Medicina Rigenerativa

Regolazione di YAP/TAZ

Anche la glicolisi, la presenza di acidi grassi, la pathway del mevalonato e i GPCRs ligands regolano YAP/TAZ.

Glicolisi

Trattando le cellule con il 2-deossiglucosio (2DG), analogo del glucosio che non riesce ad essere metabolizzato dagli enzimi della cascata glicolitica saturandoli (blocco glicolisi), la pathway della glicolisi viene bloccata e anche l'attività di YAP/TAZ tramite saggio di luciferasi.

Per dimostrare la connessione tra glicolisi e regolazione di YAP/TAZ è stato utilizzato un mutante caratterizzato da un'iperattivazione di YAP e si è visto che questo legava anche la PFK1, l'enzima chiave della glicolisi. La glicolisi è fondamentale per l'attività di YAP poiché il glucosio attiva la PFK1 che lega TEAD che a sua volta lega YAP/TAZ.

GPCRs

In presenza di siero, YAP è attivo, mentre in assenza di siero YAP è inattivo e sequestrato nel citoplasma. Il siero è composto da BSA.

si è scoperto che i componenti idrofobici e gli acidi grassi legati ad essa sono responsabili della fosforilazione di YAP. LPA (ac. Lisofosfatidico), PA (ac. Fosfatidico), PI (fosfoinoditivi) sono i principali componenti coinvolti. La combinazione di PI e PA produce LPA, che è il principale responsabile della fosforilazione di YAP. YAP è uno dei ligandi di recettori accoppiati a proteina G. Nelle cellule staminali, YAP/TAZ induce l'espressione del compartimento cellulare e promuove il differenziamento cellulare, ma ciò varia a seconda del contesto. Il ruolo di YAP/TAZ nello sviluppo embrionale è molto importante. La perdita di YAP durante lo sviluppo embrionale ha effetti drastici. A 6.5 giorni, YAP è maggiormente espresso nelle zone di giunzione tra i tessuti embrionali ed extra-embrionali. Sono stati riscontrati difetti nel folding dell'epitelio anteriore, nell'elongazione e chiusura del tubo neurale e nei tessuti embrionali. A partire dallo stadio di blastocisti, inizia il processo di differenziamento cellulare.

Differenziamento del trofoblasto e YAP resta attivato soltanto nelle sue cellule, mentre si inattiva la inner cell mass. Nello sviluppo YAP è espresso sempre nelle cellule CDX2 (trofoblasto). Per dimostrare che CDX2 è sotto il controllo trascrizionale di YAP, hanno utilizzato un mutante della proteina TEAD con legato TAG VP16 nel trofoblasto, dove la cell polarity inattiva Hippo e c'è segnale di YAP che lega TEAD e controlla la trascrizione di CDX2 per la specificazione del trofoblasto. Quando si forza YAP nucleare nella inner cell mass anziché nel trofoblasto, l'embrioblasto muore. YAP NELLE ESC: Il marker di staminalità utilizzato per monitorare cosa succede alle ES è la fosfatasi alcalina che viene persa durante il differenziamento, così come si perdono YAP, OCT e SOX2. Se faccio siRNA contro YAP, la fosfatasi crolla, quindi YAP è necessario per mantenere la staminalità. Loss of function di YAP causa differenziamento, mentre gain of function di YAP causa mantenimento della staminalità.

staminalità

Il KO di YAP/TAZ impedisce il mantenimento dello stato pluripotente delle ES, mentre induce il differenziamento. Nelle iPS YAP induce il reprogramming: l'inattivazione di LATS fa indurre la localizzazione nucleare di YAP interagendo con TGFbeta e SMAD. Inizialmente YAP è richiesto per lo sviluppo dell'epitelio nell'embrione, poi si crea una omeostasi in cui YAP resta espresso da poche cellule. Nel follicolo pilifero è per la maggior parte spento.

YAP NEI MODELLI MURINI

Sistema murino transgenico con iperespressione di YAP S127A (ser 127 mut in alanina), forma che non risente della fosforilazione di LATS. Questo transgene è stato inserito sotto promotore inducibile con doxiciclina: il promotore del transgene contiene le seq TRE, attivate da tTA che è a sua volta inserito sotto il controllo di un promotore tessuto-specifico cheratina 14. Inducendo l'over-espressione si ottiene un epitelio più spesso rispetto ai wt ma varia.

anche: K5 che sale nel layer superiore, Ki-67+ aumentano, aumenta p63 e diminuisce Hes1. L'overespressione di YAP induce quindi un'espressione dello strato basale, aumenta la proliferazione e si riduce il differenziamento terminale dell'epidermide del topo. Infatti, durante lo sviluppo si occupa di fare questo. YAP NELL'EPIDERMIDE Alfa-catenina è responsabile dell'attività di YAP nell'epitelio. KO YAP ha pelle translucida e non occlusione ferite, KO p63 non ha epidermide. La fosforilazione dipende quindi da una pathway non Hippo-dipendente ma alfa-catenina-dipendente. Alfa-cat lega YAP non fosforilato e quindi quando YAP è nucleare, alfa-cat è poco presente. Se alfa-cat è in membrana, sequestra YAP nel citoplasma. KO per alfa-cat YAP è più attivo e si trova nel nucleo. Nelle WT dello strato basale e nelle staminali, alfa-cat non è espressa e YAP è attivo. Si è trovato una funzione.anch di CRB1 (Crumbs homolog 1 che solitamente ha ruolo nella retina) anchenegli epiteli:

• Monostratificati Crb fa si che le cell spengano YAP
• Pesudo-stratificati Le cell della parte superiore hanno escluso YAP (citoplasmatico) mentrequelle ancorate alla lamina hanno YAP nel nucleo
• Pluristratificati Crb non c'è e YAP è attivo solo nella parte basale.

RUOLO DI YAP IN ALTRI TESSUTI intestinoE' espresso nello strato basale dell' dove ci sono le staminali delle cripte intestinali.Anche in questo caso over esprimendo YAP si ha mancato differenziamento e aumento delle cell staminaliche proliferano.In seguito a danno DSS (rimozione dei villi9 si vede che aumentano le cell Ki67+ e l'espressione di YAP,quindi YAP è coinvolto durante la normale rigenerazione dell'epitelio in seguito a danno e non nellanormale omeostasi tissutale dove Hippo è spento.La pathway regolatoria dell'intestino è WNT e si sa che YAPÈ presente nel complesso con beta-cat e GSK3:WNT spento beta-cat e YAP fosforilati e degradati, WNT attivo anche YAP può attivare il profilotrascrizionale. Fegato -> over expr di YAP aumento delle dimensioni del fegato ed epatocarcinoma, da questo si è capito che la pathway di Hippo è attiva nel fegato. È maggiormente espresso nell'epitelio dei dotti biliari ma non negli epatociti se si toglie l'espressione di YAP le cell che hanno aumentato il compartimento staminale riescono di nuovo a differenziarsi, formando nuovi epatociti. Il Gain di YAP = + staminali e + differenziate. Cuore -> Over-espressione = ispessimento parete cardiaca, KO = miocardio sottile. Quando si ha un gain di YAP in una zona infartata il cuore recupera velocemente quindi YAP attiva la rigenerazione cardiaca. SN -> Over-espressione di YAP induce espansione dei progenitori neurali, a scapito della componente differenziata. NF2 è uno degli iniziali componenti della.pathway di Hippo ed è il gene dellaneurofibromatosi, la cui mutazione dà origine a tumori dovuti all'over-espressione di YAP. KO di NF2 YAP più attivo e si hanno progenitori neuronali proliferanti/ KO YAP = + diffL'EMOPOIESI Le cell staminali emopoietiche sono quelle che danno origine alle cell del sangue. La sede dell'emopoiesi è il midollo osseo, localizzato nell' osso spugnoso delle ossa pelviche, nello sternoma anche nell'epifisi delle ossa lunghe. La produzione del sangue avviene in cavità dell'osso dove ci sono lenicchie staminali emopoietiche. Nel midollo l'80% delle cell sono eritrociti e granulociti e sono immaturi, lasciano il midollo quando sono maturi, ovvero diff terminale, vanno nel sangue periferico. Le staminali in circolo sono circa 1-4% L'emopoiesi presenta diversi comparti: - Self renewal cell quiescenti e proliferanti CD34+ - Commitment Progenitori che esprimono ancora CD34 e hanno

minimo self renewal - Precursori transient amplifying cells non più self renewal - Differenziamento terminalmente diff Guarda schema

Espressione dell'antigene di membrana CD34. Tutti i leucociti sono CD45+ quindi le staminali sono CD34+/CD45+. Possiamo suddividere 3 popolazioni: CD34+/CD38+ precursori Cd34+/38- STAMINALI CD34-/38- differenziate. Self renewal è sostenuto da HOB4, GATA2, IKAROS, LMO2, Wnt e Notch (autorinnovamento). Il commitment viene influenzato dal microambiente midollare e decide di seguire uno dei lineage specifici edurante il differenziamento TF reprimono i programmi genetici delle altre linee emopoietiche.

FATTORI CHE INFLUENZANO L'EMOPOIESI:

• IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, SCF, TPO, Ft3-ligand Agiscono sui progenitori immaturi
• Epo, TPO, GM-CSF, G-CSF, M-CSF agiscono sul differenziamento

La trombopoietina su staminali ha il compito di aumentare il self renewal attraverso l'induzione di unomeogene chiamato HOXB4. Sono

Essenziali i fattori indotti dal TGF-alfa, TGF-beta, INF-gamma, LIF: sono meccanismi di inibizione della proliferazione nei precursori e che quindi hanno un'azione inibitoria verso l'emopoiesi.

Il differenziamento mieloide è influenzato dall'attivazione di altre vie ad opera di due ormoni nucleari: l'acido retinoico e la vitamina D3. L'acido retinoico agisce sui precursori mieloidi attivando il differenziamento granulocitario. La vitamina D3 agisce sui precursori differenziandoli in monociti. La vitamina D3 è idrosolubile e entra per diffusione passiva attraverso la membrana e si lega al recettore citoplasmatico VDR. Il complesso va nel nucleo e si lega alle sequenze VDRE situate nei promotori dei geni di risposta alla vitamina D ed attiva la trascrizione dei geni che attivano il differenziamento in monociti.

CMP alto PU.1 + GATA-1 → CLP basso PU.1 + Ikaros → CLP a Linfocito B mantenimento PU.1 + Pax5 → CLP a Linfocito T downreg PU.1 + GATA3 → CMP a monocito/granulocito PU.1 e -GATA → CMP a eritroide/megacariocita GATA

• PU.1 → Eritroide EMP
• GATA1 + FOG → EMP (Da CMP)
• GATA1 + LMO2 + KLF1 → EMP a megacariocitario
• GATA1 + FOG + NF-E2 → GMP (da CMP)
• PU.1 + C/EBPs → GMP a granulociti
• PU.1 + vitD + Egr-1 + MafB → GMP a monociti

La nicchia staminale è quella struttura nella quale le cellule del tessuto prendono contatto con le cellule staminali del tessuto stesso e ne regolano la funzione. La nicchia protegge le cellule staminali dall'esaurimento, la nicchia osteoblastica promuove la quiescenza consentendo il mantenimento del pool. Si chiama osteoblastica perché è localizzata nel periostio (superficie dell'osso trabecolare), si ha una singola linea di osteoblasti midollari che si chiamano SNO cells e sono a contatto diretto con gli osteoblasti tramite N-caderina e ne regolano la funzione. La nicchia perivascolare invece è dove le cellule staminali prendono contatto con i sinusoidi e supporta la proliferazione.