Metodologie genomiche e molecolari

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METODOLOGIE GENOMICHE ZAPPAVIGNA- 2018/2019

3 ottobre

Estrazione DNA da batteri- strategia generale

• una coltura di batteri viene fatta crescere e viene raccolta: in una beuta viene fatta una

terreno di coltura. In seguito la beuta viene messa all’interno

coltura batterica attraverso un

di uno shaker termostatato a 37 gradi(la temperatura è relativa al ceppo più utilizzato

escherichia coli).

Il mezzo di coltura può essere diviso in due grandi categorie:

- M9= contiene sali e solo elementi essenziali. Viene anche chiamato terreno minimo

definito

- LB(Luria-Bertani)= terreno con triptone, ottenuto da una proteolisi della caseina attraverso

tripsina e altri aa, estratto di lievito con vitamine, coenzimi ecc… Di questi componenti però

non sappiamo la concentrazione di ogni elemento. È un terreno massimo, cioè ricco.

Il secondo terreno viene utilizzato maggiormente.

La coltura poi, viene fatta passare all’interno di uno shaker per farla crescere in condizioni

aerobiche. I batteri vengono fatti crescere fino ad una certa densità. Essi proliferano in

maniera esponenziale fino a quando non si raggiunge un platou nella curva di crescita. Per

determinare il numero di batteri in una coltura liquida si utilizza la spettrofotometria, che va

a valutare la densità. Lo spettrofotometro va a calcolare l’assorbanza, ovvero quanta luce

oltrepassa il campione avente una certa densità batterica. Nello spettrofotometro abbiamo

una sorgente di luce, uno spazio per il campione e un misuratore di luce. Le provette

rettangolari, in cui viene poa

sto il campione, vengono chiamate cuvette e possiedono uno spessore di 1cm. La luce di

600 nm perciò, attraversa questo spessore. Sono state costruite delle curve standard e si

sa che ad ogni densità ottica equivale una certa densità batterica.

Per estrarre il DNA plasmidico si deve eliminare la parete, con l’utilizzo del lisoenzima, il

quale scinde i polisaccaridi della parete. Il tutto viene fatto in una soluzione di saccarosio,

per mantenere una certa isotonicità della soluzione(la cellula in questo caso potrebbe

esplodere). Si ottengono così, degli sferoplasti, cellule che perdendo la parete, sono

divenute sferiche. La lisi viene attraverso un detergente come il triton x-100(detergente non

ionico, che non denatura la proteina), in cui si ha la rottura della membrana plasmatica. A

questo punto le componenti si separano attraverso il peso molecolare, tramite

centrifugazione. Si ha così una sedimentazione delle molecole più pesanti a formare il

pellet e nel sovranatante si troveranno le molecole più piccole.

Le cellule sono rimosse e rotte per ottenere un estratto cellulare. Il sovranatante conterrà

non il plasmide intero, ma DNA plasmidico, RNA e proteine. Nel pellet vi sarà invece, il

cromosoma batterico

purificazione del DNA dall’estratto cellulare:

• si andranno a eliminare i

contaminanti che non ci interessano, oppure potremmo separare ulteriormente il DNA dai

contaminanti.

Un modo per eliminare proteine nel sovranatante è l’estrazione con solventi organici.

Questa tecnica viene attuata con una miscela 1:1 di fenolo e cloroformio. Questi non si

mescolano con le soluzioni acquose, ma se messi a contatto ed emulsionati con queste,

sono in grado di creare un’emulsione composta da una fase acquosa e una organica. Le

proteine tenderanno a precipitare dopo centrifugazione. Alla fine otterremo una fase

acquosa, un’interfaccia tra la fase acquosa e organica e si avrà un precipitato bianco, dato

con all’interno RNA e DNA plasmidico.

dalle proteine. Si recupera quindi, la fase acquosa

Un’altra strategia di separazione è data dalla centrifugazione in gradiente di densità. Per

attuare questa separazione con elevato grado di purificazione, si utilizza una ultra

centrifuga. Il DNA e le altre componenti in questa tecnica presentano diversa densità. Il

bromuro di etidio viene utilizzato per alterare la densità del DNA. Se si prende un DNA

batterico cromosomico e il plasmide e li si pongono a contatto con una soluzione di

bromuro di etidio, si notano delle differenze di densità. Il DNA batterico viene denaturato

abbassandone la densità. Il DNA plasmidico, invece, è in grado di catturare meno etidio

bromuro e la sua densità sarà maggiore rispetto a quello cromosomico. Per creare un

gradiente di densità nella provetta si utilizza cloruro di cesio, che viene centrifugato. La

densità sarà maggiore nel fondo della provetta e via via sempre minore fino a raggiungere il

tappo. Mescolando gli estratti di DNA, si noteranno delle bande: una più bassa

corrispondente al DNA plasmidico e una più leggera corrispondente al cromosomico. Le

proteine risulteranno essere in alto. Si recupera poi, attraverso una siringa per mezzo di un

buco sulla provetta, la banda più pesante. All’interno di questa banda però, non vi è solo il

plasmide, ma anche il bromuro di etidio e il cloruro di cesio, che dovranno essere eliminati.

Il bromuro di etidio si estrae con un solvente organico(il bromuro di etidio in un solvente

organico, passa dalla fase acquosa a quella organica) e il cloruro di cesio invece attraverso

la dialisi. In quest’ultima è presente una membrana di dialisi in cui viene messa la soluzione

di cloruro di cesio e DNA plasmidico. Il sacchettino da dialisi(membrana di dialisi) funge da

setaccio e viene posto in un litro di tampone, facendo passare solo il cloruro di cesio. Nel

sacchettino perciò, rimarrà solo DNA plasmidico.

Vi è anche un’altra strategia: quella della lisi alcalina. Questa tecnica prevede una rottura

dei batteri in un tampone, che grazie alla presenza di NaOH, rende basica la soluzione. Si

separano perciò, facilmente le due eliche. Il DNA plasmidico ha più facilità,

successivamente, a rinaturarsi. Si riporta infatti il pH alla neutralità. Il DNA cromosomico

non riesce a rinaturarsi, formando un grosso aggregato a seguito di centrifugazione. Il DNA

plasmidico si rinatura invece, rimanendo in soluzione. Esso infatti, a seguito di

centrifugazione, rimane sul surnatante.

• concentrazione del DNA: viene effettuata attraverso disidratazione delle molecole

di DNA e permettere la loro precipitazione. Questa tecnica utilizza anche sali, per

neutralizzare le cariche negative del DNA in moda da facilitarne l’aggregazione. Si

aggiungono poi, almeno 3 volumi di alcool. Le molecole di DNA si disidrateranno e con

andranno a costituire il pellet. L’etanolo, invece sarà presente nel

centrifugazione

sovranatante. Il plasmide viene risospeso in soluzione di 10mM tris Hcl e 1mM

ETDA(elimina ioni magnesio per proteggere il DNA dall’attacco di enzimi) e trattato con

RNAsi per eliminare le molecole di RNA

• purificazione del plasmide mediante cromatografia a scambio ionico: si utilizza

una resina carica positivamente, chiamata DEAE, per catturare DNA carico negativamente.

La resina appare come delle sferette, che vengono aggiunte all’estratto. La resina tratterrà

il DNA plasmidico e dopo un lavaggio si elimineranno i contaminanti. Si avrà poi

un’eluizione, per recuperare il DNA plasmidico, staccandolo dalla resina.

Altro trucco basato sulla cromatografia, è la guanidina-tiocianato. Questa sostanza è

denaturante per le proteine. Il DNA rimane intatto a contatto con questa sostanza e

possiede un’affinità particolare per sferette di silicio(vetro). Il dna perciò, rimane attaccato

si fa un’eluizione del

alle sferette e i contaminanti vengono lavate vie. Successivamente

DNA recuperato, staccandolo dalle sferette. Il DNA risulterà essere sul fondo della provetta.

CLONAGGIO

Tra i vettori di clonaggio non troviamo solo plasmidi, che non riescono ad ospitare molecole troppo

grandi in quanto diverrebbero instabili, ma anche PAC, COSMIDI e BAC. Lo sviluppo di questi

vettori ad alta capacità di ospitare molecole così grandi, è stata necessaria per costruire librerie

genomiche.

L’estrazione di frammenti di DNA dal gel dopo averlo digerito con enzimi di restrizione e separato

con elettroforesi può avvenire brutalmente tagliando direttamente il gel. Per separare il DNA

dall’agarosio si può fare:

• elettroeluizione

• colonne a scambio ionico

• agarosio a basso punto di fusione low melting: temperatura che scioglie agarosio in

modo da non denaturare il DNA.

LIGAZIONE

Per effettuare la ligazione,viene utilizzata una ligasi(non fa riparazione del DNA) che lega filamenti

anche non coesivi, quella del fago T4. La t4 DNA ligasi utilizza ATP per creare il legame

fosfodiesterico(foto slide). Il vettore però, può anche richiudersi su se stesso, perciò bisogna

favorire la reazione di ligazione. Si può attuare ligazione con un rapporto molare tra vettore e

inserto a favore di quest’ultimo(più inserto rispetto al vettore). In questo modo si aumenta la

probabilità che esso non si chiuda su se stesso. Per far questo si tiene conto del peso molecolare

del plasmide e dell’inserto.

Es: rapporto 1:6

plasmide PM=990000

inserto PM= 495000

moli plasmide in 10 ng: 10/990000= 0,01 pmoli

per avere un rapporto 1:6 mi servono 0,06 pmoli di frammento

quanti ng di frammento userò per la ligazione?

0,06x495000=30 ng

dim ins/dim vettore x molecole ins/molecole vettore x quant. Vett.(ng)= quanto inserto (ng)

Per favorire la ligazione esiste un altro trucco, dato dalla fosfatasi alcalina. Se si prende un vettore,

tagliato con Ban, esso presenterà dei gruppi fosfati in 5’. Eliminando quest’ultimi, il vettore non

potrà richiudersi in assenza dell’inserto.

10 ottobre

La ligazione può avvenire tra estremità piatte, anche se non è favorita. Questo è possibile grazie

alla T4 DNA ligasi. Si possono rendere anche blunt delle estremità non coesive, attraverso una

DNA polimerasi. Essa però, è modificata, è il frammento Klenow in grado di sintetizzare in

direzione 5’-3’ senza però avere attività esonucleasica. Mentre nelle 5’ protrundenti la sintesi è

facile aggiungendo solo l’enzima e la polimerasi, quelli in 3’ necessitano della rimozione dei

fagica, ovvero la T4 DNA pol(con attività 3’-5’

nucleotidi, utilizzando una polimerasi di origine

esonucleasica). Essa in assenza dei nucleotidi degraderà i nucleotidi presenti nel filamento,

rendendo l’estremità blunt. Ai siti di restrizione, facendo queste manipolazioni, succede che non si

è possibile separare il vettore dall’inserto). Altro modo per adattare inserti con

ricostituiranno(non

un certo enzima di restrizione ad vettori tagliati con altri enzimi, è l’utilizzo di linker. Solitamente

sono oligonucleotidi vendibili da ditte. Saranno perciò oligonucleotidi blunt non fosforilati. La prima

cosa da fare quindi è fosforilare in 5’ utilizzando una nucleotide chinasi. Si può quindi legare questi

linker, aventi siti di restrizione, alla molecola. Essendo questi linker piccoli, è molto probabile che

non si attacchino solo 2 molecole di linker una a valle e una a monte dell’inserto, ma si originano

concatameri. Queste unità concatenate vengono tagliate attraverso gli enzimi di restrizione. Perciò,

si otterrà un inserto con ai lati i linker. Questa tecnica può essere utilizzata per il sequenziamento

di geni sconosciuti. In una tipica ligazione perciò, abbiamo mescolato un DNA con enzima di

restrizione e un inserto. Abbiamo 3 situazioni:

• richiusura del vettore su se stesso.

Ligazione dell’inserto

• può legarsi tra se stesso e formare un concatamero. Il batterio in

• anche l’inserto

questo caso non trasformerà questo inserto.

TRASFORMAZIONE

Alcuni ceppi batterici possiedono la capacità di internalizzare il DNA dall’ambiente. Questa

capacità non è normale, perchè i batteri in natura solitamente si scambiano DNA attraverso

coniugazione. Se in natura avviene trasformazione, questa si verifica verso la fine della fase di

crescita esponenziale. Divengono perciò, questi batteri competenti. La competenza naturale è però

statisticamente molto bassa e rara. Per far fronte a questo si è pensato di lavorare sulla

competenza, aumentandola attraverso il trattamento di calcio cloruro verso la fine della fase

esattezza. L’unica cosa che di cui si

esponenziale. Ancora però, non si sa il meccanismo con

hanno certezze è che il calcio cloruro aumenti l’adesività del DNA alla superficie del batterio e che

probabilmente faccia aprire dei pori nella parete per aumentare l’entrata. Successivamente è stato

fa un’incubazione molto breve( 1min e mezzo) a 42 gradi(temperatura heat

scoperto che se si

shock) dopo il trattamento con calcio cloruro, si favorisce l’internalizzazione. Questo risulta essere

un metodo chimico, ma ne esistono altri. Il metodo però del calcio cloruro non possiede

un’efficienza di trasformazione molto alta.

Oltre a E.coli esistono altri ceppi, che sono stati modificati in laboratorio per effettuare queste

manipolazioni. Tra i più comuni ceppi di E.coli di laboratorio:

• DH5alfa: permette alfa complementarizzazione. Infatti produce una beta

galattosidasi non intera. Possiede un’altra mutazione nel gene recA, sono perciò

ricombinazione difettivi(non attuano ricombinazione). Questo permette stabilità nel

plasmide. DH5alfa viene utilizzato, perché riesce ad ottenere delle efficienze di

trasformazioni da 10^6 a 10^9 cfu\microgrammo

• XL1Blue: mutazione in galattosidasi e recA

• INV110: possiede sistemi di metilazione(codificate dal genoma batterico), in grado di

aggiungere CH3 in corrispondenza di alcune zone del DNA. Alcuni enzimi di restrizioni non

riescono ad agire se sono presenti dei dam. Questi ceppi sono difettivi di tali sistemi.

Finito lo shock termico, il gene portato dal plasmide deve esprimersi. Per far fronte a questo deve

massimo e in seguito si fa un’incubazione. Si da al batterio

essere aggiunto del nuovo terreno

tempo per produrre tale enzima. Poi si attua una piastrazione in un terreno solido. Esso è un BL a

cui viene aggiunta l’agar per renderlo semi-solido.

è l’elettroporazione.

Altra tecnica per rendere i batteri più competenti Questa permette di fare pori

nella parete batterica, attraverso una scossa elettrica. Quindi possiamo dire che questo metodo

risulta essere fisico. Questo trattamento però, uccide la maggior parte dei batteri, ma i

sopravvissuti possederanno il vettore. Nei metodi chimici più le molecole da internalizzare erano

grandi, minore era l’efficienza. Con questa tecnica però, la dimensione non influenza l’efficienza.

Infatti nel tempo, si è sempre di più avuta la propensione ad aumentare la dimensione degli inserti.

Il macchinario utilizzato è un’elettroporatore, con una specie di trappolina in cui verrà posto il DNA.

Inoltre sono presenti degli elettrodi. Per far questo si utilizzano cuvette con all’interno elettrodi di

metallo.

CLONAGGIO

A questo punto abbiamo ottenuto delle colonie su una piastra. Se abbiamo utilizzato colonie

bianche e blu, la visione del clonaggio è più facile e bisogna solo capire se non siano presenti falsi

positivi. Per far questo si utilizzano le miniprep(preparazione su piccola scala). Ogni colonia viene

trasferita in una provetta con 3 ml di terreno con all’interno antibiotico. In queste si fanno crescere i

batteri per una notte. Queste mini colture risulteranno essere torbide. La restante parte di coltura

viene riutilizzata, perché una volta estratto il DNA e si è verificato che esso derivi da batterio

ricombinante, si può riutilizzare. Dalle provette attraverso lisi alcalina si recupera il DNA. In una

seconda provetta otterremmo 2 microgrammi di DNA plasmidico. Si utilizzeranno gli enzimi di

restrizione e si fa una corsa elettroforetica. Nella corsia 1 abbiamo uno standard molecolare e nelle

altre corsie vari DNA. Nel caso in esame nella corsia 2 abbiamo solo la banda del vettore, sarà

Nella corsia 3 abbiamo un plasmide non digerito dall’enzima

perciò una colonia non ricombinante.

di restrizione. In questa si avranno 2 bande, essendo sia lineare che superavvolto. Nelle corsie 4-

abbiamo solo l’inserto e il vettore vuoto. Solo quest’ultime corsie avranno il plasmide

5-6 clonaggio non orientato dell’inserto.

ricombinato. Questo è un È desiderabile però, in alcuni casi,

clonaggio orientato dell’inserto.

fare un Il pcDNA3.1 possiede un pCMV(promotore virale) e siti di

restrizione. Noi dobbiamo inserire un cDNA, quindi si deve orientare l’inserto rispetto al vettore.

Per far questo si utilizzano 2 enzimi diversi di restrizione per clonare un cDNA, possedente una

direzione di trascrizione. Questi enzimi sono HindIII e EcoRI, che fanno si che il vettore non possa

mai richiudersi su se stesso. Le estremità risultano essere incompatibili. Si aggiunge poi, l’inserto,

che non può inserirsi se non nell’orientamento giusto. Si ha perciò, un clonaggio forzato, in cui si

forza l’inserto a inserirsi in una determinata posizione. Si effettua poi una miniprep con digestione

doppia e si fa un’elettroforesi per verificare che le colonie siano ricombinanti. Le colonie

ricombinanti posso venire fuori se il vettore risulta essere digerito solo da uno dei due enzimi di

restrizione. È possibile anche identificare dei trasformanti anche se il clonaggio non è forzato. Se

noi abbiamo un frammento tagliato con bgM, l’inserto può orientarsi in due modi. Per verificare

quale sia l’orientamento giusto e che quindi siano ricombinanti, si ricorre ad un altro enzima di

restrizione sapendo la mappa del nostro inserto. Questo ci permette di cap