Metodologie Analitiche Avanzate - Appunti parte 1

APPLICAZIONI GC:

L’olio d’oliva è caratterizzato dalla presenza di acidi grassi che sono presenti come trigliceridi, dove

la glicerina lega 3 diverse (o uguali) molecole di acido grasso.

Per studiare la composizione dell’olio d’oliva bisogna determinare quali acidi grassi sono presenti e

si può ricorrere alla GC, anche se non è possibile l’analisi diretta del trigliceride, per cui mediante

saponificazione viene separata la glicerina dagli acidi grassi mediante attacco con KOH; l’acido

grasso è caratterizzato dal gruppo COOH che deve essere derivatizzato, facendolo reagire con

formazione di estere metilico (COOCH ) e successivamente si esegue l’analisi degli esteri metilici

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degli acidi grassi dove grazie ai valori dei tempi di ritenzione dei picchi si possono riconoscere i tipi

di acidi grassi presenti nell’olio.

Oltre ad un’analisi qualitativa si considera anche un dosaggio quantitativo in quanto in base al tipo

di olio cambiano i rapporti fra gli esteri metilici.

Gli oli essenziali sono ricavati da matrici vegetali e vengono prodotti dalla pianta in condizioni di

stress, e sono presenti in numerosi settori; sono caratterizzati da numerosi componenti, alcuni

volatili (terpene) e altri meno volatili, per cui la loro analisi potrà essere condotta in parte con la GC

e in parte con l’HPLC.

Inoltre è anche possibile separare composti clorurati mediante analisi con spazio di testa, in cui si

campiona mediante una siringa la parte volatile del campione. Essendo solventi a basso peso

molecolare si utilizza un programma di temperatura che parte da valori molto bassi (40°) per poi

arrivare, mediante una programmata, prima a 100° e poi a 160°. La scelta delle condizioni operative

dipende dalla natura dei composti (altobollenti o bassobollenti).

Un’altra applicazione consiste nell’analisi dei componenti del biodiesel, carburante ottenuto per

spremitura di semi di oli vegetali di colza, soia e girasole, si fa avvenire una reazione di

derivatizzazione tramite etanolo, ovvero mediante transesterificazione si libera glicerina e

rimangono gli acidi grassi metilati.

La colonna utilizzata è di tipo capillare lunga 10m, con diametro 0.32 mm e fase fissa costituita da

metilsilicone, il carrier gas è l’elio, e viene anche riportato il tipo di iniezione, la temperatura del

forno (isoterma o programmata), il tipo di rivelatore usato, la temperatura del rivelatore, il flusso di

lavoro del carrier gas. Metodologie Analitiche Avanzate lez.7

CROMATOGRAFIA LIQUIDA TLC:

Cromatografia in fase mobile liquida che avviene su supporto piano; la fase mobile è un liquido,

mentre la fase fissa è stratificata su lastre di vetro di dimensioni variabili oppure fogli di alluminio o

materiale plastico, ma questi possono essere soggetti all’attacco di acidi; in alternativa al gel di

silice si può utilizzare uno strato a base di cellulosa.

Sulle lastre è stratificato il gel di silice (fase fissa molto polare) insieme ad un legante.

Questo tipo di cromatografia non è molto efficiente, ma può essere utile in presenza di campioni

molto sporchi o ricchi di componenti, che possono essere separati grosso modo da altri composti e

in seguito si asporterà la macchia del composto di interesse che verrà analizzata con un’altra

tecnica.

Tracciata una linea orizzontale a 1-1.5 cm dalla base sulla quale si applicano tramite dei capillari

uno o più campioni incogniti e una serie di standard puri di cui si sospetta la presenza nel campione;

si applicano delle piccole gocce sferiche a distanza uguale una dall’altra sulla linea orizzontale

prelevate con il capillare oppure con siringhe. È importante che:

le gocce siano ben distanti

- all’altra estremità si deve indicare ciò che si è depositato.

-

La fase mobile verrà preparata ricorrendo sia alla letteratura che attraverso prove ripetute, in

particolare se la fase fissa sarà polare la fase mobile sarà apolare.

Si riempie una vasca (di dimensioni variabili) con 100ml di fase fissa e la si chiude per far si che i

vapori di solvente saturino l’ambiente, in seguito si aggiungono velocemente gli standard e sotto

cappa si inserisce la lastra seguendo due scanalature parallele in modo che il liquido bagna la parte

inferiore della lastra; il liquido sale per capillarità facendo si che i composti si ripartiscano tra le 2

fasi muovendosi lungo la lastra. Durante il processo si osserverà la linea del solvente, che si muove

più rapidamente, e giunto a ¾ dalla lastra si interromperà il processo per evitare fuoriuscita del

solvente ed eventualmente dei composti.

Alcuni composti saranno più affini alla fase mobile e quindi si muoveranno più rapidamente, se

viaggiano con la fase mobile si misura il rapporto tra la distanza percorsa dal solvente e la distanza

percorsa dal composto che sarà uguale ad 1, altrimenti se non si sposta perché più affine alla fase

fissa il rapporto è uguale a 0. I valori ottimali di questo fattore di ritardo (f ) vanno da 0 a 1.

r

Importante è che non ci sia troppo campione che causerebbe strisciate e che non vi devono essere

fori nella lastra che causerebbero macchie irregolari.

Terminato il processo si tira fuori la lastra, si asciuga e generalmente per poter osservare i risultati

bisogna utilizzare dei reattivi che possono essere di vari tipi e che devono essere scelti in modo che

vi sia una reazione con i composti evidenziandoli: miscele contenenti ossidanti (permanganato),

miscele a base di acido solforico (non utilizzabile in presenza di cellulosa), miscele a base di nitrato

di argento (si riduce reagendo con le sostanze che si ossidano).

Vi sono inoltre reattivi:

universali: rivelano tanti tipi di composti

- selettivi: specifici per alcuni composti

-

Per visualizzare i composti non fluorescenti sulla lastra si utilizzano delle lampade UV: se hanno

gruppi cromofori che assorbono la radiazione UV si osserveranno delle macchie; se i composti sono

fluorescenti assorbono la radiazione UV e la riemettono con una reazione simile ad una lunghezza

d’onda maggiore. In alcuni casi le lastre hanno alla base un indicatore di fluorescenza, ovvero la

lastra a contatto con la lampada emette già nel verde, per cui i composti per essere evidenziati

devono emettere nel violetto.

Quando non si verifica nessun tipo di reazione si può grattare la macchia di interesse e analizzarla

con un altro sistema eliminando il gel di silice; le informazioni che si ottengono sono di tipo

qualitativo, per esempio si può osservare se alcuni standard hanno viaggiato in ugual modo rispetto

alle macchie.

Si possono anche fare eluizioni bidimensionali: considerato un campione ricco di composti si fa una

prima eluizione con la fase mobile che sale e si ottengono i primi componenti separati; rovesciando

la lastra e reimmersa in un’altra fase mobile si ha un’altra eluizione in un’altra direzione

consentendo di avere separazioni migliori.

L’eluizione per la carta si può fare in due modi: più ascendente e discendente.

Oltre al cambio del gommino si ricorre al lavaggio del LINER, in quanto anche in esso è possibile

trovare sporcizie, per cui si rimuove e si sostituisce con un altro, e viene lavato con H O e HNO

2 3

(1:1) nel sonicatore per essere poi riutilizzato.

In LC si lava la colonna o a flusso diretto o mediante rovesciamento (lavaggio in controflusso).

Il gel di silice è una fase solida, da cui il nome di LSC; molto spesso come fase mobile può essere

presente l’acqua insieme ad altri composti che si lega al gel di silice imbibendolo e formando dei

legami idrogeno: la cromatografia sarà di ripartizione (fase fissa e mobile liquide).

Tanto più piccole sono le particelle del gel di silice tanto migliori saranno le separazioni.

Si possono scavare due canali nella lastra su gel di silice, in modo che i composti si separeranno

come rettangoli e non come gocce sferiche, e sarà in questo modo più facile calcolarne l’area.

In presenza di cellulosa in polvere stratificata su carta non si ha cromatografia di adsorbimento in

quanto la cellulosa si imbibisce subito di fase mobile, si parla di cromatografia di ripartizione

(cellulosa idratata e fase mobile liquida).

L’eluizione può avvenire anche in senso orizzontale in cui si bagna un’estremità della lastra, si

depositano i campioni sulla base e grazie ad una pompa è possibile spingere il liquido in

orizzontale, o mediante sviluppo radiale, in cui al centro di una lastra circolare vi è uno stoppino

che scende nella fase mobile: si pone il campione al centro della lastra che può essere suddivisa in

4 parti e viaggerà come archi di circonferenza. L’analisi quantitativa verrà fatta mediante

coincidenza tra un arco e l’altro.

Nella rivelazione possiamo avere 2 tipi di reattivi:

1) generali o non selettivi: HNO , H SO , UV, fluorescenza che carbonizzano le sostante organiche

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e le evidenziano come macchie scure.

2) specifici o selettivi: per gli amminoacidi, per gli steroidi, indicatori acido-base, nitrato di argento.

ANALISI QUANTITATIVA:

La macchia è proporzionale alla quantità di sostanza ma è difficile da misurare a causa delle forme

che può assumere; vi sono metodi:

diretti: se le macchie hanno gruppi cromofori che assorbono o emettono possono assorbire la

- luce, in parte trasmettendola e in parte emettendola. Si misura la densità ottica, data dal

rapporto tra l’intensità della luce riflessa dalla macchia e l’intensità della luce riflessa dalla

lastra. La lampada irradia la lastra e la macchia, il segnale che si ottiene è proporzionale alla

concentrazione, per cui mediante retta di taratura misuriamo la densità ottica (segnale) a

concentrazioni sempre più crescenti. Si traccia retta passante per i vari punti, considerata la

sostanza incognita si misura la densità ottica, si ottiene un segnale S che viene riportato

x

sulla retta di taratura per ottenere C .

x

indiretti: asportazione macchia e analisi con altre tecniche.

-

Densitometro: si utilizza una sorgente luminosa (lampada a deuterio, a tungsteno o a vapori di Hg),

lenti e monocromatori (permette la selezione di una data lunghezza d’onda) si irradia la lastra lungo

le macchie che devono essere ben allineate; con il rivelatore (detector) ci si può mettere al di sopra

della lastra, misurando l’intensità della radiazione emessa dalla lastra e dalla macchina ottenendo la

densità ottica, oppure al di sotto della lastra riportando l’intensità della radiazione trasmessa dalla

macchia rispetto a quella trasmessa dalla solo lastra.

Vi sono vari parametri critici:

modalità di deposizione del campione

- modalit&ag