Metabolismo nucleotidi

II tappa: →

Xantilato (XMP) GMP

Enzima: GMP sintasi

Nela seconda tappa una molecola di glutammina

fornisce un gruppo amminico al C2 del XMP,

convertendosi in glutammato. La reazione necessita di

ATP che si scinde in ADP + Pi.

La strategia che adotta la cellula per mantenere una

sintesi equilibrata di nucleotidi è quella di utilizzare:

- GTP nella sintesi di AMP: la disponibilità di GTP aumenta la sintesi di AMP

- ATP nella sintesi di GMP: la disponibilità di ATP aumenta la sintesi di GMP

Regolazione

La tappa di controllo principale nella sintesi delle purine è la reazione che converte la fosforibosil-1-pirofosfato (PRPP) in 5-

fosforibosilammina, tramite cessione di un gruppo amminico dalla glutammina. L’enzima regolatore è glutammina PRPP

amino-transferasi.

L’attività dell’enzima è regolata a livello allosterico tramite inibizione da prodotto: i prodotti finali IMP, AMP e GMP agiscono in

modo sinergico nell’inibire l’enzima. Un elevata quantità di PPRP, il reagente, determina invece aumento della sintesi.

- L’enzima inattivo si presenta in forma dimerica

- L’enzima attiva si presenta in forma monomerica

Via di recupero delle purine

Nella via di recupero delle purine si parte dal fosforibosil-1-fosfato (PPRP), al quale viene trasferita una base azotata derivante

dal metabolismo degli acidi nucleici. →

Base + PRPP Base-ribosio-fosfato + Ppi

In questa reazione la base viene unita a livello del C1 tramite la liberazione del pirofosfato.

Abbiamo due enzimi che partecipano alla via di recupero delle purine:

- Adenina-PRT (A-PRT): che catalizza la reazione

→

o Adenina + PRPP AMP + PPi

- Ipoxantina/Guanina-PRT (HG-PRT) che catalizza le reazioni:

→

o Guanina + PRPP GMP + PPi

→

o Ipoxantina + PRPP IMP + PPI

Patologie: sindrome di Lesch-Nyhan

Questa sindrome comporta una ridotta o assente attività della HG-PRT. Siccome a livello del SNC è preferita la via di salvataggio

delle purine piuttosto che la via di sintesi de novo, tale sindrome colpisce soprattutto il SNC determinando:

- Danno diretto: mancata sintesi di nucleotidi purinici e DNA.

- Danno indiretto: mancata inibizione delle sinesi de novo negli altri tessuti, per aumento del PRPP. Si crea un eccesso di

nucleotidi che vengono catabolizzati in acido urico.

Sintomi: comportamento di automutilazione, deficienza mentale e spasticità, calcoli renali di urato e gotta.

Sintesi di nucleotidi pirimidinici

Sintesi de novo

La sintesi delle pirimidine avviene in modo inverso a quella delle purine: prima si costituisce la base azotata e infine questa si

coniuga al PRPP.

Il primo nucleotide che si forma è l’uridilato o uridina 5’ monofosfato (UMP), con la uracile.

I tappa: →

bicarbonato + glutammina carbamil-fosfato

Enzima: carbamil-fosfato sintetasi II (CPS II)

L’enzima carbamil-fosfato sintetasi si trova in due forme:

- Forma mitocondriale o CPS I: agisce nel ciclo dell’urea utilizzando come fonte di

azoto l’ammoniaca

- Forma citosolica o CPS II: agisce nella sintesi di uracile utilizzando come fonte di

azoto la glutammina

La reazione si svolge in presenza di 2 ATP.

II tappa: →

Carbamil-fosfato + aspartato N-carbamil-aspartato

Enzima: aspartato transcarbamilasi

Il carbamil-fosfato dona due atomi all’anello pirimidinico. Gli altri atomi derivano dall’aspartato.

A partire dall’N-carbamil-aspartato, che deriva dall’unione di carbamil-fosfato e aspartato, avvengono altre reazioni:

- Rimozione di una molecola d’acqua da parte dell’enzima diidroorotasi e chiusura dell’anello sotto forma di

diidroorotato

- Ossidazione dell’anello per produrre orotato

- Legame con il PRPP, eliminazione del PPi e formazione dell’orotidilato.

- Decarbossilazione dell’orotidilato a uridilato mono fosfato o UMP

- Fosforilazione dell’uridilato monofosfato a uridilato trifosfato o UTP, tramite 2 ATP

→

o UMP + ATP UDP + ADP

→

o UDP + ATP UTP + ADP

L’UMP rappresenta un intermedio chiave della sintesi delle pirimidine

Dall’UTP si forma il nucleotide della citosina, la citidina

5’-trifosfato (CTP)

La reazione prevede una riduzione dell’anello dell’UTP e

la cessione da parte di una glutammina che diventa

glutammato di un gruppo NH3. L’idrolisi dell’ATP in ADP

+ Pi permette energeticamente lo svolgimento della

reazione.

Regolazione della sintesi de novo delle pirimidine

La regolazione avviene principalmente a livello di CPSII, Carbamil-Fosfato sintasi II, che genera carbamil-fosfato a partire da

bicarbonato e glutammina. L’enzima è inibito dal prodotto, ovvero da UTP, e attivato da PRPP.

Un altro enzima che contribuisce alla sintesi de novo dei nucleotidi purinici è l’aspartato transcarbossilasi, un enzima allosterico

che trasferisce l’aspartato al carbamil fosfato. Questo enzima è inibito da CTP.

Via di recupero delle pirimidine

In questa via le basi sono riciclate da basi preesistenti e coniugate al ribosio-1-fosfato tramite l’enzima fosforilasi del nucleoside.

Dal nucleoside ottengono tramite una chinasi e un ATP il nucleotide corrispondente e la liberazione di ADP. La reazione è

irreversibile →

Base + ribosio 1-fosfato nucleoside + Pi (enzima: fosforilasi del nucleoside)

Nucleoside + ATP = nucleotide + ADP (enzima: nucleoside-chinasi)

Questa via di recupero delle pirimidine è comune a molti tessuti, a differenza della via di recupero delle purine che avviene solo

in alcuni distretti come il SNC.

Interconversione dei nucleotidi

I monofosfati sono il prodotto della sintesi de novo dei nucleotidi sebbene i triofosfati solo le forme più comunemente usate.

Nella fosforilazione intervengono chinasi ATP-dipendenti specifiche che catalizzano due reazioni di fosforilazioni:

→

base – monofosfato + ATP base – difosfato +ADP

→

base – difosfato + ATP base – trifosfato + ADP

Per esempio, interviene nella fosforilazione dell’adenosina monofosfato (AMP) l’adenilato chinasi.

Questo meccanismo consente di mantenere in equilibrio la popolazione nucleotidica. I gruppi fosfato sono ceduti solamente

dall’ATP.

Sintesi dei desossiribonucleotidi

I desossiribonucleotidi vengono sintetizzati a partire dai ribonucleotidi, ad eccezione del deossitimidilato (dTMD) che ha una via

di sintesi indipendente.

L’enzima chiave nella conversione dei ribonucleotidi in desossiribonucleotidi è la ribonucleotide reduttasi, che permette la

sostituzione del gruppo ossidrilico in C2 del ribosio con un idrogeno.

Per quanto riguarda la sintesi del deossitimidilato, essa avviene tramite l’enzima timidilato sintasi.

Ribonucleotide reduttasi

Questo enzima presenta 4 subunità:

- 2 subunità α: in cui sono presenti:

o Sito S (di specificità), in cui si legano

ATP, dATP, dGTP, dTTP

o Sito A (di attività), in cui si legano ATP o

dATP

o Sito C (catalitico) con due residui di Cys

con gruppi -SH

- 2 subunità β: dove si trovano un residuo di Tyr e

3+

un centro Fe , servono a generare un radicale

La regolazione dell’attività dell’enzima ribonucleotide reduttasi avviene per opera dei siti S e A della subunità α.

- Il sito A lega ATP o dATP:

o se questo sito lega dATP significa che nella cellula c’è massiva presenza di desossiribonucleotidi, per cui

l’enzima viene inattivato

o se questo sito lega ATP significa che nella cellule c’è massiva presenza di ribonucleotidi, per cui l’enzima viene

attivato per convertirli in desossiribonucleotidi.

- Il sito S lega diversi ribonucleotidi trifosfato: a seconda del ribonucleotide legato si definisce il substrato che verrà

legato nel sito C catalitico

o se il sito S lega dATP (nucleotidi adenilici), il sito C lega UDP (uridinici) e CTP (timidinici)

o se il sito S lega dGTP, il sito C lega ADP

o se il sito S lega dTTP, il sito C lega GDP

Meccanismi d’azione:

- il substrato entra nel sito attivo dell’enzima che si trova nell’interfaccia tra la subunità α e la β.

- si forma un radicale tirosilico per la presenza nella subunità β della Tyr.

- l’ossidrile in C2 viene protonato da -SH del residuo di Cys

- viene eliminata H2O e si forma un radicale carbocationico stabilizzato

- Si crea il ponte disolfuro o ditiolico tra i due residui i Cys e due elettroni vengono trasferiti al carbonio 2

- si riforma il radicale tirosilico sull’enzima

- il ponte disolfuro viene ridotto

I due residui di Cys partecipano alla riduzione del ribosio ossidandosi e formando un ponte disolfuro. Per poter procedere con

altri cicli si deve tornare alla forma ridotta di -SH, e questo avviene tramite due cascate enzimatiche:

1. tramite la tioredossina, che utilizza NADPH e FAD

2. tramite la glutaredossina, che utilizza NADPH e glutatione

Tioredossina

La tioredossina presenta al suo interno 2 residui di Cys. Permette la riduzione del ponte disolfuro dell’enzima ribonucleotide

reduttasi tramite:

- riduzione del ponte disolfuro e contemporanea ossidazione dei propri residui di Cys

- riduzione del proprio ponte disolfuro tramite ossidazione di FADH2 in FAD, catalizzata dall’enzima tioredossina

reduttasi che presenta una selenocisteina. + +

- Riduzione dei FAD a FADH tramite ossidazione del NADPH + H a NADP

2

Glutaredossina

La glutaredossina agisce in modo simile alla tioredossina ma presenta al posto del FAD il glutatione.

- riduzione del ponte disolfuro della ribonucleotide reduttasi e contemporanea ossidazione dei propri residui di Cys

- riduzione del proprio ponte disolfuro tramite ossidazione del glutatione (GSSG)

+ +

- Riduzione del glutatione a 2GSH tramite ossidazione del NADPH + H a NADP

Sintesi di deossitimidilato (dTMP)

Questa reazione non si serve dell’enzima ribonucleotide reduttasi

ma presenta un enzima proprio, l’enzima timidilato sintasi.

Questa diversa modalità di sintesi ha un’origine evolutiva precisa e

testimonia il passaggio da un “mondo a RNA” ad un “mondo a

DNA” successivo.

La timidilato sintesi utilizza la desossiuridina monofosfato

(dUMP), che può derivare sia dall’uridina di fosfato (UDP) sia dalla

citidina difosfato (CDP). Quest’ultima via è quella più usata.

→

1. CDP dCDP: rimozione del gruppo -OH su C2 tramite

ribonucleotide reduttasi

→

2. dCDP dCTP: aggiunta di un gruppo fosfato tramite

nucleoside difosfato chinasi

→

3. dCTP dUTP: deamminazione tramite deamminasi

→

4. dUTP dUMP: rimozione di 2 gruppi fosfato tramite la

dUTPasi

→

5. dUMP dTMP: metilazione del C5 tramite timidilato sintasi

→

Ultima tappa: dUM