Medicina Rigenerativa

Biologia delle staminali epiteliali (somatiche)

La pelle è costituita dal tessuto adiposo Ipoderma, il derma e l’epidermide. All’interno del derma sono presenti: nervi sensoriali, vasi sanguigni, muscoli, cellule dendritiche e altre del sistema immunitario. Le strutture epiteliali presenti nella pelle includono l'epidermide, il follicolo pilifero e la ghiandola sebacea.

Epidermide

L'epidermide è formata da strati sopra-basali fino allo strato corneo, costituito da cellule morte e vuote unite da una struttura chiamata envelope che le mantiene unite. Il differenziamento terminale vede la morte delle cellule che vanno a costituire lo strato corneo, ma prima passano da diverse fasi: strato spinoso (non più proliferativo) e lo strato granulare (cellule dendritiche). Guardando lo strato basale si nota che è formato da un unico strato di cellule e che c’è una continuità: le staminali dell’epidermide vanno anche a costituire il bulge pilifero e la ghiandola sebacea.

Questo tessuto presenta una cellula staminale che forma cellule diverse. L’epidermide è formata dal cheratinocita (da basale a corneo) e tra i cheratinociti sono presenti i melanociti. Lo strato basale è l’unica parte dell’epidermide che contiene cellule con capacità clonogenica e proliferativa. Per mantenere il potenziale proliferativo, hanno bisogno di attaccarsi alla lamina basale, tramite laminina 5 e emidesmosomi: durante il differenziamento originano cellule sopra-basali che, staccandosi dalla lamina, perdono la capacità proliferativa.

Nello strato basale ci sono quindi le staminali ed i progenitori ad amplificazione transiente. Le proteine tipiche del basale sono: p63, EGFR, Notch/Delta, K5 e K14 (cheratine che costituiscono i filamenti intermedi). Nello strato spinoso, si perde l'espressione di K5 e K14 e vengono indotti K1 e K10, viene attivato Notch/delta con produzione di involcurina, filagrina e loregrina che, tramite transglutaminasi, formano lo strato corneo aggregandosi.

• Pelo: stimolo specifico di Wnt.
• Ghiandola sebacea: stimolo di Blimp1.

Le cellule staminali dell’epitelio sono localizzate nell'epidermide inter-follicolare, nel bulge del follicolo e nella ghiandola sebacea. La staminale del bulge origina progenitori Outer Root Sheath Cells (ORS) che, attraverso interazione con matrice della papilla dermica, danno origine a Hair Shaft Cells che formano il pelo, e alla Inner Root Sheath Cells (IRS).

La staminale epiteliale può essere definita oligopotente: cheratinociti ma con organizzazione e funzioni differenti. Nell'epidermide, il mantenimento è mediato da integrina alfa6beta4 e p63; nel follicolo, Wnt favorisce proliferazione e differenziamento verso ORS e HS; nella ghiandola sebacea, la proliferazione è influenzata da Hedgehog e c-Myc, mentre è bloccata da Blimp1 che favorisce il differenziamento.

Cellule staminali interfollicolari

L’epidermide è formata essenzialmente da un unico tipo cellulare. L’epidermide inoltre non è vascolarizzata: i vasi sono localizzati nel derma. L’integrina più importante per l’adesione è la alfa6beta4 a livello degli emidesmosomi mentre alfa3beta1 sono presenti sulla parete laterale della cellula.

È presente un sistema con cui viene regolata la proliferazione delle cellule staminali epidermiche ed è costituito da IGF, FGF7/10, EGF, TGFalfa che vengono tutti rilasciati intorno alle staminali. Il differenziamento dipende dall’interazione di Notch con Delta/jagged che determina il distacco della porzione intracellulare di Notch che va nel nucleo ed attiva il differenziamento attraverso Hes1. A seconda dei livelli di Notch, ha anche un ruolo pro-differenziativo nel bulge del follicolo, mentre nell’epidermide inter-follicolare è importante il passaggio delle cellule basali a sopra-basali.

DeltaNp63alfa (isoforma di p63) è fondamentale per il mantenimento del potenziale proliferativo della cellula staminale degli epiteli squamosi. P63 è un gene complesso con due promotori che generano due categorie di trascritti diversi: un promotore genera le trans activating TA che, per splicing alternativo, generano alfa, beta, gamma; deltaNp63 che dà origine a deltaNp63 alfa, beta e gamma.

È stato scoperto che deltaNp63alfa nell’epitelio corneale è fondamentale per mantenere il potenziale proliferativo della staminale, mentre beta e gamma entrano in gioco durante il differenziamento. P63 nella forma TA è importante per lo sviluppo degli epiteli stratificati dell’epitelio primitivo, poi si mantiene con l’altra forma deltaNp63alfa.

Modelli di mantenimento dell'epidermide

Per il mantenimento dell’epidermide si ipotizzarono due modelli: il modello gerarchico, in cui è presente una staminale long-lived transient differenziate, e il modello stocastico, in cui tutte le cellule dello strato basale sono equally-potent. Negli anni '70 dimostrarono che esisteva un modello gerarchico in cui le cellule staminali quiescenti originano i progenitori che originano le cellule differenziate.

Una coltura primaria di epidermide vede la formazione di varie colonie di cellule, ciascuna delle quali è la progenie di una singola cellula clonogenica. In condizioni controllate è possibile isolare una singola cellula dalla coltura in modo da isolare il singolo gene. In coltura su piastra, la percentuale di cellule abortive differenziava questi tre cloni:

• Holoclone: tutte colonie figlie uguali e ci sono 0-5% di cellule abortive staminale.
• Meroclone: 5-94% di cellule abortive.
• Paraclone: 95-100% di cellule abortive.

Howard Green iniziò a coltivare cellule di teratoma coltivando cellule epiteliali di carcinoma squamo-cellulare e scoprì che se si facevano crescere su feeder layer (fibroblasti) le colonie crescevano perfettamente. Questa pratica fu utilizzata per trattare le ustioni.

Malattia dei bambini farfalla o epidermolisi bollosa EB

Il cheratinocita basale ha i filamenti intermedi di cheratina K5 e K14 che, a livello della lamina lucida della membrana basale, interagiscono con proteine che a loro volta sono legate alle fibrille di ancoraggio del derma. Una rete di proteine tiene legato l’epidermide al derma, grazie a filamenti intermedi intracellulari (tonofilamenti di K5 e K14) e alla matrice di collagene Col7. I filamenti del derma sono ancorati alla matrice del derma da un sistema di diverse proteine ancoranti come la plectina e BP antigen che sono in contatto con integrina alfa6beta4.

Alfa6beta4 si connette con la laminina 5 che ha tre catene (alfa3, beta3 e gamma2) unite al collagene Col17. Una delle catene della laminina 5 è in contatto con il collagene 7 per la formazione delle fibre di ancoraggio. Nell’EB i geni 17-18 che formano queste proteine sono mutati:

• Simplex EBS: legate a mutazioni in K5 e K14, distacco intraepidermico a livello dello strato basale.
• Giunzionale JEB: clivaggio lamina, mutazioni della lamina 5 a livello catena beta3, ma anche nel recettore della lam5 che è alfa6beta4 e nel collagene 17. Herlitz presenta allele con mutazione stop codon e l’altro allele con mutazione grave.
• Distrofica: più grave, clivaggio dermico e le mutazioni sono di Col 7.

Terapia genica

Claudio, affetto da EB, presenta mutazioni in eterozigosi della catena beta3 di laminina5. Non si riuscivano a coltivare le cellule per alterazioni della pathway di YAP/TAZ. Dopo biopsia dal paziente dalla mano K9, isolati ed individuati gli olocloni, viene eseguito un trapianto di cellule trasdotte con vettore retrovirale integrante in cassetta per l’espressione del trangene corretto (LAMB3 cDNA) per generare la pelle geneticamente modificata.

Vennero eseguiti Southern Blot (per misurare l’integrità del gene) e Northern Blot (per misurare l’integrità del mRNA), poi immunoprecipitazione con: healthy donor, Claudio pre e Claudio post operazione. Dopo la correzione genetica delle cellule, i livelli di espressione dell’eterodimero sono tornati ad essere normali. Per eliminare la pelle residua si è utilizzato il timed ed esposto il derma. La pelle normale esprime beta3 di laminina5 e fa emidesmosomi in modo normale e in numero corretto. Rimane la K9 del palmo della mano.

Hassan, JEB mutazione beta3 laminina5 mutazione in omozigosi: ci fu la ricostruzione del tessuto solido salvavita con cellule geneticamente modificate. Fu presa una biopsia di 4 cm² e generato 1 m² di pelle in fiasche. Si pulirono i residui, si espose il derma del paziente e si attaccarono i lembi transgenici. Analisi in situ positiva in tutte le biopsie prese (quindi il transgene è presente), la microscopia TEM struttura e numero di desmosomi normale ed ha peli non transgenici che derivano dal suo derma.

Il 10% delle integrazioni sono in regioni promotoriali e il 25% in regioni enhancers e non è avvenuta selezione clonale nel tempo (non ci sono cloni emergenti). Avere le stesse integrazioni nel corso del tempo è importante per la sicurezza e la gene onthology ci fa vedere come non ci sia un particolare pathway arricchito di segnale che domina sugli altri nelle colture.

Per analizzare questo si fa un’analisi clonale, vengono prese le colture pre-graft e a 4 e 8 mesi ed isolati in olocloni, mero e para e le si analizza con integration analysis: il numero di olo, para e mero nelle pre-graft è uguale 5% quindi si è mantenuto il pool delle staminali, a dimostrazione del fatto che c’è sotto autorinnovamento. Infatti i progenitori hanno massimo 3-4 mesi quindi a 8 mesi tutti i progenitori sono di derivazione dell’oloclone. L’epidermide umana è sostenuta da long-lived self renewal stem cell (rappresentate dagli olocloni) che generano pools di progenitori transienti (merocloni e paracloni).

Ruolo di YAP/TAZ nel mantenimento della staminalità negli organi

Salvador (Sav), Mats e Wts sono chinasi. Hippo fosforila Mats e Wts, che insieme fosforilano YKI (che è l’omologo di YAP in Drosophila) e la sua fosforilazione fa sì che venga mantenuto nel citoplasma legato alla proteina 14-3-3 sigma. Quando la cascata di fosforilazione non si attiva, YKI entra nel nucleo dove lega il DNA non direttamente, ma mediante il co-fattore Sd. Quando Hippo è attivo, YKI viene fosforilato e trattenuto nel citoplasma. Nei mammiferi:

• Hippo: Mst1
• Salvador: WW45
• Mats: Mob
• Wts: Lats1/2
• Sd: TEAD

L’effetto finale dell’attivazione della via è la fosforilazione di TAP o TAZ. Il pathway di Hippo non ha recettore-ligando, ma i segnali che attivano la pathway sono metabolici e segnali di forma della cellula (organizzazione e citoscheletro). In YKI ci sono 3 siti di fosforilazione, in TAZ ci sono 4 siti e YAP 5 siti. YAP/TAZ presentano il TEAD binding domain mediante il quale legano il DNA nel nucleo, un sito di legame per la proteina 14-3-3, due domini WW riconosciuti da co-fattori trascrizionali e un dominio PDZ che consente il legame con proteine del citoscheletro e membrana.

Tra le proteine che vanno ad agire su YAP/TAZ c’è l’ubiquitina ligasi beta-TRCP che è responsabile della degradazione, GSK3, proteine G, ROCK e le CAP (che regolano il citoscheletro di actina). I segnali possono essere dipendenti da Lats (canonical Hippo pathway) o indipendenti da Lats tra cui la polarità apico-basale, la meccanotrasduzione e il metabolismo.

YAP/TAZ controllano la staminalità e il differenziamento della pelle, dell’intestino, del fegato, del SNC e cuore. I principali complessi proteici coinvolti nella regolazione apico-basale della pathway di Hippo:

• Merlin (omologo nei mammiferi NF2) localizzato nelle tight junction e induce l’attivazione di Lats ed è un attivatore della via e reprime la trascrizione associata a YKI.
• Scrb: proteina adattatrice tra Mst, Lats e TAZ, ed una sua perdita corrisponde ad una perdita di inibizione di YAP/TAZ e cancro.
• Alfa catenina: linker tra caderine e citoscheletro, 14-3-3 e alfaPKC.

La meccanotrasduzione è un processo che coinvolge tutti i segnali che arrivano dall’esterno e che hanno un effetto sul citoscheletro della cellula. I segnali possono essere mediati dai morfogeni, dalle integrine, dalla matrice, dalle caderine o dallo stress. In cellule piastrate ad alta confluenza si ha inibizione da contatto, la proliferazione è bloccata e YAP/TAZ è nel citoplasma, a bassa confluenza invece non si ha inibizione da contatto e YAP/TAZ è nel nucleo. Inoltre, se le cellule vengono piastrate su aree piccole o substrati morbidi che non permettono all’actina di distendersi, YAP/TAZ rimane nel citoplasma; se vengono piastrate su ampie aree o substrati rigidi, YAP/TAZ si trova nel nucleo.

Se vengono piastrate su isole di fibronectina, le fibre di actina vanno incontro a polimerizzazione. Se l’actina è assente, si ha depolimerizzazione e ci sono alcune droghe che regolano questo meccanismo tra cui: ROCK favorisce la polimerizzazione, mentre truncolina A e citocalasina B inibiscono la polim.

Ci si è chiesto se questo evento di meccanotrasduzione fosse o meno dipendente dalla canonical Hippo pathway e quindi da Lats. Le cellule trattate con siRNA contro Lats, se fosse dipendente, si sarebbe dovuto vedere una riduzione di YAP nel nucleo. YAP è indipendente da Lats e non è dipendente dalla canonical. Tramite un siRNA contro CAP videro che la polimerizzazione del citoscheletro di actina è direttamente legata alla quantità di YAP/TAZ nucleari, in maniera dipendente da CAP e indipendente da Lats. Se si fa un siRNA contro YAP/TAZ, la proliferazione crolla. La forma del tessuto e la matrice extracellulare inducono degli stimoli proliferativi sull’epitelio, mentre le forze meccaniche inducono l’attivazione di YAP/TAZ.

Regolazione di YAP/TAZ

Anche la glicolisi, la presenza di acidi grassi, la pathway del mevalonato e i GPCRs ligands regolano YAP/TAZ.

• Glicolisi: trattando le cellule con il 2-deossiglucosio 2DG, analogo del glucosio che non riesce ad essere metabolizzato dagli enzimi della cascata glicolitica saturandoli (blocco glicolisi), la pathway della glicolisi viene bloccata e anche l’attività di YAP/TAZ, tramite saggio di luciferasi. Per dimostrare la connessione tra glicolisi e regolazione di YAP/TAZ è stato utilizzato un mutante caratterizzato da un’iperattivazione di YAP e si è visto che questo legava anche la PFK1, l’enzima chiave della glicolisi. La glicolisi è fondamentale per l’attività di YAP poiché il glucosio attiva la PFK1 che lega TEAD che a sua volta lega YAP/TAZ.
• GPCRs: in presenza di siero, YAP è attivo, mentre in assenza di siero, YAP è inattivo.