Medicina Rigenerativa

La medicina traslazionale è definita come tutto l’insieme di cose che servono

perché una ricerca promettente possa arrivare al paziente, ciò che manca

per colmare il vuoto tra la ricerca e l’applicazione clinica.

Un biotecnologo che conosca sia la ricerca di base che le problematiche regolatorie

può invece discutere efficacemente con le autorità, in quanto più competente in

materia, per ottenere un miglior tayloring (=adattamento delle regole a questo tipo

sistema).

Inoltre, si trova ad avere un vantaggio competitivo dal punto di vista professionale,

anche per un colloquio di lavoro, sugli altri candidati, perché già inserito nella logica

del mondo del lavoro.

In un sistema complesso la singola proteina può essere downregolata o

 upregolare a seconda della funzione. Va quindi verificato che ci sia un gruppo

di proteine che rispecchia un gruppo di funzioni, ed è proprio la funzione

l’aspetto più importante: bisogna sempre controllare che la funzione ci sia.

Per intervenire sulla maggior parte degli organi non bisogna trascurare gli

 aspetti biomeccanici: molto spesso nel tissue ingeneering abbiamo a che

fare con supporti, scaffold, strutture 3D. Quando progettiamo uno strumento

dobbiamo porci problemi che esulano dal normale pathway cellulare.

Quando progettiamo un protocollo di medicina rigenerativa dobbiamo pensare

 che, oltre alle funzioni differenziate e specialistiche, il tessuto deve mantenere

le capacità proliferativa sotto il controllo dei fattori fisiologici, stando attenti

a non creare un tumore.

Bisogna trovare il modo di ricreare il microambiente cellulare in modo che si

mantengano equilibri corretti tra proliferazione, differenziamento e funzioni

specializzate di quel tessuto.

La difficoltà maggiore è infatti riuscire a creare un sistema equilibrato che si

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autoregoli. che abbia quantità di staminali e cell differenziate in equilibrio

Quando dobbiamo studiare la regolazione di un tessuto, a parte metterlo in un

 modello animale in cui le condizioni sono molto diverse da quelle dell’uomo,

possiamo mimare determinati comportamenti attraverso sistemi di coltura

alternativi con bassi livelli di O . In queste condizioni la cellula risponde ai fattori

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che somministriamo, agli stimoli che diamo con una metabolizzazione, un

meccanismo di funzionamento, differenziamento, proliferazione completamente

diverso.

Nel nostro sistema di ricostruzione, non possiamo paragonarci soltanto a una

 pelle integra, ma ad una pelle in fase di chiusura di una lesione. Serve una

mentalità dinamica, anche nell’analisi dei marcatori, delle proteine,

dell’espressione; ragion per cui serve sempre più di un controllo per analizzare

un sistema che si muove in maniera dinamica, come in chiusura di una ferita.

Cellule staminali

La cellula staminale per antonomasia è quella embrionale che deriva dai tre foglietti

della gastrula da cui possiamo ottenere più di 200 tipi cellulari. Viene studiata per

coltivarla e poter riprodurre dei tessuti, tuttavia è sempre una cellula allogenica, di un

altro individuo. La cellula staminale embrionale può svolgere ogni funzione ma bisogna

darle i giusti segnali, per evitare che dopo un trapianto formi un teratoma.

Le potenzialità della medicina rigenerativa sono tante, non solo ricostruire un organo e

reimpiantarlo nell’individuo come si potrebbe pensare:

Può servire a identificare target di farmaci e studiare potenziali agenti

 terapeutici;

Si possono studiare, trattare o prevenire difetti congeniti

 Si può studiare il differenziamento cellulare, capire la biochimica e come

 correggere le patologie legate a questi aspetti

Si possono avere modelli umani alternativi agli animali e modelli di patologia;

 questi ultimi sono molto complessi ma necessari, poiché a volte, nonostante

l’omologia che si possa avere tra uomo e modello animale, possono comunque

presentarsi grandi differenze nello sviluppo delle patologie.

(topo mdx per Duchenne e fibrosi cistica

Le terapie cellulari prodotte grazie alla medicina rigenerativa vanno sotto la

denominazione di ATMP (advanced therapy medicinal product). Questo è il processo di

discovery che ci sta dietro

È necessario tornare indietro ogni volta che emergono differenze rispetto all’ipotesi

originale.

Anche post trapianto si torna sempre verso gli studi di ricerca di base per capire cosa

accade in vivo: importante in primo luogo è la farmacovigilanza, per valutare nel

tempo gli eventi avversi e a cosa possano essere legati, anche quando questi non

sembrano essere dovuti alla terapia in sé. Ogni evento che interessa il paziente viene

considerato evento avverso che deve essere quindi analizzato.

Da dove si inizia quando si vuole fare medicina rigenerativa?



Domanda 1: qual è l’obiettivo terapeutico? È una domanda che non si pone

 mai nessuno.

Normalmente il ricercatore si pone l’obiettivo della ricostruzione del tessuto e

l’obiettivo terapeutico viene “inventato” solo dopo. L’obiettivo terapeutico

invece dovrebbe essere il punto di partenza. È necessario sapere da subito in

quale patologia vado ad utilizzarlo, perché a seconda della patologia varò un

microambiente leggermente diverso. 

Domanda 2: ci sono alternative terapeutiche? Se sì che problemi danno? La

 medicina rigenerativa non si fa se esiste un’alternativa migliore, perché e un

processo complesso costituito da molti step ed ognuno comporta il rischio di

eventuali errori. Nelle terapie si deve sempre valutare il rapporto beneficio-

rischio.

Quali materiali e substrati possono essere approvati per uso clinico? Non tutti i

 supporti possono essere impiegati per uso clinico. Se il substrato è riassorbibile

ci si chiede se il monomero che entrerà in circolo sia tossico o meno per

l’organismo. Se non è riassorbibile ci si chiede invece quali siano gli eventuali

effetti di un’integrazione in vivo, se sia tossico per le cellule che stiamo

coltivando, se può limitarne le funzioni o impedire loro di svolgere le funzioni

Che materiali, substrati e farmaci ci serviranno? Le cellule in attecchimento

 sono estremamente sensibili ai farmaci che utilizziamo; alle dosi cliniche tutto è

tossico, perché queste prevedono un legame alle proteine plasmatiche che

sequestrano il 90% del farmaco e prevedono tessuti intatti. In tessuti in fase di

attecchimento, se il farmaco viene somministrato in maniera diretta non sarà

legato dalle proteine plasmatiche e si avrà una dose molto maggiore rispetto a

quella che arriverebbe dal circolo sanguigno che possono uccidere le cellule,

anche alle dosi terapeutiche che normalmente si utilizzano.

Come stimolare le risposte delle cellule residenti e quiescenti? In alcuni casi

 l’effetto paracrino va a risvegliare delle cellule che a causa della patologia non

erano più in grado di rispondere agli stimoli e le mette nella condizione di

ricominciare a funzionare.

Domanda 3: come possiamo raggiungerlo? Anche in questo caso biotecnologi e

 medici devono collaborare per progettare il tessuto e decidere il modo migliore

per inserirlo nel paziente. Bisogna tener conto della resistenza meccanica,

dell’utilizzo di supporti permanenti o transienti, se siano necessari questi

supporti o si possa fare un’iniezione.

Esempi:

per le cellule epiteliali l’iniezione è sempre sconsigliabile perché questo

 tipo di cellula mantiene il potenziale proliferativo attraverso il

meccanismo di adesione

nella correzione delle patologie ematopoietiche (immunodeficienza ADA)

 è invece possibile effettuare un’iniezione delle cellule geneticamente

modificate.

Per la retina, in alcuni casi si iniettavano cellule, in altri casi si

 utilizzavano degli inserti in punti precisi (anche se solo il secondo

approccio ha poi effettivamente funzionato)

Tipi di cellule staminali utilizzate

La rigenerazione dei tessuti è ottenuta da cellule staminali (embrionali, IPS o adulte)

che possono essere coltivate. Le staminali embrionali sollevano un ampio dibattito

etico.

Bisogna però ricordare che il dibattito etico non riguarda solo le staminali embrionali,

ma anche gli altri tipi di staminali, sebbene per ragioni diverse. Anche per le cellule

mesenchimali adulte ad esempio si apre un dibattito etico, quando vengono

impropriamente utilizzate e gli vengono falsamente attribuite delle funzioni che non

hanno.

Medicina rigenerativa: ci aspettiamo che offra speranze per persone che soffrono,

quando non c’è trattamento, laddove la vita è a rischio e/o la qualità della vita è

gravemente compromessa.

Approcci della medicina rigenerativa

Terapia cellulare per tessuti e organi, include anche quella genica.

 Rigenerazione di tessuti usando materiale biocompatibile e cellule (non

 sempre); in alcuni casi il solo materiale biocompatibile può svolgere azioni

chemiotattiche e può favorire la rigenerazione endogena (ad esempio:

rigenerazione dell’osso, è il materiale che svolge l’azione bioattiva molto più

che le cellule che lo colonizzano).

Attivazione di cellule endogene per stimolare gli approcci di medicina

 rigenerativa.

A tutto questo va aggiunta la ricerca di base per la comprensione dei

meccanismi prima e dopo il trapianto.

NB: nessuno di questi 3 approcci funziona in assenza di ricerca di base.

C’è una necessità di qualcosa di realmente terapeutico che quindi porti ad un

beneficio clinico. Per questo sono necessari dati preliminari appropriati anche dal

punto di vista regolatorio e legislativo, dati relativi a rischi della salute e tecnologie,

capacità di controllo dei meccanismi intermedi per verificare che lo strumento non

diventi tossico per le cellule, possibilità di espandere conoscenze sulle nuove terapie.

Terapia cellulare per tessuti ed organi

La terapia cellulare di tessuti e organi si focalizza sulla ricostruzione appunto di tessuti

e organi danneggiati o malati. Il sistema può usare cellule sia autologhe che

allogeniche (in questo caso va valutata la trasmissione delle malattie) e deve avere un

approccio traslazionale rimuovendo tutte le limitazioni o colli di bottiglia che possono

bloccare il raggiungimento dell’obiettivo terapeutico.

Devono essere compresi i meccanismi molecolari e va valutata l’immunogenicità del

trattamento, soprattutto nella terapia genica nella quale spesso introduco una

proteina che il sistema immunitario non conosce.

Rigenerazione tessuti usando materiali biocompatibili con cellule

Non occorre solo la compatibilità ma bisogna vedere se aderisce, se la matrice non

venga degradata, accertarsi che la cellula non digerisca il supporto, e che i pezzetti,

qualora fossero digeriti, non siano tossici (i monomeri spesso sono più tossici rispetto

al polimero inerte).

Se c’è solo biomateriale, questo deve essere bioattivo, attrarre al suo interno i

componenti necessari per ricostruire l’organo o tessuto. Nel caso dell’osso è

importante la capacità di migrazione degli osteoblasti e anche i precursori degli stessi

devono migrare e poi, in sede, differenziare e formare la matrice. quindi il materiale

deve attrarre questi due tipi cellulari specifici del tessuto, ma anche vasi, nervi, altri

tessuti, cellule del connettivo.

Attivazione meccanismi endogeni

Spesso quando trapiantiamo organi, tessuti o matrici bioattive abbiamo anche la

stimolazione delle cellule endogene. A volte è un meccanismo che funziona da solo, ad

esempio, è stato che somministrando il NGF nelle ulcere neurotrofiche oculari si

rigenera completamente la cornea, il paziente guarisce; diversamente si buca l’occhio,

perché l’ulcera porta al riassorbimento della cornea. Chirurgicamente gli impianti

senza innervazione non resistono, ma con NGF si può guidare la re-innervazione con la

chiusura dell’ulcera. Il trattamento è stato scoperto grazie a un team italiano ed è ora

a disposizione dei pazienti.

L’organo deve rimanere integro, se ci sono ulcere si forma un buco, l’epitelio ha le sue

cellule staminali ma non riesce a chiudersi senza innervazione (ricorda la connessione:

epiteli di rivestimento a contatto con esterno, i nervi dicono al cervello ciò che hanno

riferito gli epiteli).

La terapia cellulare

É una terapia effettuata mediante l’uso di cellule o inserimento nell’organismo di

cellule isolate o tessuti, ricostruiti, amplificati e selezionati in laboratorio a partire da

cellule isolate, allo scopo di trattare una mancanza di tessuto dovuta a patologie

invalidanti, incidenti o rimozione chirurgica.

Meccanismi: isolare le cellule in grado di stimolare la rigenerazione dei tessuti,

stimolare cellule in vitro al fine di avere effetti in vivo, rigenerazione in vitro dei tessuti

che devono essere trapiantati.

In condizioni di emergenza, per la ricostruzione del tessuto, la cellula staminale deve

essere istruita per alternare divisioni simmetriche (moltiplica sé stessa per aumentare

la massa) e divisioni asimmetriche (genera sé stessa e cellule differenziate).

L’alternanza deve portare allo stesso rapporto preciso che c’era nel tessuto d’origine

Limiti studi di base sulle cellule staminali

Gran parte delle cellule staminali embrionali ed adulte sono state ottenute da modelli

animali.

Alcune limitazioni possono essere:

La localizzazione delle staminali (ci sono punti precisi, non necessariamente c’è

 la disposizione ubiquitaria come nella pelle).

La loro rarità

 La difficoltà di isolamento (è facile che perdano la funzione di staminale in

 questa fase o durante la coltura perché non hanno più gli stimoli regolatori).

L’identificazione delle cellule

 Il loro mantenimento in coltura



Durante la fase di amplificazione in coltura è opportuno conferire alla cellula i giusti

stimoli per il mantenimento della staminalità, altrimenti la cellula differenzia.

Questi passaggi hanno implicazioni sulla selezione dei modelli preclinici (richiesti per

la certificazione di terapie). Bisogna sempre focalizzarsi su obiettivi terapeutici e

funzioni; per le staminali soprattutto, è importante la ricerca di base oltre che quella

applicata.

Anche quando abbiamo tarato le condizioni ottimali di coltura, con istruzioni giuste,

soprattutto le cellule staminali, riescono a rimanere come tali per poco tempo, poi

iniziano ad accumulare danni genetici. Ragion per cui bisogna dare opportuni stimoli

nei primi passaggi di coltura perché più a lungo restano nell’ambiente artificiale più è

probabile che modifichino le proprie caratteristiche.

In coltura riesco comunque mimare l’ambiente fisiologico, ma solo per periodo di

tempo limitato.

Di seguito sono elencati alcuni modelli consolidati di tessuti ricostruiti: pelle, occhio,

osso, sangue, e ne stanno emergendo altri (retina).

Un esempio è il trapianto di cellule allogeniche, di altro individuo. in alcuni casi di

trapianto d’organo (cuore) è necessario un trattamento a vita con farmaci antirigetto.

In altri casi invece l’esame a lungo termine, se funziona il trapianto, mostra che il

tessuto rinnovato contiene solo le cellule del paziente e non presenta più quelle del

donatore.

Ciò funziona solo se nel paziente ci sono residui di cellule residenti in grado di

rispondere alle sollecitazioni.

Possibili meccanismi di funzionamento della terapia cellulare

In assenza totale o parziale del tessuto sarà necessario l’attecchimento di un

 tessuto, o gruppo di cellule che contenga cellule staminali per ripristinare la

funzione.

Nel caso di un danno tissutale parziale si va a stimolare la risposta

 infiammatoria dell’ospite o a reprimerla, poichè entro un certo livello favorisce

la rigenerazione del tessuto, se la risposta sale oltre il livello soglia diventa

impedimento.

in caso di correzione di un deficit biochimico si procede mediante rilascio di

 sostanze mancanti per la rigenerazione (enzimi, proteine della matrice e NGF).

Necessità di secrezione di fattori di crescita mediante stimolazione della

 risposta dell’ospite e migliorata sopravvivenza e funzione delle cellule residenti

nel tessuto agendo con meccanismo d’azione indiretto.

Se ho necessità di reinnervazione locale (ulcere neurotrofiche della cornea) mi

 basta indurre il rilascio di sostanze che sostengono l’innervazione da parte dei

neuroni, anche se non basta solo questo in alcuni casi.

Necessità di rivascolarizzazione: in questo caso ripristino i circuiti vascolari con

 aumento del trofismo. Esempio: le ulcere croniche negli arti inferiori degli

anziani causano stasi venosa, ematoma permanente, l’epitelio cessa di crescere

e si formano buchi, che possono, nel caso dei diabetici, arrivare anche fino

all’osso e produrre riassorbimento dell’osso. In questo caso bisogna ripristinare

sia vascolarizzazione che innervazione, oltre a correggere il dismetabolismo

glucidico.

La generazione di meccanismi paracrini di stimolazione cellulare può essere

necessaria per la riorganizzazione delle connessioni dei diversi tipi cellulari presenti

nel tessuto mediante stimolazione delle cellule adiacenti.

Altro problema talvolta è la veicolazione della terapia in zone difficilmente accessibili:

ci sono voluti anni per capire come trattare la retina, dove inserire le cellule. Lo stesso

problema si presenta anche col sistema nervoso centrale.

Aspetti pratici per la realizzazione di un tessuto in vitro o di

una coltura cellulare.

poi nella pratica vengano osservati così come sono presentati nella lezione.

Prima fase

Realizzazione della coltura: non è un processo banale come sembra perché

 se vogliamo costruire un tessuto dobbiamo innanzitutto car