ricorre alla ionizzazione chimica che è una modifica della sorgente EI. La

ionizzazione chimica si basa sugli elettroni, ma solo come catalizzatori della reazione, perché produce il plasma

reagente. Con una reazione bimolecolare, la parte attiva del plasma reagente trasferisce la carica sull’analita, che viene

poi analizzato.

La ionizzazione elettronica lavora generalmente solo ioni positivi, a causa di caratteristiche strutturali. La PCI può

lavorare sia ioni positivi che ione negativi.

L’interfacciamento con la LC è stato per problema per tanti anni, per l’incompatibilità tra un sistema ad alta pressione

LC e un sistema a bassa pressione (= spettrometro di massa). Ciò è stato risolto portando fuori la sorgente, come in

electronspray. In electronspray si sfruttano diversi meccanismi simultanei di desolvatazione dell’eluato e, molto

spesso, si utilizza una reverse phase: la fase mobile è idro qualcosa (acqua+solvente), dove l’acqua è un dipolo e i soluti

sono polari, quindi sono già ioni. Non c’è bisogno di fornire energia per ionizzare i soluti, quindi l’unica cosa da fare è

“spogliarli” dal solvente. Una volta liberato, lo ione entra nello spettrometro (= entra nel sistema ad alto vuoto).

In questo caso, lo ione è diverso rispetto alla ionizzazione EI ma è più simile agli ioni addotto della PCI, in cui viene

+

addotta una parte del plasma reagente (H o la molecola intera).

In ESI non si può utilizzare la libreria spettri perché lo spettro in ESI è dipendente dal sistema e dalla fase mobile scelti.

In più, si tratta di uno spettro estremamente semplice: c’è lo ione addotto del molecolare e i vari ioni che si trovano

nell’intorno dello ione addotto. Non è dunque possibile sapere la struttura perché mancano gli orbitali molecolari.

La sorgente APCI è una modifica dell’electronspray. Va a coprire tutta quella gamma di composti che non vengono

ionizzati in electronspray: serve quindi per interfacciare la cromatografia liquida (LC) per quelle sostanze che non

possono essere analizzate in gascromatografia, perché sono termolabili.

CLUSTER ISOTOPICI

L’abbondanza isotopica naturale è una caratteristica fondamentale per l’interpretazione dello spettro di una qualsiasi

molecola. Analizzando uno spettro, si osserva la presenza di un numero sopra ogni picco: esso rappresenta il peso

della sostanza, o meglio, rappresenta una molecola ionizzata che di per sé sarebbe neutra.

Prendiamo come esempio, in tabella, il bromo. Il bromo ha un peso atomico pari ad 80 g/mol: questo valore non esiste,

ma esiste solo il 50% di 79g/mol e il 50% di 81g/mol. Allo stesso modo, Il peso molecolare, approssimato all’unità, di

un composto bromurato non esiste: il bromuro di metile CH Br ha un peso molecolare calcolato pari a 95g/mol, ma

3

questo valore non esiste. Infatti, ci sarà il 50% di 94g/mol e il 50% di 96g/mol. In uno spettro, avremo due segnali

distanti due unità l’uno dall’altro. Thompson e Aston scoprirono la composizione

elementare naturale degli elementi della tavola

periodica.

Il carbonio non è 12, ma circa l’1.09% è 13.

Il bromo si trova a 80 nella tavola periodica, ma

l’80 non esiste perché è 79 e 81, entrambi al 50%.

Dal punto di vista dello spettrometro di massa,

tutte le sostanze, che hanno il bromo, presentano

un segnale costituito dalla differenza di due m/z

tra i due segnali, i quali sono circa di uguale

intensità.

Il cloro si trova a 36 nella tavola periodica, ma il

36 non esiste perché è 35 e 37, rispettivamente al

76% e 24%, che sono le due unità di massa.

Il carbonio è presente in tutte le sostanze organiche.

Consideriamo la sostanza organica più elementare, il metano CH :

4  1 atomo di carbonio

 4 atomi di idrogeno

 Peso molecolare pari a 16 = 12(1) + 1(4)

Nello spettro di massa c’è anche 17 che siamo

essere presente all’1.1%, perché questo spettro

è riferito alla struttura del metano in cui è

13

garantita la presenza del C. 12 13

Se in natura si ha il 98.9% di C e l’1.1% di C,

considerando l’intera molecola del metano si ha

dunque il 98.9% del picco a 16 e l’1.1% del picco

13

a 17, perché deve contenere un atomo di C.

Consideriamo il decano C H :

10 22  10 atomi di carbonio

 22 atomi di idrogeno

 Peso molecolare pari a 142 = 12(10) + 1(22)

13

La probabilità, che ci sia almeno un C nella

struttura del decano, si deve moltiplicare per 10.

Ogni atomo di carbonio ha l’1.1% di probabilità

13 13

che sia C. il contributo isotopico del C è circa

l’11% = 1.1%*10 e corrisponde al picco 143

.

Consideriamo un ipotetico idrocarburo C H :

100 202  100 atomi di carbonio

 202 atomi di idrogeno

 Peso molecolare 1402 = 12(100) + 1(202)

Il segnale si è arricchito. La probabilità di avere un

13

atomo di C nella struttura è il 100% = 1.1%*100

atomi di carbonio.

Il segnale più alto non è infatti quello dovuto al

12

calcolo come C (1402), ma è quello riferito a

1403. Ciò è dovuto al fatto che con 100 atomi di

13

carbonio, la probabilità di avere un C nella

struttura è il 100%

La distribuzione isotopica naturale degli elementi comporta che i segnali di massa non sono quasi mai singoli, ma sono

sempre accompagnati dai cosiddetti segnali dovuti alla stessa struttura ionica ma con diverso contributo isotop