Metodologie genomiche e molecolari

METODO ENZIMATICO

Esso si basa sulla sintesi del DNA. Servirà quindi un templato, un primer, una polimerasi e inucleotidi. Per sintetizzare una molecola di DNA si deve formare un legame fosfodiesterico.

Sanger introdusse l'utilizzo di dideossinucleotidi, che possiedono un atomo di H in 3'. Una volta che l'enzima avrà aggiunto il dideossinucleotide, si bloccherà la sintesi in quanto non vi sarà un OH, ma un H e il legame fosfodiesterico non potrà formarsi. La reazione viene fatta con nucleotidi normali e dideossinucleotidi. Si prendono 4 provette e vi si aggiunge ad ognuno un dideossinucleotide (dd) diverso. Si otterrà una popolazione di frammenti di diversa lunghezza, dove la sintesi si è bloccata in corrispondenza di un dideossinucleotide. Il templato da mettere all'interno delle provette sarà a singolo filamento. Per visualizzare i dd, si può utilizzare l'isotopo radioattivo zolfo (il 25), non molto potente.

Per separare le bande si effettua un'elettroforesi. Il template deve essere denaturato e si può prelevarlo anche da un plasmide. Il primer dovrà essere forward all'inserto. Il plasmide verrà poi denaturato per sequenziare uno dei due filamenti attraverso alcali ad alta temperatura. Si possono sequenziare anche molecole lineari di DNA. Poi ci vorrà naturalmente una DNA pol. Le caratteristiche che dovranno avere saranno:

• elevata processività
• attività esonucleasica 3'-5'
• attività esonucleasica 5'-3'

Inizialmente si utilizzava il frammento Klenov, un enzima non molto processivo. Si decise quindi di utilizzare pol, che permettessero di fare sequenze più lunghe come la DNA pol del fago T7 (sequenase), o la taq pol. Per separare i vari frammenti, si utilizza un'elettroforesi su gel di poliacrilammide.

Ladenaturazione può avvenire attraverso temperatura di 65 gradi e un agente denaturante, l'urea. Si ottiene un gel, che deve essere seccato e messo su lastra radiografica. La sequenza si legge dal basso verso l'alto. Man mano che si va verso l'alto, le bande si comprimono sempre di più, perché esse migrano di una distanza del log del loro peso.

Sequenziamento a ciclo termico

I frammenti di Sanger possono essere ottenuti anche con l'utilizzo della taq pol all'interno di una PCR. Questa permette di avere un sequenziamento anche di piccoli frammenti e la temperatura può essere vantaggiosa per le regioni ricche di G-C. Queste sono difficili da denaturare e utilizzando la taq si facilita la denaturazione, evitando l'autoappaiamento. La reazione fatta con PCR, viene effettuata però con un solo primer.

7 novembre

Un'evoluzione successiva del sequenziamento, è quella di utilizzare fluorocromi e non isotopi radioattivi.

per marcare le molecole di DNA. Questo permette di fare la reazione con una sola provetta e non 4, semplicemente utilizzando una luce laser, la quale illumina le bande del gel elettroforetico. La lettura della sequenza viene fatta in modo automatizzato con apparecchi, che scorrono lungo le varie corsie e grazie all'azione di un detector, si è in grado di leggere l'emissione della fluorescenza. Questi dati raccolti dal detector vengono inviati ad un pc, dove vi è un software, che effettua un elettroferogramma. Questo detector registra le variazioni di fluorescenza come un picco e ad ognuno di essi viene associato un colore. Ad ogni picco viene poi associata una base. La sequenza di DNA perciò è determinata da un software in grado di interpretare le misure di fluorescenza registrate dal detector o rilevatore e di elaborale opportunamente. Le informazioni così vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso con aree

proporzionaliall’emissione di fluorescenza. All’inizio della sequenza spesso i picchi sono non interpretabili, inquanto vi sono picchi sovrapposti. Stesso problema si verifica verso la fine della sequenza. Questipicchi sono anche più deboli, perché l’efficienza di sintesi non è molto alta e perciò i frammentilunghi sono pochi, quindi l’emissione di fluorescenza sarà minore. Altri problemi che possonoinsorgere sono le così dette compressioni, visibili sia in radioattivo, che in fluorescenza. QuesteC, dove è favorito l’autoappaiamento. Questo crea un problema siasono regioni ricche di G edurante la sintesi, sia durante la risoluzione del sequenziamento. Le bande in questo caso perciò,risultano accavallate tra loro. Per risolvere questo problema, oltre all’utilizzo di PCR, bisognasequenziare anche il filamento complementare, l’antisenso. Con il metodo Sanger si possonoottenere letture di

Circa 1000bp con un'accuratezza del 99,9%. Il sanger ha subito dell'evoluzioniriguardanti l'utilizzo dell'eletteroforesi. Si utilizza quindi, un'elettroforesi più efficiente comel'elettroforesi capillare. Questi avanzamenti tecnologici sono stati il risultato della corsa alsequenziamento dei genomi come quello umano. Durante questa fase di ricerca in biologia, si ècreata la necessità di ottimizzare al massimo il sequenziamento, per ottenerlo su il maggiornumero di sequenze. Il gel è stato sostituito da capillari lunghi anche 80 cm, dal diametro di0,1mm. Il concetto della separazione è uguale a quello di un normale gel elettroforetico. Grazie aquesta tecnica, si possono sequenziare più campioni contemporaneamente. I campioni partonodalla piastra, effettuano elettroforesi nel capillare e poi passano in una parte della macchina, cheeffettua il sequenziamento attraverso un laser. Questo macchinario è poi

PIROSEQUENZIAMENTO

Un altro problema che insorge, è il riuscire a sequenziare tantissimo DNA in poco tempo. Si ha così il next generation sequencing che aumenta il numero di sequenziamento in parallelo (massive parallel sequencing). In questo caso però non si può far uso del metodo sangue dell'elettroforesi, anche capillare. Si utilizza invece, il pirosequenziamento. Esso si basa sulla rilevazione del pirofosfato, rilasciato dall'incorporazione di un nucleotide durante la sintesi del DNA. Ogni volta infatti, che viene aggiunto un nucleotide ad un filamento, si libera pirofosfato, che però è poco visibile. Per renderlo tale, lo si trasforma per mezzo della ATP sulfurilasi in una molecola di ATP. Per visualizzare la produzione di ATP si ricorre alla luciferina. La luciferasi

infatti, utilizzava la luciferina e l'ATP come substrati per emettere luce. Il pirosequenziamento misura il lampo di luce dopo l'aggiunta di un singolo nucleotide. La reazione viene quindi misurata nucleotide per nucleotide. Come funziona tutto ciò? Si parte da un primer e uno stampo. Si mette alla DNA pol, l'apirasi, l'ATP sulfirilasi e la luciferasi con un nucleotide. Se questo non viene incorporato, non si ha formazione di pirofosfato e di conseguenza si ha l'emissione di luce. L'apirasi ha il compito di degradare i nucleotidi non incorporati dalla DNA pol. La reazione è automatizzata e avviene in tempi brevissimi. Ogni emissione di luce viene registrata infine dalla macchina. Il dATP è un substrato della luciferasi e normalmente questa lo utilizzerebbe per ossidare la luciferina. Ecco che quindi, non si può aggiungere dATP come base in quanto tale. Si aggiunge quindi un analogo del dATP, deossiadenosina alfa tio-trifosfato.

Che non fa emettere luce. Come si fa a sequenziare un genoma con questa strategia? Non si può sequenziare molecole giganti di DNA, ma lo si deve frammentare meccanicamente attraverso nebulizzazione. Si forzano delle molecole di DNA a passare in un qualcosa, che crea goccioline di DNA (si, lo ha detto). Questi piccoli frammenti vengono amplificati attraverso la PCR. A questi frammenti vengono poi aggiunti dei primer artificiali diversi tra loro attraverso una ligazione. Bisogna però selezionare quei frammenti, che possiedono all'estremità primer diversi e questo lo si fa attraverso una cromatografia per affinità. Per separare i frammenti per effettuare la PCR, bisogna utilizzare delle microsferette di 28 micron. Queste possiedono sulla loro superficie sequenze complementari ad uno dei due primer. Si riuscirà quindi a far attaccare la singola molecola ad una singola sferetta, isolandola dalle altre. Tutto ciò è ottenuto tramite un'emulsione.

registra i vari picchi di luce, per i migliaia di pozzetti presenti. Il risultato è la misurazione dei lampi di luce e non un elettroferogramma. I picchi non sono tutti della stessa intensità, perché filamenti con solo la stessa base, emetteranno un picchi più alti.

SEQUENZIAMENTO DEL GENOMA UMANO

Il progetto del sequenziamento del genoma è partito nel 1990, all'inizio del mese di ottobre. Però le tecniche non erano così avanzate, come quelle odierne. Si era pensato che il progetto dovesse finire nel 2003, 50^o anniversario della pubblicazione della struttura del DNA. Questo era il primo progetto corale, che prevedeva la collaborazione di più laboratori e più stati. Inizialmente sono stati coinvolti R. Sisheimer, R. Dulbecco e C. Delisi per un costo stimato di 3 miliardi di dollari. Gli obiettivi prefissati erano identificare tutti i geni del genoma umano, sequenziare i 3x10^9bp del genoma umano, sviluppare dei database per