Metodologie Analitiche Avanzate - Appunti parte 2

Metodologie analitiche avanzate

Lezione 11

In testa alla colonna è presente un filtro (FRIT) per evitare che vi sia fuoriuscita di fase fissa e ingresso di eventuali impurità in colonna. Spesso la pressione di lavoro aumenta nel tempo e la colonna inizia a "tapparsi" a causa delle impurità, per cui si può lavare con solventi forti in direzione del flusso oppure si può montare incontro flusso, cercando di non far uscire anche la fase fissa.

Le colonne analitiche sono quelle più usate: possono per esempio avere diametro di 4,6 mm e materiale impaccante 5µ, flusso di fase mobile di 1ml/min; vi sono diverse varianti di queste colonne sia per quanto riguarda le fasi fisse che la geometria della colonna, in termini di granulometria di materiale impaccante e diametro.

L’altezza del piatto teorico H dipende dal diametro del materiale impaccante: H 2,5dp (diametro delle particelle impaccanti). Si passa perciò da fasi stazionarie sempre più piccole, passando da 5µ a 3-1,8µ che diminuiscono H (e quindi dp) e aumentano N dando separazioni migliori. Nel diminuire dp aumenta però la contropressione: considerata una colonna con un dato flusso e una certa pressione di lavoro, se si riducono le particelle all'interno, per mantenere lo stesso flusso e permettere lo scorrimento della fase mobile bisogna aumentare la pressione di lavoro; sono state introdotte, con lo sviluppo di fasi fisse a granulometria più piccola, nuove pompe per HPLC in grado di sopportare alte pressioni di lavoro.

Attuali necessità in campo analitico

Le separazioni più veloci e più efficienti possibili:

• Preparazione del campione più efficiente
• Analisi brevi ma riproducibili nel tempo con risultati affidabili

Le nuove colonne hanno una granulometria più fine del materiale impaccante ma sono più corte perché la pressione di lavoro dipende dalla lunghezza della colonna in modo direttamente proporzionale. Si sono perciò introdotte colonne da 3-5 cm che comportano analisi molto più rapide, tenendo presente che la lunghezza L è direttamente proporzionale a N, e si parla di Ultra-Fast Chromatography, estensione della HPLC.

La risoluzione è il grado di separazione tra due analiti e si calcola direttamente dal cromatogramma: R = ∆t / media ampiezze picchi; la risoluzione, nel caso di una separazione non buona, dipende da 3 parametri: N, α e K. In particolare: R = √N/4 ma N∝L/H dove H dipende da dp quindi N L/dp; essendo le fasi fisse costituite da diametro sempre più piccolo N sarà grande ma L deve diminuire essendo correlato alle pressioni di lavoro, per cui si riduce il valore di L e di N.

Al diminuire del diametro delle particelle H diminuisce ed è necessario lavorare a valori di flusso corrispondenti ad H minimo: in prossimità di H minimo, osservando il grafico verso destra si osserva che H minimo non aumenta, per cui si può lavorare a flussi più elevati effettuando analisi più veloci, da cui l’Ultra-Fast Chromatography.

Il limite del flusso dipende dai rivelatori usati: per esempio accoppiando l’HPLC allo spettrometro si osserva che lo spettrometro lavora sottovuoto per cui non è compatibile con certi flussi elevati.

Fasi polimeriche

Le fasi legate sono per lo più a base silicea (ponti silossanici Si-O-Si all’interno e all’esterno gruppi silanonici OH) che vanno incontro a reazioni di derivatizzazione: tuttavia non tutti i gruppi –OH vanno incontro a questa reazione, per cui si effettua un END-CAPPING in cui si aggiungono piccoli gruppi Si-CH₃-CH₃-CH₃ per schermare solo alcuni dei gruppi –OH.

Le nuove fasi fisse usano gruppi laterali più ingombranti ramificati (diisobutile o diisopropile al posto del metile) in modo che i gruppi –OH rimangono schermati dietro questi gruppi laterali del silicio.

In commercio sono presenti fasi impaccanti che sfruttano sia le proprietà della silice che della fase polimerica: la silice è una fase molto robusta ma presenta dei limiti tra cui il raggio del pH limitato tra 2 e 9; la fase polimerica, su cui vengono fissate le fasi legate, ha un range di pH maggiore tra 1 e 14 ma ha una minor durata, è meno resistente e meno stabile. Sono state perciò introdotte particelle di silice alternate a particelle di polimero ottenendo particelle ibride con vantaggi e svantaggi di entrambe le fasi.

A pH elevati la silice può essere erosa, per cui in alternativa sono state introdotte le colonne Gemini C: la Gemini è una colonna dove nelle particelle al posto dei ponti silossanici vi è un legame Si-CH₂-CH₂-Si che resiste bene agli attacchi dell’ambiente acido e si alterna agli strati di particelle classiche.

Fasi fisse recenti

Le colonne monolitiche non contengono le singole particelle di silice C₁₈ ma una struttura continua di silice che riempie tutta la colonna; questa superficie presenta dei macropori che percorrono tutta la colonna permettendo lo scorrimento del soluto lungo tutta la colonna, e dei micropori (mesopori) che facilitano e migliorano il trasferimento di massa del soluto e la sua interazione con la fase fissa. Queste colonne hanno lo svantaggio di essere meno resistenti rispetto alle altre.

HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography) è una modalità di lavoro che è diversa rispetto alla RP e NP. È caratterizzata da una fase fissa polare, quale può essere per esempio la silice SiOH-SiOH, oppure silice con gruppi legati con catena apolare e testa polare noti come ZIC-HILIC.

I gruppi polari escono fuori dalla silice e le fasi lavorano in ambiente acquoso perché l’acqua è molto polare, per cui lo strato di acqua interagisce con la fase fissa. Per la separazione si usano composti polari perché in fase inversa apolare hanno scarsa tendenza a fermarsi in colonna, per cui ciò che non viene separato in colonna può:

• Essere analizzato in fase normale, ovvero fase fissa polare e fase mobile apolare
• Essere separato con la HILIC, con fase fissa polare e fase mobile polare.

L’acqua in questo caso diventa il solvente polare forte perché è in grado di portare i soluti polari al di fuori della colonna, mentre metanolo/acetonitrile/THF diventano i solventi deboli.

In fase inversa invece si parte da alte concentrazioni di solvente debole (acqua) e per creare un gradiente si aumenta man mano la concentrazione del modificatore organico (metanolo/acetonitrile/THF) perché essendo meno polari dell’acqua portano fuori i soluti polari legati a C₁₈; il metanolo è il più polare ed è meno forte dell’acetonitrile che è poco più apolare.

Nell’HILIC si usa una fase inversa invertita, perché il solvente è polare come nella fase inversa ma è invertita la modalità di eluizione: non si aumenta più nel tempo il metanolo/acetonitrile/THF ma si aumenta la concentrazione dell’acqua per far uscire dalla colonna i composti fortemente polari.

Tecniche cromatografiche per l’analisi di proteine

• IEC: le proteine, in base ai loro punti isoelettrici, possono essere portate in condizioni di pH tali da essere presenti in forma cationica o anionica, dopo di che si decide se analizzarle con cromatografia a scambio ionico.
• HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography)
• Cromatografia di immunoaffinità
• Elettroforesi capillare
• Size exclusion chromatography, dove le proteine vengono separate su base dimensionale mediante fasi fisse che presentano pori di varie dimensioni.

Cromatografia a fase inversa

La cromatografia a coppia ionica è basata su una colonna C₁₈ (C₄ o C₈) un composto carico non può essere analizzato perché verrebbe eluito subito, per cui si sfrutta la formazione di coppie ioniche dove nella fase mobile si introduce un accoppiatore di segno opposto che forma con la specie carica un composto neutro che può essere analizzato in C₁₈ e può essere trattenuto da una colonna in fase inversa.

Si usa come accoppiatore SDS (catena a 12 atomi di C con testa apolare e testa polare) nei confronti dei cationi.

Cromatografia a fase inversa di proteine e peptidi: per i peptidi si usano colonne C₈/C₁₈; se le proteine hanno una grande porzione idrofobica vengono trattenute molto in colonna per cui si utilizza una fase legata con una catena più corta (C₄/C₂).

Il materiale impaccante va da 5 a 7µ ed è importante valutare la porosità delle particelle impaccanti: per separare bene composti ad alto peso molecolare si usano porosità maggiori del materiale impaccante (intorno ai 300Å) in quanto il poro fa sì che la molecola entra meglio a contatto con la fase fissa; la lunghezza della colonna e i diametri possono assumere vari tipi di valori.

Per fermare la proteina in fase fissa si aggiunge un controione come l’acido trifluoroacetico TFA, acido più forte dell’acido acetico con pK più basso che si deprotona; il TFA viene aggiunto alla fase mobile e al campione di proteine di analisi, gli ioni H⁺ portano il pH intorno a 2 e protonano la proteina che presenta i gruppi amminici protonati, ma protonano anche tutti i gruppi silanonici residui. È importante che il pH non scenda al di sotto di 2 che è il limite di uso delle colonne su base silicea e può causare idrolisi fase fissa; tuttavia la proteina protonata non si fermerà in C₁₈, per cui il TFA fa da controione alla proteina con formazione di una coppia ionica che si ferma in colonna C₁₈.

È meglio lavorare in gradiente, dove si aumenta gradualmente la percentuale del solvente forte così che la proteina è trattenuta in modo idoneo nella colonna con 2 < K < 5.

I solventi utilizzati in fase inversa sono: acqua < metanolo < acetonitrile < etanolo = acetone < isopropanolo < THF

Oltre al TFA si possono usare controioni più piccoli come l’acido fosforico e l’acido formico, il controione sarà rispettivamente lo ione fosfato o lo ione formiato, ed entrambi portano il pH a 3; in presenza della spettrometria di massa come rivelatore si può avere molto spesso precipitazione dei cristalli di acido fosforico come fosfati intasando i capillari, mentre l’acido formico ha un pH tale da abbassare il pH della soluzione ed è volatile.

In alternativa al TFA si può anche usare HFBA (acido eptafluorobutirrico) che presenta 5 atomi di fluoro ed è più forte del TFA, inoltre il residuo eptafluorobutirrato, che funge da controione della proteina, è più idrofobico del TFA per cui può trattenere meglio la proteina nella colonna e dare una migliore separazione.

Le colonne possono avere diametri del tubo inferiori a 4mm che riducono il flusso di lavoro della fase mobile e diminuiscono la quantità di materiale impaccante, quindi una minore capacità di carico della colonna: queste colonne prendono il nome di Microbore Capillary e possono essere usate anch’esse per la separazione delle proteine.

HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography)

La C₁₈ ha una lunga catena idrocarburica che tende a trattenere irreversibilmente in colonna le proteine idrofobiche, per cui per evitare questo inconveniente si usano C₄/C₂ oppure si ricorre alla HIC: la fase fissa è una matrice insolubile su base polisaccaridica e più catene di butilsefarosio, octylsefarosio o fenilsefarosio legate a questa matrice; la fase fissa è idrofobica ma meno rispetto alla C₁₈ perché sono presenti anche dei gruppi –OH in prossimità della matrice. Le proteine molto idrofobiche vengono trattenute in modo adeguato nelle fasi fisse e vengono eluite in tempi buoni.

Le modalità di eluizione sono le stesse per la cromatografia a fase inversa; trattandosi di proteine si può agire anche a livello del pH o variando la forza ionica.

Le proteine, gli anticorpi, gli enzimi e alcuni ormoni hanno la possibilità di essere separati tramite cromatografia di affinità che però si usa molto in fase preparativa, in quanto le fasi fisse dell’HPLC si usano in piccole cartucce utilizzate a monte dell’analisi cromatografica per le preparazioni del campione. Questo tipo di cromatografia è molto selettiva perché vengono prodotte colonne specifiche per gli anticorpi, gli enzimi, le proteine e sfruttano le reazioni di affinità o immunoaffinità antigene-anticorpo.

Sulla matrice (su base silice, su base polisaccaridica o su base polimero) viene legato, mediante uno spaziatore, un ligando con cui interagirà la molecola separandosi dalle altre: è importante che vi sia un dato spazio tra la silice e lo spaziatore che deve essere di opportuna lunghezza a seconda della molecola che si deve legare. Il legame tra il ligando e la molecola deve essere specifico ma reversibile; in seguito si deve rompere l’interazione per eluire la molecola utilizzando acqua in presenza di tamponi che variano il pH o la forza ionica.

Spesso si possono avere delle reazioni crociate nel momento in cui la cartuccia interagisce con molecole della stessa classe.

Lezione 12

Strumentazione HPLC: Schema a blocchi

• Fase mobile (solvente)
• Pompa che deve aspirare la fase mobile; è necessaria perché l’impaccamento nelle colonne cromatografiche è molto fine, per cui per lo scorrimento della fase mobile deve essere presente una pompa che spinge la fase mobile nella colonna
• Iniettore a monte della colonna
• Precolonna, per allungare il tempo di vita della colonna
• Colonna cromatografica
• Rivelatore
• Sistema di elaborazione dati (registratore, integratore o computer)

All’uscita del rivelatore può essere presente un collettore di frazioni: in colonna i soluti della miscela iniettata si separano come picchi che possono essere raccolti in tempi precisi isolando i vari componenti e analizzandoli con altri sistemi.

Nel serbatoio del solvente si trova un solo solvente o una miscela di solventi già pronti a monte, per esempio solo metanolo o una miscela acqua/metanolo ad opportune percentuali.

Vi sono diversi schemi a blocchi in quanto vi sono diverse configurazioni strumentali: quello più semplice prevede un unico solvente e un’unica pompa, quindi una eluizione in isocratica, perché viene mantenuta costante la composizione della fase mobile. È importante anche lavorare in gradiente variando la composizione della fase mobile durante l’analisi, per cui a monte dell’iniettore si possono avere 2 tipi di configurazioni:

1. I 2 solventi A e B, una pompa che aspira il solvente A e una per il solvente B ed un sistema di miscelazione che mescoli i solventi in opportune proporzioni se si lavora in isocratica o variando nel tempo le proporzioni se si lavora in gradiente, infine il miscelatore e l’iniettore. Questa configurazione usa una miscelazione ad alta pressione, perché il mixer è posto dopo le pompe, per cui il solvente è aspirato dalla pompa e dall’uscita della pompa in poi si ha alta pressione quindi i solventi vengono miscelati ad alta pressione; la zona prima della pompa è invece una zona a bassa pressione.
2. Vi sono pompe che miscelano solventi a monte, da cui la miscelazione a bassa pressione: i 2 solventi A e B, sistema di miscelazione dopo le pompe, pompa che aspira i 2 solventi già miscelati, infine iniettore, precolonna e colonna. In questo caso è necessaria una sola pompa, essendo avvenuta la miscelazione a monte; anche la miscelazione a bassa pressione permette di lavorare in isocratica o in gradiente.

Fase mobile

I solventi sono posti in bottiglie di vetro, materiale che è a basso rilascio, o bottiglie di vetro un po’ ambrato se è presente una fase mobile sensibile alla luce, per esempio l’acqua per HPLC è conservata in bottiglie ambrate per evitare la formazione di muffe.

Proprietà fase mobile:

• Elevata purezza, perché tutte le purezze presenti vanno in circolo e si rischiano di trovare in colonna avendo dei picchi della fase mobile, per cui si acquistano opportune fasi mobili per HPLC con elevata purezza.
• Poco tossica
• A basso costo
• Trasparente all’UV, in presenza di rivelatore UV per evitare che una fase mobile, sensibile all’UV, copra la risposta dell’analita di analisi.
• Non aggressiva per le varie parti della strumentazione: in genere si lavora con materiali molto resistenti, in caso contrario rilasciano sostanze nella fase mobile che si ritrovano in colonna.
• Viscosità non eccessiva, in caso contrario si ha aumento della pressione di lavoro.
• Non infiammabili
• Potere solvente nei confronti degli analiti presenti nel campione: i soluti devono infatti interagire con la fase fissa ma devono anche essere trascinati dalla fase mobile lungo la colonna, per cui la scelta della fase mobile dipende sia dalla natura del soluto che dalla natura della colonna.
• Forza, che dipende dalla polarità del solvente: l’acqua è un solvente forte in fase normale ma debole in fase inversa.
• Selettività (capacità di separazione di due picchi), che dipende dalle caratteristiche del soluto, della fase mobile e dalle interazioni che si stabiliscono.

I solventi devono essere filtrati o degasati prima dell’uso:

• Filtrati: quando non si tratta di solventi per HPLC per eliminare eventuali impurità
• Degasati, per 2 motivi:

1. L’aria dà fastidio a molti rivelatori, perché in presenza di bolle d’aria si ottengono una serie di picchi non cromatografici, cadenzati dovuti all’arrivo della bolla d’aria al rivelatore e uscita.
2. L’aria dà fastidio alle pompe perché si lavora sotto pressione, infatti bisogna controllare la pressione di lavoro prima di iniziare l’analisi; in isocratica la pressione, che dovrebbe essere stabile nel corso dell’analisi, tende a salire e scendere.