Appunti completi del corso di tecnologie per la medicina rigenerativa

Tecnologie per la medicina rigenerativa

L'ingegneria dei tessuti è una sottocategoria della medicina rigenerativa; questa è stata spinta in particolare dalla crisi dei trapianti. A lato si mostrano tre curve: la prima, quella azzurra, indica il numero di organi recuperati da pazienti deceduti e rimane circa costante negli anni. Questo è dovuto al fatto che la raccolta dipende soprattutto dalla morte dei pazienti dovuta a incidenti stradali: la linea verde indica invece gli organi trapiantati ed è in leggero aumento per il miglioramento delle tecniche chirurgiche. Molto distante è la curva gialla che indica il numero di pazienti sulla lista d'attesa dei trapianti: è in continuo aumento, sicuramente per l'aumento dell'aspettativa di vita. In ogni caso c'è una forbice sempre più ampia tra la disponibilità di organi per i trapianti e i pazienti in lista. L'attesa diventa sempre più lunga e i pazienti possono nel mentre anche soffrire di diverse patologie, ponendoli in rischio di vita.

Esempio: andare sull' Organ Procurement and Transplantation Network (OPTN) database. È un database pubblico con l'elenco numerico dei pazienti in attesa di trapianto, divisi per organi. Si può richiedere un report con i valori aggiornati.

Medicina rigenerativa

Questo problema ha spinto la medicina verso una nuova frontiera, quella rigenerativa appunto. Con medicina rigenerativa si intende un insieme di tecniche mediche innovative che permettono al corpo di sostituire, rigenerare, rimpiazzare e riparare cellule, tessuti e organi danneggiati o mancanti. La definizione è molto ampia e vaga e per questo facciamo alcuni esempi; terapie per la cura del tessuto cardiaco dopo infarto del miocardio, rigenerazione della cute (soprattutto per vittime d'ustione - è l'approccio che ha avuto maggior successo), terapie rigenerative per lesioni al midollo spinale che provocano paraplegia e terapie di insulina per i malati di diabete.

È un approccio diverso rispetto a quelli studiati in ingegneria biomedica: infatti, non prevede una sostituzione definitiva del tessuto o dell'organo ma funge da supporto temporaneo per far sì che sia lo stesso corpo a innescare i meccanismi rigenerativi. Quindi, l'ingegneria dei tessuti e la medicina rigenerativa si basano sul concetto di sostenere e attivare l'intrinseca capacità riparativa del corpo che è presente in tutti i tessuti e organi; dopo di che, tutto quanto usato può sparire.

Già in passato sono state introdotte, spesso in maniera inconsapevole, delle terapie di passaggio dall'approccio tradizionale alla medicina rigenerativa: il più conosciuto è la trasfusione di sangue. Essa veniva usata per far sopravvivere il paziente nell'attesa di guarire dalla patologia o rigenerare tessuti danneggiati: si sostituisce una funzione con un'analoga biologica. Un altro esempio di ponte verso la medicina rigenerativa è il trapianto di midollo osseo; la leucemia viene curata proprio usando radiazioni che uccidono le cellule staminali del paziente al quale vengono poi somministrate nuove cellule staminali da un donatore in modo che vadano a popolare il midollo osseo, integrandosi e fabbricando gli elementi del sangue necessari.

O ancora, per quanto riguarda la frattura del legamento crociato, si esegue un auto trapianto con un intervento di ricostruzione tramite un altro legamento su cui si ripopolano le cellule. Progressivamente esse degenerano il legamento trapiantato per crearne uno nuovo, identico all'originale. Questo approccio si considera come medicina rigenerativa dato che il trapianto di tendine è un supporto temporaneo nell'attesa della rigenerazione di quello nuovo.

Un altro particolare esempio riguarda la terapia di osteodistrazione, un processo che avviene naturalmente nel corpo, inventato dal medico russo Ilizarov: prevede l'uso di un fissatore circolare che avvolge completamente l'arto. Il tessuto dell'osso infatti è altamente rigenerativo se la frattura non è scomposta e ha monconi vicini.

Componenti fondamentali della medicina rigenerativa

• Cellule
• Biomateriali, o scaffold. Si intendono supporti per favorire l'adesione cellulare e la crescita: sono il microambiente fisico.
• Segnali: non sono molecole (o meglio possono anche esserlo ma non sono solo questo) e sono di diverso tipo:
  • Chimici: molecole segnale emesse dalla cellula oggetto di studio o da cellule diverse. Si attaccano a recettori che li riconoscono e fanno partire una cascata di eventi.
  • Fisici: arrivano dall'ambiente e sono forze. Comprendono anche quelli elettrici e magnetici. Sono di solito più veloci e gli effetti si vedono immediatamente.

I segnali sono fattori di stimolazione che inducono risposte cellulari come proliferazione e differenziazione. Anche lo scaffold può essere fonte di segnali chimici e fisici. Questi elementi si possono combinare in qualsiasi modo per ottenere una terapia rigenerativa nel senso che possono anche essere usati da soli. Per esempio, nel caso dei segnali si possono usare fattori di crescita che, agganciati dalle cellule, inducono proliferazione nell'ottica di una terapia rigenerativa. Le prime terapie nel cuore si facevano infatti con delle iniezioni di sostanze direttamente nel tessuto durante l'intervento per attivarne la ricrescita. Se si usano tutti gli elementi insieme si parla di ingegneria dei tessuti perché la componente ingegneristica è prevalente: si devono inventare materiali e segnali utili. Rispetto alle protesi, la medicina rigenerativa non usa devices ma possono essere prodotti farmaceutici o processi del campo dell'ingegneria chimica e della farmacologia.

Lo schema generale è quello a lato: di solito prevede donatore, preparazione e lavorazione del materiale fino al ricevente. A volte donatore e ricevente coincidono. Ogni passaggio può essere di natura molto diversa dagli altri e prevede molti sottopunti.

1. Il donatore dona del materiale biologico -> il donatore può essere il paziente (autologo) con minori problemi di rigetto o diverso (vivo, embrione nella clonazione, defunto, feto o animale).
2. Il materiale viene processato in una popolazione di cellule: si parla di manipolazione. Può essere cellule somatiche, germinali o embrionali oppure può derivare da biopsia di tessuto, da un organo o una sua parte o essere cordone ombelicale o placenta.
3. Cellule: possono essere isolate (come i condrociti dalla cartilagine o globuli rossi dal sangue) o espanse (da poche migliaia di cellule se ne ottengono milioni per il dosaggio terapeutico). L'espansione è necessaria per ottenere effetti con la terapia ed è una fase quasi sempre presente. Si possono eseguire anche trasfezione del DNA per cambiarne la sequenza genetica, induzione di pluripotenza (si fa di solito su cellule somatiche per cui, tramite specifici fattori, si induce un comportamento embrionale) o partenogenesi (solo con cellula uovo) e clonazione per creare un embrione artificiale con lo stesso codice genetico dell'embrione donatore.
4. Scaffold (se c'è): si usano biomateriali sintetici, completamente o in parte, o biologici (tessuti decellularizzati).
5. Costrutto (cellularizzato): è l'insieme di scaffold e cellule. Può essere sospensione liquida, di aggregati, uno scaffold con cellule adese o un organo intero prima decellularizzato e poi nuovamente cellularizzato.
6. Stimolazione (meccanica-con bioreattore-, chimica-con fattori di crescita-, elettrica con stimoli singoli o tutti insieme). I diversi stimoli si possono associare.
7. Delivery: è la fase più complessa e coinvolge il medico, dato che può essere fatto anche con approccio chirurgico. Può essere mininvasiva (obbiettivo di oggi dato che è meno dolorosa e costosa e meglio accettata dal paziente) però può dover essere somministrata più volte per avere il risultato finale. Può anche essere chirurgica.
8. Ricevente

Etica e regolamento

Idealmente, l'industria può produrre e commercializzare qualsiasi preparazione cellulare/tessutale consegnato al paziente in una terapia rigenerativa sotto forma di "prodotto" terapeutico. La maggior parte dei paesi ha un'autorità incaricata di fornire la regolamentazione sanitaria. Negli Stati Uniti, questa autorità è la "Food and Drug Administration" (FDA). In Europa, è l'"Agenzia Europea dei Medicinali". In Italia, l'Agenzia Italiana del Farmaco (AIFA). Le autorità di regolamentazione della salute sono anche incaricate di fornire le approvazioni normative per i prodotti industriali legati alla salute.

Classificazione dei prodotti per terapie cellulari o tissutali (PTC)

I prodotti terapeutici (PTC) sono definiti in Italia come:

• Definizione 1: preparati in cui l'azione biologica principale è condotta dalle cellule o dal tessuto, anche in presenza di matrici o rivestimenti di natura inorganica o organica.
• Definizione 2: per PTC si intende qualsiasi preparato somministrato a un essere umano con finalità analoghe a un farmaco, che contiene cellule vive o parti complesse di esse, sia che somministrato da solo, o insieme a matrici di sintesi o biologiche origine. -> si sottolinea il fatto che il PTC debba essere somministrato. Dal punto di vista normativa, il PTC è considerato come un farmaco: questo lo differenzia in maniera fondamentale dalle protesi. La criticità principale di questa definizione è il fatto che molti PTC sono usati fuori dal corpo, per esempio quelli di supporto alla funzionalità epatica o renale dei pazienti in attesa di trapianto. Quindi, non si può parlare di somministrazione in questo caso. Questi sistemi PTC extracorporei in Italia non hanno una norma di riferimento perché non fanno parte dei PTC secondo definizione, non sono farmaci ma nemmeno devices medici tradizionali: di conseguenza, tali dispositivi vengono creati all'estero per poi essere venduti nel nostro paese.

Un PTC si classifica come agente biologico che abbia subito una manipolazione non minima, ossia che alteri in maniera sostanziale la funzionalità biologica. I due esempi principali sono:

• Attivazione di proliferazione e differenziazione cellulare in coltura tramite molecole biologiche (fattori di crescita o di differenziazione)
• Trasfezione (modifica acidi nucleici, sia DNA che RNA, tramite terapia genetica per ottenere l'espressione temporanea o permanente di nuove proteine)

Esempio: classificare le terapie come PTC o non PTC, basandosi sulla definizione di manipolazione non minima:

1. Trasfusione di sangue e emoderivati -> non è PTC -> il sangue viene prelevato da donatori e mantenuto non coagulato tramite sostanza e conservato al freddo. Non c'è nessuna fase di proliferazione né di differenziazione e non ci sono nemmeno operazioni di trasfezione. È un prodotto terapeutico che non viene assoggettato a manipolazione non minima (è invece minima).
2. Trapianto di tessuti vascolarizzati e organi -> non è PTC-> non c'è manipolazione non minima.
3. Espansione di popolazioni cellulari, come quelle della cute, prelevate da biopsie per poi essere somministrate al paziente -> è PTC.
4. Terapia genica (si prelevano cellule e si editano per poi essere re-impiantate) -> è un PTC.

Rischi associati all'uso di PTC

I PTC, una volta inseriti nel paziente, hanno la stessa pericolosità di un farmaco tradizionale dato che reagiscono in maniera importante con il corpo dal punto di vista biologico. È l'interazione che determina i rischi; per questo i PTC e i farmaci sono considerati analoghi dal punto di vista normativo. Ci sono 5 categorie principali di rischi associati all'uso di PTC, in particolare per quelli contenenti cellule viventi:

1. Reazione immunologica: il sistema immunitario si attiva sempre in presenza di agenti quindi anche per tutti i PTC. È legato soprattutto dalle cellule ma anche da parti di esse e da matrici (sostanze sintetiche o biologiche che non derivano da cellule). Il rischio è più limitato per le cellule mesenchimali, ossia cellule dei tessuti connettivi molto usate in medicina rigenerativa: se sono ottenute da un donatore selezionato opportunamente come gruppo istologico, il rischio di risposta avversa del sistema immunitario è basso.
2. Formazione di tumori a seguito dell'impianto di PTC: è un settore molto studiato. Il rischio deriva soprattutto dall'impianto di cellule multipotenti e immortalizzate (che producono segnali che inducono tumori), da parti di esse, da fattori di crescita o proliferativi usati per l'espansione della coltura cellulare o dalle matrici. Anche in questo le cellule mesenchimali adulte presentano rischio basso.
3. Formazione di un teratoma, ossia un tumore formato da cellule pluripotenti (staminali embrionali, sia naturali che a pluripotenza indotta).
4. Trasmissione di infezioni: da materiale donatore o da qualunque tipo di manipolazione, quindi è sempre presente. Il donatore può avere agenti patogeni che vengono trasmessi al ricevente ma anche la manipolazione non minima può determinarne la presenza.
5. Somministrazione di contaminanti tossici: c'è sempre ed è un rischio molto elevato. I contaminanti possono derivare da qualsiasi stadio della manipolazione. Per esempio, nel caso delle cellule beta del pancreas, che sono coltivate con insulina (la quale emette segnali per l'ingresso del glucosio), ci sono stati pazienti con riduzione notevole della glicemia per effetto della stessa terapia cellulare somministrata con alto contenuto di insulina, ancora presente dalla coltivazione cellulare.

Quindi è stata sviluppata una normativa con una serie di regole per la produzione di PTC in modo che tutti i rischi siano noti e misurati prima di arrivare al paziente. Si devono minimizzare tali rischi. Le normative sono indirizzate alle industrie farmaceutiche: le aziende che vogliono produrre nuovi PTC devono rispettare due requisiti minimi:

1. Tutte le fasi di sviluppo, produzione, test e commercializzazione del nuovo PTC devono rispettare un processo regolatorio standardizzato. Il regolatore sanitario richiede dimostrazioni scientifiche in fasi specifiche del processo per fornire approvazioni per procedere nelle fasi successive.
2. Tutte le fasi di sviluppo, produzione, test e commercializzazione del nuovo PTC devono essere regolati da standard di qualità internazionali. Le fasi sono:
   • Di laboratorio (sviluppo e test in vitro) -> standard di Good Laboratory Practice (GLP)
   • Pre-cliniche (su animali) e cliniche (su pazienti) -> standard di Good Manufacturing Practice (GMP) e di Good Clinical Practice (GCP). Questi secondi valgono quando si lavora con organismi viventi.
   • Di commercializzazione -> standard di Current Good Manufacturing Practice (cGMP), simili alle precedenti ma che richiedono attualizzazione, ossia per cui l'azienda deve aggiornarle sulla base delle nuove tecnologie a disposizione.

Descrizione del processo regolatorio

Il processo di approvazione e vendita di un nuovo PTC è molto lungo (fino a 15-20 anni) e prevede anche costi molto elevati. I pallini viola nello schema rappresentano i momenti in cui l'ente regolatore autorizza l'avanzamento del processo sulla base dei risultati ottenuti. Alla fine della sperimentazione pre-clinica si valutano se ci sono le condizioni per testare il PTC sul paziente; se è positivo si prosegue. Alla fine della valutazione clinica, i dati vengono nuovamente analizzati e, se convincenti, si ottiene il permesso di commercializzazione. Il prodotto va quindi in commercio e una nuova fase normativa comincia. L'obiettivo è sempre quello di ridurre i rischi. Le fasi principali sono:

1. Test in vitro: il PTC viene sviluppato e testato su colture cellulari. Si individua una strategia terapeutica.
2. Fase pre-clinica: il farmaco o il PTC vengono testati su animali per verificarne la sicurezza e l'efficacia per cui si risponde ad una serie di domande:
   • È sicuro? -> effetti indesiderati
   • Funziona in maniera selettiva?
   • Funziona con il meccanismo previsto?
3. Fase clinica: prevede quattro fasi principali
   • Fase I: sperimentazione pilota. Si fa su pochi pazienti (5-10) e si deve dimostrare che su di essi, selezionati appositamente, la terapia ha rischi contenuti e controllati. Inoltre, questa fase è fondamentale per studiare il corretto dosaggio. Si valuta soprattutto la sicurezza
   • Fase II: questa, con la successiva, deve dimostrare l'efficacia della terapia se confrontata con quella tradizionale. Si considerano due gruppi di pazienti, trattati con terapie già approvate e in commercio e sperimentali con la nuova terapia. L'attribuzione dei pazienti a ciascuno dei due bracci avviene casualmente. Si parla di doppio-cieco se né il medico né il paziente sanno a che gruppo appartiene il soggetto.
   • Fase III: simile alla precedente, al termine si valutano i risultati per avere l'autorizzazione alla commercializzazione. Si considera una popolazione più ampia di pazienti per valutarne l'efficacia
   • Fase IV: è la fase di post-commercializzazione e prevede la sorveglianza. Si valutano tutti gli effetti del farmaco/PTC e gli eventuali eventi avversi non previsti dato che vengono somministrati ad un numero di pazienti molto superiore rispetto a quello considerato nei trial precedenti. Nel caso del farmaco è più semplice perché gli effetti vengono riportati nel foglietto illustrativo. Dopo 20 anni il brevetto scade per cui tutte le altre aziende farmaceutiche possono replicare e produrre il PTC/farmaco.

Il laboratorio di colture cellulari

A lato viene mostrata una cappa a flusso laminare. L'operatore vi infila le mani (con guanti) disinfettati ma non sterili per cui è previsto un meccanismo di aspirazione dell'aria dal campo di lavoro per evitare contaminazioni.