Metodologia della ricerca scientifica

Analisi dei dati proteomici

Il progetto prevede l'analisi dei dati proteomici ottenuti da diverse tipologie di campioni. Le coppie di campioni prese in considerazione sono le seguenti: MN vs MN, TUM vs TUM, plasma vs plasma. In ogni coppia sono presenti 10 campioni derivanti da topi trattati con MD e 10 con HFD. Inoltre, per ogni analisi viene aggiunto un terzo campione che rappresenta lo standard interno, composto da quantità equimolari di tutti e 20 i campioni analizzati contemporaneamente.

Il WP3, che si occupa dell'analisi dei dati, utilizza strumenti informatici di analisi statistica per confrontare le differenze di espressione proteica tra i risultati ottenuti tramite elettroforesi 2D DIGE.

Task 1.1: L'obiettivo di questa analisi è identificare le variazioni di espressione proteica in base ai confronti descritti nella Task 1.2 del WP2. In questo modo è possibile individuare le proteine che mostrano le maggiori variazioni all'interno dello stesso tipo di tessuto in base al tipo di dieta.

Task 1.2: Una volta individuati i marcatori proteici che mostrano le maggiori variazioni per ciascun tessuto solido, si procede alla ricerca di eventuali variazioni anche a livello plasmatico.

mesi e settimane per ogni task:

Mesi	Settimane	Task
1-5	1	Task 1.1: induzione gruppo 1 gruppo 2 CRC per via chimica.
	2-22	Task 1.2: trattamento WP1 alimentare con MD o trattamento alimentare HFD.
6-11	23	Task 1.3: sacrificio e prelievo campioni.
	24-44	Task 1.1: estrazione proteica dai campioni di tessuti solidi e WP2 sangue.
11-12	45	Task 1.2: elettroforesi 2D DIGE sui campioni proteici estratti. WP3 analisi statistica dei dati
	46-48

Figura 5. Diagramma di Gantt relativo alla suddivisione temporale in mesi e settimane per ogni task.

Mesi e settimane del progetto ORANGE e dei WP.- 7 -5.2 Milestones e Deliverables del progetto

Per ciascun WP sono stati definiti degli obiettivi e traguardi intermedi da raggiungere (milestone) che permetteranno, durante i 12 mesi, di valutare il corretto progresso temporale e sperimentale del progetto. Di seguito si riportano le milestones (M) principali, consapevoli, tuttavia, che nel corso del progetto potranno esserne fissate di nuove in base all'evoluzione stessa della sperimentazione.

• M1 (settimana 23): Al momento del sacrificio del primo gruppo di topi, nella mucosa colica che viene analizzata devono essersi sviluppati adenomi e carcinomi, a conferma che il modello scelto di cancerogenesi per via chimica è corretto.
• M2 (settimane 24-44): Si valutano differenze significative nel profilo di espressione proteica in base al tipo di alimentazione MD o HFD in tessuti solidi (MN e TUM) e plasma.
• M3: Si individuano marcatori in comune tra i tre tessuti

Analizzati che differiscono in espressione tra topialimentati con la dieta MD e HFD. Si sottolinea soprattutto l'importanza della milestone M1 il cui raggiungimento è fondamentale ai fini della validità dell'intero progetto. In caso di mancato raggiungimento sarà necessario provvedere a cambiare le dosi di AOM/DSS, oppure usare un altro tipo di trattamento di cancerogenesi indotta per via chimica in modello di topo. Inoltre, si aggiungono anche i seguenti deliverables (D) per valutare l'andamento del progetto:

• D1 (settimana 22 e settimana 44): Report del WP1 sul numero di topi che hanno completato il trattamento alimentare di 20 settimane complete e quanti invece sono stati sacrificati prima del termine, per esempio per motivi di salute non più compatibili con l'esperimento.
• D2 (settimana 44 e 46): Report del WP2 sulle analisi di espressione differenziale in elettroforesi 2D DIGE in seguito all'analisi dei campioni.

provenienti dai topi del gruppo 1 (settimana 44) e gruppo 2 (settimana 46).

• D3 (settimana 48): Terminazione dell'articolo divulgativo sui risultati ottenuti nell'esperimento e sottomissione dello stesso all'organo di revisione scientifico della rivista di pubblicazione.

5.3 Piano di rischi e misure di contingenza

Nonostante il progetto sia disegnato in modo tale da sostenere la massima fattibilità possibile, per ogni pacchetto di lavoro WP sono previsti dei problemi che potrebbero verificarsi nel corso della sperimentazione. Nello specifico si presentano i seguenti rischi, con i relativi piani di contingenza:

• WP1: A causa dello sviluppo di adenomi e carcinomi nella mucosa colica, alcuni topi potrebbero, prima del termine delle 20 settimane di trattamento alimentare, accusare sintomi di malessere come dimagrimento eccessivo, sangue nelle feci e altri correlati allo sviluppo del CRC. A tal fine gli animali sono attentamente monitorati quotidianamente.

annotando ogni sintomo rilevante e settimanalmente sono pesati per tenere sotto controllo l'andamento del peso al fine di identificare precocemente malesseri dell'animale. In questo caso si procede al sacrificio anche prima dello scadere delle 20 settimane. Inoltre, la pesatura settimanale serve a prevenire un altro eventuale problema, ovvero è possibile che a parità di dieta alcuni topi possano rispondere in modo diverso nella variazione della massa grassa, portando ad avere al momento del sacrificio topi che pesano molto diversamente. Per escludere questo fatto, che potrebbe essere un fattore interferente nelle analisi (poiché l'obesità è un noto fattore di rischio), il controllo del peso serve anche ad aggiustare la quantità di dieta somministrata ai topi durante le 20 settimane. - WP3: I dati raccolti dopo l'analisi dei 20 topi trattati con i due regimi alimentari potrebbero essere insufficienti a ottenere

differenze significative nell'espressione proteica sia nel caso dei tessuti solidi che del sangue. A tal fine si prevede un'implementazione di ulteriori topi per arricchire il numero di campioni, in modo tale da ottenere dati più precisi.

6. Materiali e metodi

6.1 Modello animale

Il progetto ORANGE si propone di valutare le variazioni proteomiche in tessuti di mucose normali e tumori di CRC e in sangue prelevati da modelli animali in vivo di CRC. A tal proposito sono stati valutati tanti modelli diversi di sviluppo di cancerogenesi in vivo, considerando sia modelli di cancerogenesi spontanea che indotta. Tuttavia, i modelli di cancerogenesi spontanea si scartano a causa della loro imprevedibilità e scarsa riproducibilità, considerando che solo il 40% dei ratti sviluppano tumore, con un periodo di latenza di circa 8 mesi (Nascimento-Goncalves et al., 2021). D'altra parte, sono invece molto più utili i modelli di CRC indotti per via chimica o per via genetica,

dove però questi ultimi sono per lo più usati per imitare le alterazioni genetiche delle forme di CRC spontanee o ereditarie, ma che nel progetto non vogliamo considerare, cercando di valutare le forme di CRC sporadiche testando il contributo dell'alimentazione. Per questi motivi il modello di CRC indotto per via chimica soddisfa meglio le nostre esigenze, essendo spesso usati per testare gli effetti di molecole e sostanze nella chemioprevenzione e nel trattamento del CRC. Nello specifico, tra i modelli di induzione di CRC per via chimica tra quelli sviluppati più recentemente e con maggior successo troviamo il trattamento del modello di topo BALB/c con una somministrazione singola intraperitoneale di Azossimetano (AOM) (10mg/Kg) seguita, sette giorni dopo, dalla somministrazione di Destrano Sodio Solfato (DSS) disciolto in acqua al 2% per sette giorni. In questo modo, fu dimostrato da Tanaka et al. (2003), che dopo 20 settimane di trattamento l'88% degli

animali riporta una displasia al colon con un'incidenza del 100% di adenomi e adenocarcinomi. Inoltre, tutti i topi durante il periodo del trattamento vengono mantenuti nello stabulario in condizioni controllate di temperatura e umidità, con cicli di luce e buio di 12 ore, in gabbie con una mangiatoia attraverso la quale fornire le diete e una boccetta per fornire l'acqua, sia durante il trattamento chimico con il DSS disciolto, sia durante le 20 settimane di trattamento alimentare.

6.2 Trattamento alimentare: dieta Mediterranea

La dieta Mediterranea è stata riconosciuta come Patrimonio Culturale Immateriale dell'Umanità nel 2010 dall'UNESCO (Farinetti et al., 2017), ed origina dalle culture e tradizioni alimentari delle antiche popolazioni che si sono sviluppate intorno al Mar Mediterraneo. Tale dieta si basa prevalentemente su un consumo regolare di olio di oliva (come principale fonte di grassi aggiunti), alimenti vegetali (cereali, verdure, legumi,

alcool (per lo più vino rosso), con l'aggiunta di un consumo limitato di carne rossa e altri prodotti a base di carne (Lăcătușu et al., 2019). Ancel Keys, biologo statunitense, fu il primo a ipotizzare, in uno studio del 1958, una correlazione tra un modello di dieta e lo sviluppo di patologie di vario tipo, definendo per la prima volta il termine "dieta Mediterranea", ma negli anni la definizione originaria è evoluta ed è stata più volte cambiata (Pett et al., 2017). Le descrizioni generali della dieta Mediterranea sono abbastanza simili in molte pubblicazioni, sottolineando gli stessi principali componenti, tra cui un consumo regolare di olio di oliva (come principale fonte di grassi aggiunti), alimenti vegetali (cereali, verdure, legumi, semi, frutta), con un moderato consumo di pesce, prodotti caseari, ed un basso moderato consumo di alcool (per lo più vino rosso), con l'aggiunta di un consumo limitato di carne rossa e altri prodotti a base di carne (Lăcătușu et al., 2019).

alcool (per lo più vino rosso), con l'aggiunta di un consumo limitato di carne rossa e altri prodotti a base di carne (Lăcătușu et al., 2019).

Alcuni dati interessanti, utili al fine della realizzazione della dieta da somministrare ai modelli animali di topo, sono raccolti nella review Definition of the Mediterranean Diet: A Literature Review di Davis et al. (2015). Secondo i dati raccolti da questa review, la dieta Mediterranea si caratterizza di un apporto energetico medio di 9316 KJ/giorno (ovvero 2226 Kcal/giorno), fornendo circa il 37% di tale energia dai grassi totali, 19% dagli acidi grassi monoinsaturi (MUFA), 5% dagli acidi grassi polinsaturi (PUFA), 9% dagli acidi grassi saturi (SFA), 15% dalle proteine ed il restante 43% dai carboidrati (CHO) (tabella 1).

Medie ± SD dei grammi per giorno dei nutrienti della dieta Mediterranea, ottenuti dai dati collezionati dagli articoli revisionati nel Definition of the Mediterranean Diet: A Literature Review

(Davis et al., 2015). Sulla base di questi dati si replica una dieta Mediterranea da destinare ai modelli sperimentali al fine di valutarne i benefici nello sviluppo del