Appunti "Metodologie analitiche avanzate"

ANALISI QUANTITATIVA

A questo punto noi conosciamo l’identità dei picchi in un cromatogramma, adesso io devo

sapere la concentrazione dell’analita nella miscela.

L’area sottesa dalla curva del picco cromatografico è proporzionale alla concentrazione

dell’analita.

Ci sono vari metodi per fare l’analisi quantitativa, la cosa fondamentale è che voi ci

determinate l’area del picco.

Prima si faceva manualmente, l’area si faceva considerando l’area di un triangolo. Si

 traccia la base del picco, si traccia l’altezza e si tracciano le tangenti ai punti di flesso ed

ecco che ottenete una sorta di triangolo, del quale poi fate il calcolo dell’area. Oppure, nel

caso di picchi codati, dove non è possibile prendere la base, cosa si fa? Si traccia più o

meno la linea di base del picco a metà dell’altezza del picco, perché qui c’è simmetria

Integratori, sistema che riporta il tempo di ritenzione all’apice del picco e l’area del picco,

 quindi prendete l’area data dall’integratore

Lo standard che acquistate deve essere il più possibile puro, il migliore sarebbe quello con

titolo dl 100%, perché altrimenti che succede? Ad esempio, se ho uno standard, con una

purezza del 90% quando vado a pesare lo standard, per preparami una soluzione da

1mg/mL, quindi io peso 1mg, avendo un’impurezza del 10%, il 10% di questo mg non è del

mio standard, ma della sua impurezza. Tutti gli standard vanno conservati

opportunatamente, in provette ambrate, magari al buio e li devo tenere refrigerati, talvolta

anche congelati, infatti, in genere si procede con la preparazione di una soluzione madre

dello standard. Poi all’occorrenza la soluzione madre viene scongelata e diluita.

I metodi che si usano per analisi quantitativa sono essenzialmente 4:

Metodo dello standard esterno, non può essere usato con tutte le tecniche

 cromatografiche, ma solo in HPLC se si rispettano determinate condizioni; in GC dà grossi

problemi di riproducibilità

Metodo dello standard interno, è il più affidabile, tanto per HPLC quanto per GC. Un

 pochino più complesso

Metodo della normalizzazione, è un metodo che ha grosse limitazioni può essere usato

 solo quando tutti gli analiti vengono eluiti da quella colonna cromatografica, sia in GC sia in

LC e vi dà soltanto una percentuale di un’analita rispetto agli altri, quindi voi alla fine non

avrete la concentrazione di quell’analita in quel campione, ma solo una percentuale di

quell’analita in quel campione rispetto agli altri

Metodo delle aggiunte standard, più utilizzato in spettrometria da sola



BUIARELLI LEZ. 12 (28.11.2016)

Come si realizza l’analisi quantitativa. Abbiamo detto che si usano tre metodi più un quarto che

si può usare anche in HPLC.

Metodo dello standard esterno. Sappiamo chi è l’analita, dobbiamo riuscire a determinare la

concentrazione, ci procuriamo questo analita come standard puro. Avete questo

cromatogramma nel quale avete una miscela complessa di analiti che si separano. Volete

analizzare un certo composto con un certo tempo di ritenzione, facciamo conto 8 min, per

esempio la caffeina. Cosa fate? Acquistate la caffeina standard (pura), la pesate e preparate

una serie di soluzioni standard. Fate una soluzione madre pesando ad esempio 1mg/mL, deve

essere stabile e conservata in freezer. La sciogliete in un opportuno solvente nel quale l’analita

sia solubile; da qui vi preparate una serie di soluzioni standard (5) a concentrazioni a scalare,

da basse ad alte. Per fare una buona analisi quantitativa ne servirebbero almeno 5. Iniettate la

prima soluzione nelle stesse condizioni del campione, per almeno tre volte, ottenete un

cromatogramma dove a tempo di ritenzione 8 avete il picco della prima soluzione di caffeina.

Questa è C1 iniettata alla cui concentrazione corrisponde una certa area del picco. (analisi

quantitativa: vi interessa l’analisi del picco). Avrete tre cromatogrammi sostanzialmente



identici, dove avrete area C1 della prima, seconda e terza iniezione. A questo C1 A1. La

media di queste tre aree è il vostro primo punto della curva di calibrazione, perché per fare

un’analisi quantitativa accurata dovete costruire una curva di calibrazione.

Iniettate la seconda soluzione la C2, che ha una concentrazione maggiore di caffeina rispetto

alla precedente, la iniettate tre volte. Questa volta l’area sarà più alta di quella di prima,

maggiore e dunque a C1A2. Ottenete il secondo punto. E così via per le altre tre, l’area

incrementerà sempre.

Alla fine, mediante il medio dei minimi quadrati, non si fanno più a mano su carta millimetrata,

ottenete la retta che passa per questi 5 punti (magari non saranno allineati: problemi

preparativi). Ottenete la retta di calibrazione, vi permette di vedere se la risposta aumenta

linearmente.

A questo punto iniettate il campione incognito, vi interessa sapere quanta caffeina è. Lo

A

iniettate tre volte, mediate le tre aree corrispondenti al picco della caffeina . Quest’area

x

magari cade qui in mezzo, questo vi permette di ricavare C dalla retta.

x



Y=mx+q La mia y è l’area, la mia x è la concentrazione. Quindi faccio calcoli per ricavare la

C .

x

Questo è il metodo detto dello standard esterno (detto anche ES), perché avete costruito una

retta usando uno standard, e avete fatto tutte le misure usando questo standard

indipendentemente dal vostro campione. È anche il metodo più semplice. Si usa soprattutto in

LC, quando si può usare l’iniettore a loop pieno, lo avete da 10µL, voi ne iniettate anche 30 e

siete sicuri di riempirlo, molta riproducibilità. Non si può usare in GC con l’iniettore splitsplitless

(una parte del campione veniva mandato in colonna e una allo scarico), trattandosi di composti

che passano allo stato vapore, ci può essere una distribuzione non omogenea tra scarico e

colonna, quindi pur iniettando la stessa concentrazione x3 volte, non avete aree riproducibili.

Talvolta non si usa l’area, ma l’altezza del picco (lo metto sull’asse delle ordinate), è più

corretto usare l’area, uso l’altezza quando il picco è cosato magari.

Metodo della normalizzazione. Non ottenete una concentrazione esatta, ma una

percentuale rispetto agli altri, non sapete a che corrisponde. Si usa prevalentemente

in GC.

Avete il cromatogramma del vostro campione complesso: con tanti picchi, ve ne

interessa uno. Misurate l’area di tutti i picchi, e fate una percentuale. Cioè il vostro

analita incognito X avrà una certa area A , divisa per la

x

tutte le aree presenti

i∑ , per la percentuale vi dà la

percentuale dell’analita.

Softaware misurano l’area di tutti i picchi. Alla fine potrò dire che la mia caffeina è il

10% di quel campione.

Condizione fondamentale: tutti gli analiti devono essere eluiti (precipitano o non rivelati), per

evitare che non accada si utilizzano fattori di risposta, quindi avrò l’area assoluta moltiplicata

per un certo fattore di risposta. Significa che questa concentrazione sarà data dal fattore di

risposta del picco 1 per la sua area A1. Perché può accadere che pur rivelandoli tutti, non

hanno la stessa risposta con quel rivelatore, dipende dalle caratteristiche chimico-fisiche degli

analiti. Fattori di risposta specifici sostanza per sostanza, che vengono misurati. Come si fa?

Per ricavare le aree a monte devo fare un’operazione: mi prendo le sostanze di interesse

C1/C2/C3/C4/C5, avendo tutte la concentrazione C1=C2=C3=C4=C5.

C1= f xA1= f xA2= f xA3

1 2 3

Pongo f =1 inietto la prima sostanza di cui conosco la concentrazione, ottengo un’area A1

1

Inietto la seconda sostanza, di cui conosco la concentrazione (=C1), ottengo A2

A questo punto da questa prima uguaglianza, A1 lo conosco, f lo conosco, posso ricavare f

1 2

ed è A1/A2 perché f =1

1

Cosi facendo ricavo tutti i fattori di risposta e li introduco poi nell’espressione finale. f lo

x

conosco, A pure e tutti i fattori di risposta moltiplicati per A1, riesco a ricavare questa

x

percentuale.

In questo caso il metodo diventa molto complicato rispetto al precedente in cui rapidamente

facevamo una percentuale. Quindi si usa quando tutti gli analiti vengono eluiti e mi danno la

stessa risposta. Esempio analisi degli esteri metilici negli oli di oliva: per ottenere info su questi

trigliceridi, liberiamo gli acidi grassi e li metiliamo (li derivatizziamo) e poi facciamo l’analisi

degli esteri metilici. Questi in GC danno una risposta confrontabile a parità di concentrazione,

e quindi poi in quel caso si fa il rapporto di tutti per ottenere la percentuale.

Terzo metodo molto usato sia in hplc sia in GC, anche se un po’ più complesso è quello dello

standard interno (IS). In questo caso abbiamo sempre un campione reale con più analiti e ci

interessa la concentrazione di un’analita che conosco, esempio la caffeina. Invece di costruire

una retta, mi cerco un campione con caratteristiche chimico-fisiche simile a quelle del mio

analita di interesse e che non abbia però lo stesso tempo di ritenzione (teocromina). Per

costruire la retta di calibrazione ho bisogno di due analiti: caffeina pura del mio IS. Preparo le

mie due soluzione madre (1mg/mL), come prima mi preparo le cinque soluzioni della caffeina

con C crescenti a partire dalla soluzione madre. In ognuna di queste aggiungo lo IS che ho

scelto, in C nota e costante (intermedia tra le 5 es di 20ng/mL). Faccio i cromatogrammi di

questi composti uno per uno. Ottengo un picco che è IS + caffeina C1 per tre volte. Adesso

non valuto l’area assoluta ma in rapporto tra A1/A (avrò te aree di A1 e tre di IS e faccio la

is

media dei tre rapporti), con soluzione 2 otterrò un’area maggiore, così anche C3 (fino a

C5)…otterrò i punti della retta.

Nella provetta del campione incognito C aggiungo lo IS nelle stesse identiche condizioni degli

x

analiti di riferimento. Faccio il cromatogramma. Vado a vedere quanto è il rapporto del mio

= +

analita la caffeina nel campione: A /A , me lo riporto sulla retta (questa volta ,

x i

dove y non è un’area assoluta ma un rapporto di aree). Una volta ottenuto questo rapporto,

per ottenere la concentrazione farò che ho ottenuto.

La difficoltà è ottenere IS, non sempre è possibile trovare quello idoneo, che abbia una

temperatura di ebollizione simile a quella del nostro composto.

Il metodo IS è obbligatorio usarlo in GC capillare con lo splitsplitless, perché una parte va in