Appunti Tecnologie Medicina Rigenerativa

Introduzione

Fondamento logico

La crisi dei trapianti

Si tratta di una crisi dovuta al fatto che la richiesta da parte dei pazienti di organi e tessuti è superiore alla disponibilità degli stessi. La lista d’attesa dei pazienti tende ad aumentare a partire dal 2003, così come il divario tra domanda ed offerta. Vi sono dei database che mostrano la lista d’attesa dei pazienti in funzione degli organi da trapiantare: osservando la quantità dei pazienti che sono stati eliminati dalla lista d’attesa perché sono morti prima dell’operazione, si nota che il totale dei casi tende ad aumentare nel corso degli anni. Per alcuni organi il numero diminuisce, come per i polmoni o il fegato, ma per il rene la crescita di mortalità è elevata. Il problema della crisi dei trapianti sta nel fatto che i pazienti non riescono ad arrivare all’intervento chirurgico.

Verso la medicina rigenerativa

La medicina rigenerativa è un campo vasto di terapie mediche che sfrutta la capacità dell’organismo di rigenerare alcune parti di sé. Il concetto di fondo è quello di non sostituire il tessuto danneggiato in toto, ma di supportare la naturale capacità dell’organismo di rigenerare quel tessuto. La medicina rigenerativa nasce da alcune tecniche pionieristiche, laddove la più nota è quella della trasfusione di sangue: il paziente che osserva un’emorragia massiva ha la capacità di sopravvivere grazie alla trasfusione, in attesa che il suo organismo (cellule staminali del tessuto sanguigno) riproduca le cellule necessarie al trasporto di ossigeno e all’immunità (globuli rossi, globuli bianchi, piastrine).

Un secondo esempio è quello del trapianto di midollo osseo, svolto in caso di pazienti con leucemia, in modo tale da permettere la rigenerazione delle cellule del midollo osseo che si sono danneggiate a seguito dei trattamenti per la cura della leucemia stessa. Un terzo esempio è associato alla rigenerazione del legamento crociato: si prende una parte di tessuto da una zona limitrofa, lo si posiziona nel mezzo, aspettando che il legamento crociato si ricongiunga. Un ultimo esempio riguarda la terapia di Lizarov: si crea una frattura artificiale in un osso, si utilizza un distrattore per allontanare i segmenti ossei nel mentre che il tessuto osseo si riformi, si permette quindi la ricostruzione ossea per curare pazienti affetti da nanismo oppure a seguito di una frattura, con lo scopo di allungare il segmento osseo.

La medicina rigenerativa

Componenti della medicina rigenerativa

I componenti base della medicina rigenerativa sono:

• Cellule
• Biomateriali, più nel dettaglio si tratta di scaffold, ovvero delle strutture di sostegno che devono essere riempite internamente. Possono essere naturali, sintetiche o una via di mezzo. Sono utili per supportare l’adesione e la crescita cellulare.
• Segnali: permettono la proliferazione e la differenziazione cellulare (inerente al comportamento e risposta cellulare). Questi segnali possono essere fisici o chimici; questi ultimi sono delle molecole che contattano la cellula tramite recettori. Al contatto, la cellula risponde e vengono chiamati generalmente fattori di crescita. I segnali fisici, invece, sono tipicamente segnali meccanici o elettrici, e sono importanti tanto quanto i segnali chimici. Lo scaffold stesso può essere origine di segnali chimici o fisici. Quindi i segnali derivano o dallo scaffold oppure dall’ambiente circostante.

Si possono usare questi tre ingredienti fondamentali in qualsiasi combinazione in una qualsiasi terapia rigenerativa. Se le strategie della medicina rigenerativa presentano tutti e tre questi ingredienti, allora si parla di ingegneria tissutale.

Diagrammi di processo

Data la tale complessità nelle strategie, si utilizzano degli schemi per spiegare il tipo di terapie: si parla di diagrammi di processo, i quali sono totalmente oggetto del controllo qualità. Un tipico diagramma di una terapia rigenerativa è costituito in primo luogo da un donatore e da un ricevente. Queste due figure non sono quasi mai la stessa persona. Dal donatore vengono isolati dei materiali donati: possono essere cellule, scaffold e segnali. I componenti vengono assemblati costruendo un costrutto cellularizzato. Quest’ultimo viene stimolato, in modo da condizionare le cellule nell’espressione del corretto fenotipo (che ne definisce le sue caratteristiche e proprietà). A seguito della stimolazione si osserva il delivery: il costrutto stimolato viene impiantato nel paziente ricevente.

Per ognuno dei precedenti step ci sono tantissime possibilità:

• Donatore: può coincidere con il ricevente, può essere un embrione o un essere umano, vivi o deceduti, può essere un animale.
• Materiale donato: possono essere cellule somatiche o germinali, oppure embrionali, oppure possono derivare da una biopsia di un tessuto, possono derivare da un organo oppure da strutture coinvolte dalla riproduzione, come il cordone ombelicale o la placenta.
• Cellule: hanno molti modi di manipolazione; possono essere soggette a isolamento, ovvero vengono isolate dalla ECM, possono essere soggette a espansione (duplicazione), trasfezione del DNA (modifica del corredo genetico), induzione di pluripotenza, partenogenesi o clonazione.
• Scaffold: possono essere sintetici oppure organi o tessuti decellularizzati (scaffold naturali).
• Costrutto: viene definito come l’unione di scaffold e cellule. Può essere ricavato con una sospensione di cellule e aggregati (liquidi), oppure una matrice solida popolata, oppure un organo o tessuto ricellularizzato.
• Stimolazione: si intende soprattutto la stimolazione chimica, ma può essere anche fisica, con i bioreattori.
• Delivery: si tratta dell’impianto del costrutto, che può essere mininvasivo o invasivo. Nell’ambito del delivery mininvasivo il costrutto può essere iniettato.

Etica e regolamentazione

In qualsiasi paese occidentale esiste un’autorità che regola le autorizzazioni per mettere sul mercato i prodotti. Quella americana si chiama FDA, quella europea è la EMA, mentre quella italiana è l’AIFA. Sono enti regolatori, che regolano la messa in commercio dei prodotti.

Definizione dei prodotti per terapia cellulare e/o tissutale (PTC)

Definizione 1: “Preparazione in cui l’azione biologica principale è prodotta da cellule o tessuto anche in presenza di matrici o rivestimenti organici o inorganici”.

Definizione 2: “Per PTC intendiamo una preparazione somministrata ad un essere umano, con finalità simili a quelle di un farmaco, ma contiene cellule viventi o parti complesse di queste cellule (farmaco con delle cellule) e può essere somministrata o da sola o in associazione ad una matrice, che può essere sintetica o biologica”.

Si tratta di due definizioni complementari. Dal punto di vista delle regolamentazioni, i PTC sono equiparati ai farmaci. Non si è più nel campo dei dispositivi biomedici, ma dei farmaci. Ci sono delle criticità: la definizione 2 non comprende i sistemi extracorporei, dal momento che si tratta di una somministrazione, mentre i prodotti extracorporei sono completamente tagliati fuori.

Classificazione dei PTC

Sono classificati come prodotti che contengono cellule o parti complesse di cellule (ad esempio, DNA), ottenute dopo una manipolazione non minima. Ci si riferisce ad una manipolazione non minima come una procedura che altera le proprietà o genetiche o biologiche o fisiologiche del tessuto che viene manipolato (esempi sono l’attivazione della proliferazione cellulare con fattori di crescita, oppure la trasfezione, una tecnica di trasferimento degli acidi nucleici in una cellula tramite terapie geniche). Manipolazione minima o non minima non dipende dalla complessità e dalla grandezza dell’organo.

Rischi associati ai PTC

Con una manipolazione non minima di cellule si inseriscono anche dei rischi:

• Rigetto immunologico: si parla di rigetto quando il corpo umano attiva una risposta immunitaria a seguito del contatto con un elemento biologico non-self. Il rischio di rigetto vale in generale, ma è molto limitato nel caso di cellule mesenchimali (MSCs, cellule del tessuto connettivo umano) ottenute da donatori accoppiati con HLA.
• Formazione di tumori: deriva dall’utilizzo di cellule multi-potenti, o immortalizzate (staminali), parti di loro, oppure da fattori di crescita, proliferazione o differenziamento, o da scaffold. Il rischio è limitato in caso di cellule staminali mesenchimali.
• Formazione di un teratoma: si tratta di una formazione cellulare che si crea grazie alla proliferazione non controllata di cellule staminali pluripotenti.
• Trasmissione di infezioni: possono derivare dal materiale del donatore, oppure da qualsiasi forma di manipolazione.
• Somministrazione di contaminanti tossici: deriva dalla manipolazione cellulare.

Regolazione per la produzione di PTC

Essendo classificati come dei farmaci, i PTC sono soggetti alle stesse regolazioni dei farmaci. Si tratta di una regolamentazione implementata dalle industrie farmaceutiche, diversa da quella delle endoprotesi. La regolamentazione si basa su due requisiti minimi:

1. Tutte le fasi dello sviluppo, produzione, testing e commercializzazione del prodotto devono essere in accordo con un processo regolatorio standardizzato. Vi sono degli enti che regolano tali processi (AIFA) che verificano che tutto il processo sia compatibile col processo regolatorio.
2. Tutto il processo deve essere compatibile e deve corrispondere a degli standard internazionali di qualità. I principali standard di qualità sono:
   • GLP: Good Laboratory Practice. È attivo nella fase dello sviluppo del farmaco e in quella dei test in vitro;
   • GMP: Good Manufacturing Practice. È attivo nella fase di trial pre-clinico e clinico;
   • GCP: Good Clinical Practice. Attivo nella fase di trial pre-clinico e clinico;
   • cGMP: Current Good Manufacturing Process. Attivo durante la commercializzazione.

Sviluppo del processo regolatorio

In vitro: in questa fase il farmaco viene scoperto, sviluppato e testato in vitro su colture cellulari. Studio preclinico: in questa fase, il farmaco viene testato su modelli animali per valutare la sicurezza e l'efficacia, dunque per rispondere alle domande: è sicuro? Funziona in modo selettivo? Funziona con il meccanismo previsto? Il farmaco, poi, viene rilasciato per la sperimentazione clinica (punto viola all'anno 4): quando vengono forniti i corretti risultati, l'autorità rilascia il farmaco per uno studio clinico di Fase I sugli esseri umani.

Fase I, trial sull’uomo: in questa fase, il farmaco viene testato sull'uomo per la sicurezza e per rispondere alle domande: è sicuro? In che dosi? Per rispondere a queste domande, il test in questa fase viene solitamente condotto su un numero molto limitato di soggetti, ed è spesso chiamato "studio pilota".

Fase II, trial sull’uomo: in questa fase, il farmaco viene testato sull'uomo per l'efficacia, per rispondere alle domande: funziona meglio rispetto alla terapia convenzionale o al placebo? Per rispondere a questa domanda, il test in questa fase viene solitamente condotto confrontando due gruppi di pazienti, i cosiddetti "bracci sperimentali"; in uno i pazienti sono trattati con la terapia convenzionale o il placebo e nell’altro sono trattati con la terapia sperimentale. Il processo è in "doppio cieco", nel senso che né il medico tester né il soggetto sono a conoscenza di quale terapia viene applicata, né quella convenzionale uno/placebo o quello sperimentale.

Fase III, trial sull’uomo: in questa fase, il farmaco viene testato sull'uomo per l'efficacia, per rispondere alla domanda: funziona su una popolazione più ampia? Il test è condotto in "doppio cieco".

Rilascio per la commercializzazione (punto viola all'anno 10): quando vengono forniti i risultati e questi sono ottimali, l’ente regolatore concede il rilascio del farmaco per la commercializzazione. Fase IV, commercializzazione: si effettua una sorveglianza a lungo termine degli effetti avversi. Per i farmaci, consiste nell’obbligo del produttore di descrivere qualsiasi effetto avverso riportato sull’opuscolo informativo. Dopo 20 anni dalla domanda di brevetto scadono i brevetti relativi ai nuovi farmaci ed eventuali altre aziende possono produrre liberamente il farmaco, che diventa un cosiddetto farmaco "generico". Il costo del processo è di almeno 1 miliardo di euro, per 10 anni di test.

Nei progetti in vitro si è soggetti alle Good Laboratory Practice (standard). Sia la fase preclinica, sia quella clinica devono essere prodotte soddisfando sia GMP sia GCP. Le GMP partono non da quando si commercializza, ma devono essere già attive quando si inizia a produrre l’agente farmacologico per testarlo su animali, in modo che si arrivi al momento della sperimentazione sull’uomo con questi standard già attivi. Lo stesso vale per le GCP. Dal giorno dell’autorizzazione alla commercializzazione si è soggetti ad un altro campo di normative internazionali, che sono cGMP. La c sta per “current”, ovvero “attualizzate”. È necessario rivedere gli standard dopo un certo periodo di anni per le procedure industriali, in modo da controllare se sono aggiornati alle nuove tecniche.

Laboratorio di coltura cellulare

La manipolazione non minima viene effettuata in condizioni sterili. Per evitare la contaminazione biologica all’interno dei laboratori di coltura cellulare, gli strumenti fondamentali sono:

• Cappa a flusso biologico (o laminare): si tratta di una cappa in cui l’operatore inserisce le mani, all’interno della quale qualsiasi cosa che viene fatta viene sterilizzata da agenti batterici. L’aria contaminata viene aspirata dal basso, viene inviata a dei filtri e poi reimmessa attraverso un flusso laminare dall’alto.
• Incubatore di colture cellulari: si tratta di un sistema che è in grado di mantenere sempre la temperatura fisiologica di 37 gradi centigradi (più o meno 0.1 °C). Permette di mantenere anche una certa percentuale dei gas nell’aria (tra 1 e 20% per l’ossigeno e di 5% per la CO2); inoltre, permette il mantenimento della saturazione del vapore, di modo che il terreno di coltura non abbia la possibilità di evaporare.

Coltura cellulare statica e dinamica

La coltura cellulare statica viene effettuata nel dischetto di Petri: è un contenitore in cui vengono seminate delle cellule e viene riempito da un liquido opportuno. Questi vengono coperti da un coperchio apposito, capace di lasciar libero un lume di passaggio verso l’esterno che è in grado di tener fuori i batteri ma lasciar passare l’ossigeno. I sistemi dinamici, invece, sono caratterizzati dal fatto che il terreno di coltura non è fermo e cambiato di tanto in tanto, ma ha la capacità di ricircolare attraverso una pompa. L’aria viene fatta circolare attraverso degli strumenti appositi, come membrane e tubi.

Composizione del terreno di coltura

I terreni di coltura per le cellule sono dei sistemi complessi, che però hanno tutti una formulazione base. Sono costituiti prevalentemente da un solvente, ovvero l’acqua, e dei soluti con una certa concentrazione. In primis è presente il cloruro di sodio, che ha l’obiettivo di regolare la pressione osmotica della soluzione, resa isotonica rispetto alle cellule; il bicarbonato di sodio è un buffer di pH, ovvero è utile per mantenere il pH della soluzione in un certo range, che è fisiologico (tra 7.2 e 7.4): il bicarbonato reagisce con la CO2, mantenendo il pH in quel range; altri soluti sono fondamentali per fornire energia, nutrienti e mattoncini base di costruzione, come glucosio, amminoacidi e vitamine; il rosso fenolo, utile per colorare la soluzione in funzione del pH della soluzione (si ha un colore giallo o verde quando il pH è acido, mentre rosa o viola quando basico); il siero bovino, utile per provvedere all’apporto di fattori di adesione, ormoni e proteine; i fattori di crescita (non presenti nella formulazione base, ma sempre aggiunti), che stimolano la proliferazione cellulare, la crescita e la differenziazione; gli antibiotici, utili per la prevenzione delle contaminazioni batteriche.

GLP: Good Laboratory Practice

Per GLP si intende un set di regole che sottendono alla qualità degli studi di laboratorio. Sono basati su requisiti minimi anch’essi:

• Selezione di un sistema di coltura cellulare adeguato: è necessario spaziare tra la cultura statica ad una dinamica; inoltre, è necessario selezionare il corretto bioreattore.
• Selezione del miglior processo con cui è fatta la coltura cellulare: è necessario avere sistemi giusti per il monitoraggio dei parametri di coltura e bisogna avere in chiaro quale sia il processo di coltura ottimizzato, ovvero quello che consente di mantenere in stato ottimale le cellule (in funzione anche dei parametri, che devono essere mantenuti costanti).
• Sviluppo di test analitici opportuni per effettuare i controlli di qualità e sicurezza: bisogna avere sistemi per monitorare la sterilità e la cross-contaminazione, la presenza di contaminanti, la presenza di una certa concentrazione proteica.

GMP: Good Manufacturing Practice

Vi sono dei requisiti minimi anche in questo caso, per la produzione di PTC sia nella fase di test pre-clinici, che clinici:

• La produzione del PTC deve essere pensata insieme ad una strategia per il processo produttivo, includendo...