Medicina di labortorio

CUT OFF, SPECIFICITÀ, SENSIBILITÀ DI UN TEST E CURVA ROC

Un test è ideale quando vi è una netta separazione tra la popolazione dei malati e dei sani, in clinica diagnostica non vi è però una netta demarcazione tra queste due popolazioni che spesso sono sovrapposte, è quindi necessario definire un punto di cut off ossia un valore soglia al di sopra del quale i risultati del test sono definiti positivi. In particolare la performance diagnostica di un test è quindi definita come la capacità di discriminare i veri positivi nella popolazione dei malati e i veri negativi nella popolazione dei sani. In base al punto di cut off sono quindi definibili le caratteristiche di test diagnostici quali la specificità, ossia la capacità del test di riconoscere i veri negativi nell'intera popolazione dei sani, la sensibilità ossia la capacità del test di individuare i veri positivi nella popolazione dei malati e nel caso dei soli test diagnostici il valore predictive positivo, ossia la probabilità che un vero positivo sia realmente positivo pari al rapporto tra veri positivi e i soggetti positivi sia falsi che veri al test, e infine la preuttività negativa pari alla probabilità che un soggetto negativo sia realmente sano. È possibile scegliere in maniera ottimale il punto di cut off prendendo in esame la curva di Roc fondamentale nel definire il grado di accuratezza di un test diagnostico. In particolare la curva di Roc studia un test diagnostico in funzione della sensibilità dello stesso e quindi della capacità di individuare i veri positivi è in funzione della capacità del test di individuare i falsi positivi pari al valore(1- specificità). In particolare ponendo sull'asse delle ascisse il valore (1-specificità) e sull'asse delle ordinate la sensibilità e quindi utilizzando i diversi valori di tali parametri ottenuti variando il punto di cut off è possibile ottenere una curva per intrapolazione, l'area sottesa alla curva definisce dunque il grado di accuratezza e di validità di un test in particolare il test è ideale quando l'area sottesa alla curva è pari a 1 quando però l’area sottesa alla curva, che in questo caso è una retta,è pari a 0,5 il test non è indicativo. È quindi possibile in base all'andamento della curva di Roc definire il punto di cut off ottimale del test al fine di avere la migliore performance diagnostica.

PCR REALTIME

La PCR real time è una tecnica di biologia molecolare attraverso la quale è possibile amplificare e contemporaneamente quantificare una specifica sequenza di DNA. Attraverso la realtime PCR è quindi possibile definire la presenza o l'assenza all'interno di un campione, oltre che la quantità di copie, di una determinata sequenza genetica. Da un punto di vista procedurale la real time PCR segue il meccanismo della PCR standard a cui viene comunque aggiunta anche la quantificazione dell'amplificato a ogni ciclo di amplificazione mediante l'utilizzo di specifiche molecole fluorescenti in grado di intercalarsi nella molecola a doppio filamento di DNA o sonde oligonucleotidiche fluoromarcate. Nello specifico la PCR ha inizio con la denaturazione della molecola di DNA in quel localizzata la specifica sequenza da amplificare ponendo il campione a una temperatura tra i 90 e i 95 gradi. Successivamente il campione viene incubato a una temperatura di circa 65 gradi circa con dei primer specifici per le sequenze situate agli estremi di quella da amplificare,quindi il campione viene portato alla temperatura di 75 gradi circa e viene aggiunta una polimerasi termosensibile nota anche come TAQ polimerasi che quindi determina l'amplificazione della sequenza genetica. Il ciclo viene quindi ripetuto più e più volte al fino a quando non viene ottenuta la giusta quantità necessaria di amplificato. Come precedentemente affermato nella real time PCR ad ogni ciclo di amplificazione avviene una quantificazione grazie all'aggiunta di molecole fluorescenti in grado di intercalarsi a livello del solco minore della molecola di DNA e quindi emettere una fluorescenza proporzionale alla quantità di copie della data sequenza genetica anche se essendo queste molecole fluorescenti aspecifiche vi può essere una sovrastima della quantità dell'amplificato o ancora sonde oligonucleotidiche in cui sono presenti particolari molecole reporter fluorescenti al 5' e inibitori quincer al 3' che permettono dunque alla molecola di emettere fluorescenza solo quando la Taq polimerasi, avente anche funzione esonucleasica, determina la degradazione della sonda una volta che questa sia intercalata nella sequenza specifica

Di infarto al miocardio, nelle epatiti virali, in alcuni carcinomi quali quello alla prostata e quelli che metastatizzano al polmone e al fegato, ancora nelle psicosi e nelle schizofrenie. Può provocare un aumento della concentrazione delle aldolasi anche il sovradosaggio di ACTH e di cortisonici.

FOSFATASI ACIDE: comprendono un gruppo di 20 isoenzimi a localizzazione lisosomiale frazionati elettrofonicamente in 5 bande rispettivamente la banda 1 a localizzazione prostatica, la banda 2 e 4 nei granulociti, la banda 3 negli eritrociti, nelle piastrine e nei monociti e la banda 5 nelle cellule del Kupffer, nei monociti, negli osteoclasti. La forma prostatica e la forma ossea vengono distinte in base al test di resistenza al tartaro, positivo nella forma ossea. I livelli di fosfatasi acida dipendono dell'età essendo più alti nei bambini e negli adolescenti a causa dell'elevata crescita e sviluppo osseo. Valori aumentati sono riscontrati in molte patologie primate da quelle infettive a quelle che provocano iperplasia della ghiandola fino ai carcinoma dove i valori sono spesso associati alla gravità della neoplasia. Valori aumentati sono poi riscontrati anche in caso di patologie ossee e malattie urinarie. La fosfatasi acida viene inoltre dosata nel fluido vaginale mediante tampone alla ricerca di liquido seminale nei casi di presunta violenza sessuale.

AMILASI: enzimi in grado di scindere i carboidrati complessi. Se ne conoscono due forme isoenzimatiche quella salivare a sua volta comprendente 12 diversi fenotipi e quella pancreatica di cui si conoscono 6 fenotipi. Le amilasi vengono generalmente filtrate ed eliminate a livello renale i valori delle amilasi sono ridotte alla nascita e raggiungono le concentrazioni normali al primo anno di età. Un aumento delle amilasi nelle urine è riscontrato nelle pancreatiti acute ma non nelle pancreatiti croniche ancora nell' abuso di oppiacei ed eroina, nelle malattie infettive quali le parotiti, nell'abuso di alcool anche se in questo caso è più utile il dosaggio della GGT.

LIPASI: enzimi prodotti dal pancreas insieme alla colipasi cofattore necessaria alla loro azione, in grado di scindere i trigliceridi in

L'eme subisce innanzitutto il distacco dello ione ferro che tramite il legame con la transferrina viene trasferito al fegato dove viene immagazzinato in interazione con la ferritina e quando quest'ultima è saturata con la emosiderina, dunque una emosidasi apre la struttura ciclica dell'eme si verifica quindi la conversione di questa struttura in pigmenti biliari da l biliverdina e quindi bilirubina indiretta che non essendo solubile viene trasportata al fegato in interazione con l'albumina. Una volta nel fegato la bilirubina indiretta viene coniugata ad opera della glucuronil transferasi con due residui di acido glucuronico a formare bilirubina diretta poi riversata insieme alla bile nel duodeno dove viene trasformata ad opera della flora batterica intestinale in urobilina che in parte permane nel lume intestinale seguendo il chimo e quindi venendo eliminata con le feci trasformandosi in stercobilina e successivamente in stercobilinogeno che è uno dei pigmenti che dà colore alle feci stesse; gran parte dell'urobilina viene invece riassorbita in circolo e in parte filtrata a livello renale e quindi escreta con le urine dove al contatto con l'ossigeno atmosferico subisce ossidazione convertendosi in urobilinogeno responsabile del tipico colore giallo paglierino delle urine. Il dosaggio della bilirubina totale e delle frazioni diretta e indiretta in base alla necessità è fondamentale a valutare la causa della comparsa dell'ittero ossia una condizione caratterizzata dal colorito giallastro della cute e delle mucose della sclera. In particolare nell'ittero pre epatico in genere causato da un aumentata distruzione dei globuli rossi si verifica un aumento della bilirubina sia diretta che indiretta e dello stercobilinogeno. Nell'ittero intraepatico dovuto invece all'incapacità del fegato di captare la bilirubina indiretta, a danno epatico funzionale come nel caso di cirrosi o ancora a malattie genetiche come la sindrome di Gilbert in cui vi è un deficit enzimatico di glucuroniltransferasi vi è invece un aumento della sola bilirubina indiretta. Infine l'ittero post epatico è invece associato a un ostruzione delle vie biliari conseguente a compressione dovuta a tumori della testa del pancreas o alla presenza di calcoli biliari con conseguente aumento della bilirubina diretta che quindi passa in circolo.