Metodologie Analitiche Avanzate - Appunti parte 1

Metodologie analitiche avanzate

1^{^} Lezione

L'estrazione in fase liquida

L'estrazione in fase liquida è basata su due fasi liquide immiscibili tra di loro, noti come solventi: nel primo abbiamo i nostri composti, nel secondo si estraggono i composti di interesse. La legge di Nernst è alla base delle tecniche cromatografiche; la cromatografia consiste di una serie di tecniche che consentono di separare, permettendo un'analisi qualitativa, i singoli composti di una miscela ed eventualmente quantificarli. Sfrutta l'affinità che le molecole della miscela hanno nei confronti di 2 diverse fasi: una fissa (stazionaria) e una mobile che scorre al di sopra della fase stazionaria; le molecole, in base alla diversa affinità che avranno, si separeranno.

La fase stazionaria si può trovare in una colonna (cromatografia su colonna) o su un supporto piano, solido o carta imbevuta di solvente (cromatografia planare).

Tipi di cromatografia

La cromatografia può essere:

• In fase gassosa: la fase mobile è un gas, la fase fissa potrà essere o un solido (cromatografia gas-solido) o un liquido (cromatografia gas-liquido).
• In fase liquida: la fase mobile è un liquido (solvente) che scorre all'interno di una fase fissa che sarà o un solido (cromatografia di adsorbimento) o un liquido (cromatografia liquido-liquido) che potrà essere o supportato su un solido o legato chimicamente.

Nella cromatografia di scambio ionico si analizzano specie ioniche (cariche), la fase mobile è un liquido e la fase fissa è costituita da resine cariche (resine scambiatrici), ovvero polimeri su cui vengono attaccati dei gruppi carichi (es. se carichi negativamente attrarranno specie cariche positivamente per attrazione coulombiana) che saranno in grado di trattenere specie con carica opposta.

Nella cromatografia di permeazione su gel la fase fissa è un gel particolare che separa molecole di interesse presenti nella miscela incognita su base dimensionale. La cromatografia su fase chirale permette di separare composti chirali.

La cromatografia di affinità permette la separazione di composti sfruttando interazioni particolari (es. antigene-anticorpo). Nella cromatografia su carta e strato sottile la fase fissa è stratificata su carta o su supporto solido, oppure è la carta stessa la fase fissa, imbevuta con un opportuno solvente.

Elettroforesi capillare e spettrometria di massa

L'elettroforesi capillare è una tecnica che permette la separazione applicando un campo elettrico a molecole cariche agli estremi di un capillare.

La spettrometria di massa si può accoppiare alla cromatografia liquida e alla gas cromatografia e risulta essere molto costoso come sistema. Permette di identificare in modo preciso i composti di una miscela complessa permettendo analisi qualitativa ma anche quantitativa.

Estrazione con solventi

I principi dell'estrazione sono alla base della cromatografia. Supponiamo di avere un soluto in un ambiente acquoso (matrice acquosa) che per essere analizzato deve essere isolato dagli altri componenti della matrice acquosa; si aggiunge a contatto con la matrice acquosa un solvente immiscibile in essa, creando così 2 fasi: acquosa (inferiormente) e organica (superiormente). Il soluto di interesse, avendo una certa solubilità nel solvente, inizierà in parte a spostarsi nel solvente organico finché non si raggiungerà un equilibrio:

A = Soluto [A] org / [A] acq = costante (K_d)

K_d prende il nome di coefficiente di ripartizione il cui valore dipende dal tipo di fase utilizzata, dal soluto e dalla temperatura. L'obiettivo è estrarre il soluto in un altro solvente, con i due solventi che devono essere immiscibili tra loro e il solvente usato deve essere più puro possibile per non avere impurezze sul soluto.

La legge che regola di ripartizione è la legge di Nernst: un soluto si distribuisce tra due solventi immiscibili tra loro, quando non ci sono interazioni soluto-solvente, in modo che il rapporto della sua concentrazione nei due solventi sia costante.

Bisogna scegliere solventi immiscibili con acqua e con K grande, così che il soluto tenda a passare in fase organica, viceversa un K piccolo fa sì che il soluto tenda a rimanere in fase acquosa e non sia estratto bene. Precisamente deve essere costante non tanto il rapporto tra le concentrazioni del soluto nelle due fasi, ma fra le attività del soluto tra le due fasi.

a = f (coefficiente di attività) x c (concentrazione specie)

Per soluzioni abbastanza diluite l'attività e la concentrazione coincidono quindi per soluzioni diluite è costante il rapporto tra le concentrazioni.

Determinazione del rapporto tra le attività

Per determinare il rapporto tra le attività consideriamo due fasi immiscibili all'equilibrio, ciascuna con la sua G (G₁ e G₂):

G₁ = G_1^° + RT ln a₁

G₂ = G_2^° + RT ln a₂

All'equilibrio ΔG = 0 quindi G₁ = G₂

K è costante a T costante. Nella scelta dei solventi usati nell'estrazione si possono considerare dei solventi più leggeri dell'acqua che si vanno a stratificare al di sopra di essa avendo densità <1 (es. idrocarburi, paraffine, benzene, acetato di metile, etere, esano) o solventi più pesanti dell'acqua con densità > 1 che si stratificano al di sotto (solventi clorurati).

Equilibri in acqua e rapporto di distribuzione

In alcuni casi i soluti possono creare equilibri in acqua, come gli acidi o basi deboli:

AH ⇌ H⁺ + A^-

Gli acidi e le basi forti non si possono estrarre in solvente organico, in quanto essendo completamente dissociati tendono a coordinare le molecole di acqua; gli acidi e le basi deboli invece creano un equilibrio chimico (K_a o K_b) e quindi si possono estrarre in solvente organico.

Un altro parametro importante è il rapporto di distribuzione, che è simile al K_d ma considera tutte le forme in cui è presente il soluto nelle due fasi, ovvero il rapporto della somma di tutte le concentrazioni del soluto presente in fase organica e la somma di tutte le concentrazioni del soluto presente in fase acquosa.

Per esempio molecole come la glicerina non danno luogo ad equilibri in fase acquosa e il K_d = D perché la glicerina è presente in una sola forma, con acidi e basi deboli invece K_d ≠ D perché si considerano tutte le forme in cui sono presenti in fase acquosa.

Percento di estrazione e coefficiente di separazione

Il percento di estrazione o resa di estrazione permette di determinare la quantità estratta in un solvente organico (che deve essere più alta possibile) rispetto alla quantità totale, moltiplicata per 100; si vuole un percento di estrazione quanto più prossimo al 100%.

Nei casi in cui oltre al soluto di interesse è presente anche un'altra sostanza e vogliamo estrarli insieme si utilizza un opportuno solvente organico, in altri casi se ne vuole estrarre solo una separandola dalle altre, in questo caso si considera il coefficiente o fattore di separazione β: β = D_A / D_B

Per poterli separare D_A e D_B devono essere diversi quanto più possibile, quindi il loro rapporto deve essere diverso da 1, altrimenti vengono estratti insieme. Si possono effettuare anche più estrazioni per migliorare i risultati e avere più soluto estratto.

Gli acidi e le basi forti non si possono estrarre in solvente organico (es. acido carbossilico). D è direttamente proporzionale a K_d in quanto maggiore è K_d, maggiore è l'affinità del soluto per il solvente organico.

Quando consideriamo due acidi, bisogna se possibile valutare il loro K_a: quello più debole avrà un K_a più piccolo, ed essendo K_a al denominatore renderà D più grande, di conseguenza fra i due acidi verrà estratto più facilmente quello con il K_a più piccolo. Anche il pH, ovvero la [H⁺], influenzerà D: infatti se varieremo il pH potremo migliorare o peggiorare l'estrazione dell'acido in solvente organico. Se si aumenta [H⁺] diminuisce il pH e l'estrazione viene migliorata rendendo D più grande (equilibrio spostato a sinistra) e viceversa (equilibrio spostato a destra). Quando i K_a dei due acidi sono molto diversi sarà più possibile estrarli separatamente, altrimenti bisognerà estrarli insieme: in genere per far sì che l'acido sia presente in forma indissociata bisogna che il pH sia di almeno 2 unità al di sotto del pK_a.

Anche in questo caso D dipende dal K_d, maggiore è K_d e maggiore è la tendenza del soluto a passare in solvente organico, dal K_b e dalla [OH^-], ovvero dal pH della soluzione acquosa. La curva di estrazione sarà in questo caso “rovesciata” rispetto alla precedente in quanto a pH basici l’E% sarà massimo, la [OH^-] sarà molto elevata e l’equilibrio si sposterà a sinistra con la forma R-NH₂ che prevarrà e sarà estraibile; man mano che il pH diminuisce (ambiente più acido), si aggiunge H⁺ e si sottrae OH^- e l’equilibrio si sposterà a destra con formazione di RNH₃⁺ che non essendo estraibile riduce la probabilità di estrazione. Un altro esempio di composto basico è la caffeina, e per essere estratta è opportuno addizionare la soluzione acquosa con una base.

Considerando un campione complesso costituito da sostanze acide, basiche e neutre, esso può essere alcalinizzato, e questo intervento non provoca cambiamenti nelle sostanze neutre, le sostanze acide sono indissociate e quelle basiche possono essere estratte; se si pone a contatto con il campione cloruro di metilene (CH₂Cl₂) riusciranno a passare sostanze neutre, basiche e acidi deboli mentre gli acidi forti rimangono in acqua e per estrarli bisogna acidificare il campione ed estrarre con un solvente organico; gli acidi deboli ritorneranno in acqua in quanto si ridissociano e l’acqua si acidifica, si mette a contatto con il solvente organico e si possono così estrarre gli acidi deboli. Restano le sostanze neutre e acide: con l’aggiunta di acido le prime rimangono in cloruro di metilene, e in acido passano le sostanze basiche che si ridissociano, si rialcalinizzano e si estraggono.

2^{^} Lezione

Specie cariche in acqua

Le specie cariche in acqua sono solvatate dalle molecole di acqua per cui la loro estrazione risulta difficoltosa e si utilizzano altri metodi quali:

• Formazione di coppie ioniche
• Formazione di complessi (cationi o metalli in soluzione acquosa)

Lo scopo è neutralizzare la carica presente.

Formazione di coppie ioniche e complessi

Si aggiunge un controione, ovvero uno ione di carica opposta a quello presente in soluzione che forma una coppia ionica che può così essere estratta in solvente organico. Un esempio sono gli alchilsolfonati, costituiti da una lunga catena R (importante perché essendo apolare può essere sciolta in solvente apolare) e da una testa polare SO₃^-, la quale interagisce con la specie carica positivamente per formare una coppia ionica neutra; vi sono poi controioni specifici per l’estrazione di specie cariche negativamente.

La formazione può essere di 2 tipi a seconda che abbiamo:

• Complessi polidentati, che essendo molto stabili si possono estrarre più facilmente; per esempio vi sono specie che si combinano con i metalli a formare dei chelati, complessi molto stabili a carica nulla che vengono estratti facilmente (es. acetilacetone e rame che formano un complesso che presenta 2 legami dativi e un’interazione elettrostatica e può essere estratto).
• Complessi monodentati, che sono meno stabili e si estraggono con più difficoltà (es. Fe³⁺ e Cl^- che si combinano a formare FeCl₃).

Estrazione degli amminoacidi

Gli amminoacidi sono costituiti da un gruppo amminico e un gruppo carbossilico, quindi hanno sia funzione acida che basica; presentano dei piccoli gruppi R legati al C tetraedrico al quale, eccetto per la glicina, sono legati 4 diversi sostituenti. L’estrazione degli amminoacidi sarà influenzata sia dal tipo di gruppo R che dalla presenza del gruppo carbossilico e amminico, i quali a dati pH saranno presenti in forma deprotonata. Il punto isoelettrico (pI) è il punto in cui gli amminoacidi sono presenti con entrambi i gruppi deprotonati e quindi sono neutri; è influenzato dai gruppi R presenti ed è diverso a seconda delle caratteristiche dell’amminoacido. Al pI possono essere estratti e anche in questo caso si può agire sul pH per migliorare il processo.

Gli amminoacidi sono costituiti da proprietà chimiche e fisiche:

• Hanno elevati punti di fusione
• La loro solubilità aumenta o diminuisce al variare del pH
• Hanno attività ottica grazie al carbonio chirale, quindi possono ruotare il piano della luce polarizzata in senso orario o antiorario
• Sono tutti presenti in forma L, da cui il nome di L-amminoacidi
• Alcuni, avendo come sostituenti gruppi fenilici, possono assorbire la radiazione UV (200-400 nm) e quindi possono essere rilevati mediante spettroscopia (es. fenilalanina, triptofano, tirosina)

Gli amminoacidi sono i costituenti delle proteine attraverso legami peptidici che si formano tra il gruppo amminico di un amminoacido e il gruppo carbossilico di quello adiacente con eliminazione di una molecola di acqua. Tra i costituenti delle proteine vi sono amminoacidi essenziali che l’organismo non produce e vengono assunti con la dieta. Non sempre l’estrazione proteica è semplice per cui molto spesso si utilizzano altri metodi di purificazione in cui si separano in base alle loro proprietà, come la precipitazione con solventi organici (nei quali le proteine sono insolubili) o precipitazione al pI o estrazione mediante solvente acquoso.

Categorie di amminoacidi

Gli amminoacidi sono suddivisi in diversi gruppi a seconda del tipo di gruppo R:

• Monoammino monocarbossilici, che presentano un solo gruppo amminico e carbossilico non sostituiti (es. glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina)
• Aromatici idrofobici, costituiti da un anello benzenico e da una catena laterale che li rende poco solubili in acqua
• Acidi dicarbossilici con un solo gruppo amminico e 2 gruppi carbossilici per cui avranno pI più bassi
• Acidi monocarbossilici con un solo gruppo carbossilico e 2 gruppi amminici per cui sono più solubili in acqua avendo un pI più alto
• Con catena laterale neutra o polare

Le informazioni qualitative degli amminoacidi possono essere determinate a seguito dell’estrazione mediante cromatografia. Per estrarli in solvente organico si sceglie un pH vicino al loro pI, in modo che siano presenti in forma neutra e possano essere estratti più facilmente; gli amminoacidi con gruppi idrofilici, dicarbossilici, monocarbossilici sono più solubili in acqua e sciolti in essa comportano una diminuzione di energia libera (negativa).

Metodi di estrazione

Per condurre l’estrazione vi sono 2 metodi in base alla strumentazione disponibile in laboratorio e ai valori di D o K_d delle sostanze in esame:

1. Discontinuo: con D o K_d grandi, utilizzando un solvente in cui l’analita è molto solubile
2. In continuo: con D o K_d piccoli, se il soluto non è molto solubile nel solvente e se si ha a disposizione un certo tipo di apparecchiatura

1) il campione è acquoso o stato solubilizzato; si sceglie un solvente organico che sia immiscibile con acqua (es. acetato di metile), volatile, poco viscoso, e con proprietà simili a quelle dell’analita da estrarre. Si sceglierà un solvente per cui il campione mostra un alto K_d.

Il processo si conduce in provetta da centrifuga in presenza di solventi che hanno densità inferiore a quella dell’acqua e che quindi si stratificano al di sopra e vengono recuperati con una pipetta, o in imbuti separatori, che possono contenere più volumi, in presenza di solventi con densità maggiore a quella dell’acqua che si stratificano al di sotto e vengono fatti uscire al di sotto.

L’aggiunta di sali alla soluzione acquosa permette di migliorare il processo, per esempio NaCl è un sale che si dissocia completamente e in questo modo rende meno disponibili le molecole di acqua nei confronti del soluto che può essere estratto meglio.

Nel caso di campioni ricchi di sostanze bisogna effettuare più estrazioni per ottenere gli analiti di interesse finché nel solvente organico non resta più niente.

Prima dell’estrazione: [analita] = C₀ (analita) x V_i (sol.acquosa)

Dopo l’estrazione si suddivide il volume dell’analita che in parte passa in solvente organico. La quantità di analita in soluzione acquosa si può determinare conoscendo il K_d, e sarà tanto più piccola quante più saranno le estrazioni e maggiore sarà il K_d e maggiore è il rapporto tra il volume estraente e il volume di partenza.

Utilizzando l’imbuto separatore in presenza di etere e acqua, il soluto passa in soluzione acquosa mediante apertura rubinetto senza trascinare anche l’etere.

2) Si riutilizza più volte il solvente che permette l’estrazione dalla soluzione acquosa e man mano si estrae il soluto. Possono essere presenti anche campioni di tipo solido da cui si vogliono estrarre soluti, come per esempio un tessuto animale o vegetale, un campione alimentare, tramite estrattori solidi o liquidi, la cui scelta dipenderà dal solvente utilizzato (più denso o meno denso dell’acqua).

Il processo dipenderà da vari fattori tra cui volume di solvente estraente, il tempo di contatto tra il solvente estraente e il campione (solido o liquido) e il tempo in cui si raggiunge l’equilibrio. Un tipo di estrattore per solidi è il Soxhlet: il campione solido o semisolido (pastoso) è posto in un ditale di carta da filtro pressata che favorisce il passaggio del solvente organico; il pallone presente sotto viene inizialmente rimosso, si pesa e poi si aggiunge il solvente estraente, si riscalda e va in ebollizione, sale, passa attraverso il raccordo e giunge in una zona refrigerata dove ricondensa, scende sotto forma di piccole gocce ed entra nel ditale.