Appunti "Metodologie analitiche avanzate"

Introduzione alla cromatografia

Adesso vi dico a grandi linee che cosa è la cromatografia, ma poi andremo proprio nel dettaglio durante il corso. Per cromatografia si intendono tutte una serie di tecniche separative che ci permettono, appunto, di separare una serie di composti; quindi voi avrete una miscela di composti che magari avete estratto dal vostro campione di interesse, quindi li avete tutti insieme, e poi li volete separare ad uno ad uno, a quale scopo? Per poterli identificare, e quindi questa è un'analisi qualitativa, e dire “ok, ho una miscela di composti iniziale, adesso l'ho estratta dal mio campione, la voglio analizzare e voglio sapere chi sono questi composti (analisi qualitativa) ed eventualmente poi effettuare un’analisi quantitativa (cioè voi sapete quali sono i vostri composti, ma volete sapere quanto ce n’è del composto x nel vostro campione di partenza, quanto del composto y e quanto di un altro composto).

Principi della cromatografia

Tutte le tecniche cromatografiche si basano sulla separazione di questi composti fra due fasi, una fase fissa e una fase mobile:

• La fase fissa è quella che viene messa, non da voi ma dalle ditte, all’interno di colonne cromatografiche, quindi voi avrete una colonna cromatografica con dentro una fase fissa o stazionaria, cioè immobile dentro la colonna, che sarà fatta da piccole particelline. Dentro questa colonna introdurrete la vostra miscela di composti, che avete magari estratto da un campione. I composti entrano dentro questa fase stazionaria e cominciano a separarsi.
• Dentro questa colonna scorre anche una fase mobile, che può essere un gas o un liquido, che scorre dentro la colonna e trasporta i composti, quindi i composti entrano in colonna, interagiscono con la fase stazionaria e la fase mobile fa sì che questi composti nella colonna viaggino e si muovano fino ad arrivare all’uscita della colonna.

Se la fase mobile è un gas si parla di gas-cromatografia, se è liquida si chiama cromatografia liquida.

Tipi di cromatografia

Quindi fatta questa prima parte di estrazione passeremo alla cromatografia vera e propria, inizialmente vi verranno spiegati tutti i parametri fondamentali che governano la cromatografia, sia essa una cromatografia gassosa, cioè la fase mobile che scorre è un gas, sia essa una cromatografia liquida in cui la fase mobile è un liquido.

Cromatografia in fase gassosa

Dopodiché cominceremo con una cromatografia in fase gassosa e vedremo le possibili fasi stazionarie che si usano, cioè io ho il gas che scorre nella colonna, ma cosa c’è nella colonna? Ci può essere un solido e allora si parla di cromatografia gas-solido (Gas Solid Chromatography), se la fase stazionaria è un liquido si parlerà di Gas Liquid Chromatography. E vedremo quelli che sono i componenti fondamentali di un gas cromatografo, proprio dell’apparecchiatura. Cosa vi serve per analizzare questi composti? Non basta la colonna, non basta la fase mobile, ma servono tutte una serie di piccole apparecchiature collegate insieme per poter far funzionare un gas cromatografo.

Cromatografia in fase liquida

Dopo si passerà, nella seconda parte del programma, alla cromatografia in fase liquida, questa volta la fase mobile che scorre all’interno della colonna è un liquido, un solvente, e vedremo quelle che posso essere le possibili fasi stazionarie. Potremmo avere delle fasi solide, in tal caso parleremo di cromatografia di adsorbimento (Liquid Solid Chromatography), la fase stazionaria può anche essere un liquido, un liquido che supportato su un solido e quindi avrete la Liquid Liquid Chromatography (fase mobile è un liquido, fase stazionaria è un liquido) e in cromatografia liquida avrete anche la possibilità di lavorare a scambio ionico, cosa avrete dentro la colonna? Dentro la colonna avrete una resina caratterizzata dalla presenza di tanti gruppi funzionali carichi, magari tutti positivamente (quindi cationi), cosa potrete analizzare con questa colonna? Miscele di anioni e cationi, ma il catione non si fermerà in colonna perché se la fase stazionaria ha già tante cariche positive, il catione viene respinto ed eliminato, si fermerà l’anione (per attrazione coulombiana), quindi questa è una cromatografia a scambio anionico. Viceversa per la cromatografia a scambio cationico.

Modalità di eluizione

E vedremo come sono queste fasi e la modalità di eluizione, ovvero come dovrete voi variare la fase mobile per far uscire i composti che si sono fermati in colonna.

Cromatografia di permeazione su gel

Poi vedremo la cromatografia di permeazione su gel, molto adatta per molecole ad alto peso molecolare, come le proteine, dove la fase stazionaria è un solido un po’ gelatinoso caratterizzato dalla presenza di tanti pori, quindi le molecole di certe dimensioni riusciranno a penetrare dentro i pori, quelle troppo grosse no e usciranno, quelle tropo piccole usciranno per ultime perché entreranno molto profondamente nel poro e rimarranno nel poro tutte insieme e verranno eluite tutte insieme.

Analisi dei composti volatili e non volatili

Composti in genere che sono molto volatili a bassi punti di ebollizione, o che possono essere resi tali (cioè non volatili di partenza, ma voi con delle reazioni particolari li potete rendere volatili) li analizzerete preferenzialmente in gas-cromatografia perché in gas-cromatografia voi dovete trasformare tutto in gas, ma anche i vostri analiti devono essere trasformati in fase di vapore; composti che invece non bollono facilmente, con alti punti di ebollizione oppure che si decompongono con la temperatura verranno analizzati con cromatografia liquida, a quel punto avrete un’ampia scelta di fasi stazionarie e in base alle caratteristiche dei vostri composti potrete scegliere la vostra colonna. In genere con la cromatografia di adsorbimento si analizzano composti a basso peso molecolare, con la cromatografia di ripartizione liquido-liquido si analizza la grande maggioranza dei composti, considerate che l’80% delle separazioni con cromatografia liquida viene fatta con LLC, poi se sapete che i vostri composti sono cariche e hanno una polarità prevalente (oppure potete renderli voi tali magari giocando su pH) allora vi potete spostare sulla cromatografia a scambio ionico; se poi hanno delle dimensioni notevoli, come proteine o polimeri, e non riuscite a separarli in altro modo vi orientate su esclusione dimensionale o su permeazione su gel.

Altri tipi di cromatografia

Poi verranno dati accenni anche su cromatografia su fase chirale e su cromatografia di affinità e poi vorrei darvi anche un accenno sulle moderne fasi stazionarie per High Performance Liquid Chromatography, è più recente (anni ‘80) e quindi continua ad evolversi (a differenza della gas cromatografia più vecchia e senza altre innovazioni), un accenno verrà dato alla cromatografia su strato sottile, la Thin Layer Chromatography, in questo caso la fase stazionaria non si trova in colonna, ma si trova stratificata su una lastra di vetro, quindi si parla di cromatografia su piano e concettualmente ricorda l’elettroforesi su gel, dove abbiamo un gel stratificato su delle lastre, qui avete delle fasi stazionarie prevalentemente solide a base di silice stratificate su una lastra di vetro oppure plastica o alluminio, le separazioni che si ottengono con questa cromatografia sono abbastanza grossolane, non sono delle separazioni fini come quelle che si ottengono con gas-cromatografia o HPLC in TLC le separazioni sono molto grossolane, nel senso che voi ottenete separazioni per gruppi di sostanze, però può essere utile come fase preliminare magari per un’analisi cromatografica, una sorta di preparativa magari per purificare un po’ i campioni, anche qui vi farò vedere lo schema blocchi di un cromatografo liquido, cioè i vari componenti, cosa c’è a monte e a valle della colonna.

Elettroforesi capillare

Parleremo poi di elettroforesi capillare dove i principi che avete visto magari su gel, vengono ripetuti all’interno di un sottile capillare, verrà applicata all’estremità del capillare una differenza di potenziale, dentro il capillare vedremo ci può essere il solo tampone o un gel o degli altri sistemi, e le vostre molecole si separeranno sotto l’influenza del campo elettrico. Con questa tecnica voi potrete analizzare prevalentemente molecole cariche o che possono essere rese tali.

Spettrometria di massa

Una parte del programma sarà poi dedicata alla spettrometria di massa, non usata da sola, ma accoppiata con i sistemi cromatografici, quindi all’uscita della vostra colonna non avrete il classico rivelatore per GC o HPLC, ma avrete uno spettrometro di massa che vi darà importantissime informazioni di tipo qualitativo, la spettrometria di massa è la più importante tecnica analitica per delucidazioni di tipo strutturale, e anche quantitativo.

Estrazione

Vale a dire tutti i principi che vi permettono di estrarre un'analita o un gruppo di analiti, cioè di sostanze chimiche, da una certa matrice reale (campione reale). Estrarli da questo campione per portarli in un solvente opportuno per poi analizzarli con delle tecniche. Difficilmente vi capiterà di poter analizzare un campione, sia esso un fluido biologico, un tessuto tal quale o semplicemente solubilizzato, quasi sempre voi, se andrete alla ricerca di particolari sostanze chimiche, di metaboliti, dovrete in qualche modo trovare un sistema per estrarre, isolare, questi composti in un altro mezzo, un solvente organico magari, per poi poterli analizzare con delle tecniche strumentali. Quindi, di solito, a monte di tutte le analisi c'è questa fase, che è quella dell'estrazione, che viene sempre spiegata ai corsi di cromatografia perché è alla base di tutte le tecniche cromatografiche.

Estrazione con solventi

Qual è lo scopo? Lo scopo è quello di estrarre un’analita o una serie di analiti da un certo campione per portarli nel mezzo poi più idoneo per l’analisi. Consideriamo un certo analita di un composto, questo composto è presente in una soluzione acquosa, questo soluzione da dove viene? Potrebbe essere già in un fluido biologico, l’urina ad esempio, l’acqua di fiume che volete analizzare oppure una bevanda che volete analizzare, oppure se alla vostra partenza avete un campione solido lo solubilizzate prima in un opportuno solvente acquoso, in acqua magari, quindi una volta ottenuta questa soluzione acquosa di partenza, qual è il vostro scopo? Quello di estrarre l’analita di interesse che è oggetto del vostro studio, che voi volete poi analizzare in un altro modo, in un opportuno solvente organico, e cosa fate? Questa è una provetta contente soluzione acquosa con l’analita, aggiungete un solvente organico immiscibile con l’acqua e quali soventi organici vi vengono in mente? L’esano (gli alcoli no!), l’etere etilico, l’acetato di metile, tutti solventi che hanno una densità inferiore all’acqua e si depositano sopra di essa, ma ci sono dei solventi con densità maggiore dell’acqua e si stratificano al di sotto di essa, come i solventi clorurati (tetracloruro di carbonio, cloruro di metilene, etc, che si tende a non usare in laboratorio perché tossici). Aggiungete questo solvente al soluto, ad esempio l’esano, cosa succede? Il vostro soluto deve avere una certa affinità per il solvente, altrimenti non estraggo nulla, deve cioè in qualche modo essere estratto dal solvente organico.

L’estrazione si basa sul coefficiente di ripartizione di Nerst, quindi voi aggiungete il solvente e questa soluzione si deve dibattere, ovvero si deve far in modo che ci sia il contatto tra queste due fasi anche se sono perfettamente immiscibili, quindi o si fa manualmente o ci sono dei sistemi basculanti o si usano gli ultrasuoni, poi dopo aver lasciato riposare un attimo le due fasi si riseparano perfettamente e molto spesso all’interfaccia troverete un’emulsione, uno strato non ben definito né di acqua né di solvente organico, allora cosa fate? Centrifugate la provetta in modo che sia la separazione netta tra le fasi, una volta ottenuta questa separazione avrete una parte delle molecole di soluto che sono passate in fase acquosa, state estraendo l’analita, ovviamente il K vi dice che è costante questo rapporto del soluto A in fase organica rispetto alla fase acquosa a temperatura costante, quindi K dipende dalla temperatura (per esempio a temperatura ambiente estraggo il 50% di analita, aumentando la temperatura estraggo l‘80%), dal solvente organico (per esempio con l’esano estraggo il 50%, con l’acetato di etile estraggo l’80%) e del soluto, non dipende dal volume e dalla concentrazione iniziale, perché è il rapporto tra le concentrazioni che si mantiene costante, è chiaro che se è troppo concentrata il solvente organico mi si satura, e quindi questo tipo di relazione va bene per soluzioni abbastanza diluite.

In realtà se volessimo essere un po’ più precisi, non è tanto il rapporto delle concentrazioni che si mantiene costante, bensì il rapporto delle attività del soluto nel solvente organico rispetto all’acqua. Quindi qui trovate una sorta di spiegazione di tipo termodinamico, dove, che cosa succede? Dopo che le 2 fasi hanno raggiunto l’equilibrio, la variazione di energia libera all’equilibrio è uguale a 0, ognuna delle due fasi è caratterizzata da una certa energia libera, la fase 1 da G = G + RT log a (attività della specie del soluto nella fase 1), dove G è l’energia libera standard di una sostanza ad attività unitaria. All’equilibrio G = G perché il ΔG = 0, allora io eguaglio le 2 relazioni. Quindi siamo arrivati qui: RT log a / a = ΔG / RT = log a / a e quindi passando dal log agli esponenziali avrò che a / a = E. Questo per dirvi che cosa? Che questa è una costante in quanto l’energia libera standard e il rapporto delle attività si mantiene costante a temperatura costante, quindi se vi ricordate l’attività è uguale a un coefficiente di attività per la concentrazione, per soluzioni abbastanza diluite i coefficienti di attività tendono all’unità e quindi si mantiene costante il rapporto tra le concentrazioni, siamo tornati al K; questo per farvi capire che trattandosi di un equilibrio chimico si dovrebbe parlare sempre di attività, poi trattandosi di soluzioni abbastanza diluite noi abbiamo sostituito l’attività con le concentrazioni e siamo ritornati all’equazione di Nerst espresso come rapporto tra le concentrazioni.

Molto spesso succede che le vostre molecole, i vostri composti, che voi volete estrarre in soluzione acquosa possono dar luogo a degli equilibri, pensate un attimo ad un acido, in soluzione acquosa è presente come H⁺A^- (AH ⇌ H⁺ A^-), quindi avete l’acido presente dissociato, in parte in forma indissociata in acqua, in parte in forma dissociata, quando aggiungete il solvente organico per estrarre questo tipo di composti dall’acqua, che cosa succede? Non riuscite a dissociare questa perché gli anioni e i cationi stanno molto bene in acqua perché vengono solvatati dalle molecole di acqua stessa (che ha un’elevata costante dielettrica) e l’acqua è costituita da H⁺ e O^-, che è molto più elettronegativo (è un dipolo), i vari anioni e cationi tendono a coordinare molecole di acqua intorno orientando i dipoli dell’acqua, quindi un anione con la parte H rivolta verso l’anione, il catione con la parte O rivolta verso il catione.

Quindi che cos’è che si estrae con il solvente organico? Solo la frazione indissociata. Allora si parla di rapporto di distribuzione (D), in acqua sono presenti queste 2 forme, ma in solvente organico è presente soltanto quella porzione indissociata che io sono riuscita ad estrarre. Si parla quindi di ratio di distribuzione (al numeratore ho la somma di tutte le forme in cui è presente il mio analita in solvente organico, al denominatore la somma di tutte le concentrazioni del mio analita presenti in fase acquosa). Quindi cosa succede? Che per gli acidi il K è diverso dal D (perché nel K si tiene conto solo del rapporto di queste forme, nel D si tiene conto di questa frazione indissociata in solvente organico rispetto alla somma di queste due in fase acquosa).

Per sostanze neutre, invece, tipo la glicerina, che a qualunque pH non varia, non si dissocia, non si protona, insomma è sempre in forma neutra, K = D.

Estrazione di una specie acida in solvente organico

Ora vi spiegherò come si fa ad estrarre efficacemente una specie acida in solvente organico. Intanto vi introduco un altro concetto, il percento di estrazione o resa di estrazione. Il vostro fine qual è durante tutta l’estrazione? Quello di tirare via l’analita dalla fase acquosa e portarlo nel solvente organico e voi lo vorreste fare al 100%, tutto quello che è presente in fase acquosa lo voglio portare nel solvente organico. Per percento di estrazione si intende il rapporto fra la quantità di analita che voi riuscite ad estrarre in solvente organico rispetto a quella iniziale. Ad esempio, se inizialmente ho una quantità, fate conto di 100 µg di analita presente in fase acquosa, io vorrei estrarlo tutto e quella sarebbe un’estrazione del 100%.