Medicina di laboratorio su HPV

I fattori di rischio sono un alto numero di partner o anche la presenza di altre infezioni che spesso si

manifestano in concomitanza con infezioni da HPV; giacchè il sistema immunitario non è capace di far

fronte in contemporanea a due infezioni ed è possibile in tal modo rendere facile l'instaurarsi di

un'infezione, così come in casi di immunodepressione.

Fattori che favoriscono la persistenza del virus e la sua evoluzione neoplastica:

 l'elevata carica virale,

 infezioni multiple,

 l'integrazione del genoma virale in quello cellulare

 la presenza di ceppi ad alto rischio

Il tumore alla cervice uterina è il più diffuso in tutto il mondo e colpisce maggiormente le donne in età

compresa tra i 30 e i 50 anni. Esiste un meccanismo biologico che sta alla base del potenziale oncogeno di

HPV, che spiega come la sola infezione da HPV NON PUO' CAUSARE CANCRO, ma devono esserci altri fattori

coadiuvanti i quali possono essere di natura genetica, deficit immunitario anche il fumo di sigarette. Ciò è

spiegato dal fatto che il fumo favorisce l'ossidazione cellulare e quindi causa un indebolimento della

cellula, che in tali condizioni trova maggiori difficoltà nel reagire ad infezioni da HPV.

Considerando lo strato basale dopo le infezioni da HPV si hanno delle manifestazioni specifiche e in questi

casi la cellula infetta presenta degli aloni paranucleari e prende il nome di COILOCITA, ovviamente si può

passare allo stato C1: lesione di tipo precanceroso, dove le prime cellule dello strato basale iniziano ad

essere trasformate. In progressione, abbiamo lo stato di C2 dove metà dello strato basale è completamente

trasformato, a cui segue il C3, carcinoma in situ; se in tali condizioni non si procede con l'intervento si può

passare allo stato di carcinoma invasivo, dove ovviamente la cellula metastatica può attraversare la

membrana basale e metastatizzare altri distretti.

Bisogna capire che il momento che intercorre tra il contagio, lo sviluppo ed il carcinoma è di decenni e

quindi nel corso di questo tempo è facile poter praticare uno screening, citologico o colposcopico od

intervenire con trattamenti vari.

L'HPV non è un virus che colpisce solo l'universo femminile, ma può infettare anche l'uomo; tale virus si può

trovare nell'apparato genitale maschile, soprattutto a livello dell' epididimo, del dotto deferente e del

liquido seminale. Per quanto riguarda il liquido seminale, si è visto che il virus alberga nella testa dello

spermatozoo, a livello della regione equatoriale, laddove è presente il recettore per HPV che è il SYNDECAN

1. Cosa succede quindi allo spermatozoo infettato? La presenza di HPV è associata ad una ridotta motilità

dello stesso e sperimentalmente essi sono comunque capaci di fertilizzare un ovocita, e all'interno

dell'ovocita i geni HPV possono essere replicati, trascritti e tradotti.

Ovviamente, ciò potrebbe creare problemi nei casi di fecondazione assistita ed, in presenza di tal virus, si

applicano dei lavaggi sul liquido seminale onde evitare il contagio. Tutto questo ovviamente viene fatto IN

VITRO, di certo essendo lo spermatozoo molto lento a causa da HPV in vivo non sarebbe in grado per

competizione di fecondare l'ovulo.

Come HPV interferisce nel ciclo cellulare

Il ciclo cellulare di una cellula è costituito da 4 fasi, G1-S-G2-M, e all'interno del ciclo ci sono dei momenti di

controllo affinché tutto il ciclo possa svolgersi nel migliore dei modi; quando la cellula subisce un'infezione

virale o un insulto di qualsiasi tipo, vengono ad essere prodotti degli oncosoppressori, primo tra tutti P53

che inibirà il complesso Ciclina-CdK, così la cellula, non potendo trascrivere nulla, bloccherà il ciclo e o

risolve il problema o sarà interessata dal fenomeno dell'apoptosi. Analoga funzione ha la proteina RB, altro

oncosoppressore che legando un fattore trascrizionale, rende statica la cellula arrestandola in fase G1 o

avviando in essa il processo di morte programmata.

Quando la cellula è infettata da HPV vengono espresse le proteine E6 ed E7, la proteina E6 blocca P53

legandosi ad essa, così P53 sarà impossibilitata ad agire e verrà degradata proteoliticamente e la cellula

continuerà a funzionare benissimo perchè il complesso Ciclina CdK potrà trascrivere serenamente e in

modo non controllato.

Per il controllo cellulare è importante anche l'attività delle telomerasi, che sono enzimi capaci di integrare i

telomeri che vengono via via consumati; sappiamo che nelle cellule somatiche è un'attività assente

pertanto la cellula dopo essersi riprodotta varie volte, va incontro ad un processo di senescenza e morte; in

presenza di E6, la cellula diviene tumorale perché presentando le telomerasi, la cellula diviene immortale.

Il funzionamento di E7 è sovrapponibile a E6: E7 legherà il soppressore RB e, quindi, libera il fattore

trascrizionale E2F che può portare la cellula ad intraprendere il suo ciclo cellulare.

Un altro gene funzionale è E2, una proteina che permette la replicazione dei geni virali ed è importante per

la segregazione dei genomi virali quando la cellula si divide e funge da controllore dell'espressione di E6 ed

E7. A bassi livelli, funge da attivatore trascrizionale, permette la trascrizione dei geni che stanno a valle,

quindi E6 ed E7; se invece è espresso ad alti livelli, si legherà al promotore, sito dove si lega la dna

polimerasi, che si trova a monte di E6 ed E7 e di conseguenza parte del trascritto di proteine non verrà

prodotto. Soprattutto E2 è importante nell'integrazione del Dna virale in quello cellulare, giacchè l'HPV si

integra nel genoma dell'ospite. Se si pensa bene però l'integrazione dei due genomi non è tanto positiva

perchè questa fa perdere la continuità del materiale genetico e così questo non verrà mai replicato in toto

con la formazione di Virioni, così non sarà permesso lo sviluppo del naturale ciclo biologico del virus.

La localizzazione sui cromosomi è di tipo casuale, cioè avviene in qualsiasi tipo di cromosoma e di sito.

Recentemente sono stati riscontrati dei ''siti fragili'', che sono dei siti particolarmente predisposti

all'inserimento di un pezzo di genoma esogeno e nel momento in cui si integrerà questo tratto genomico

potranno verificarsi dei riarrangiamenti cromosomici; questi tipi di processi potrebbero anche portare

all'attivazione di un oncogene, quindi alla trasformazione neoplastica. Mentre è casuale il punto di

localizzazione e integrazione del genoma, è caratteristico il punto in cui il genoma virale si apre, non si

integra mai in toto, ma si perde il gene E2. Quindi, abbiamo detto che il Dna virale non si integrerà mai in

toto, ma perderà sempre un pezzettino e si avrà la delezione del pezzo E2. In questi casi, mancando il gene

E2 e la sua proteina codificata, ci saranno bassi livelli di espressione di questa proteina, pertanto verrà

avviata la trascrizione e di conseguenza verranno prodotti E6 ed E7 in modo incontrollato. L'integrazione di

HPV è collegata ad un concetto di oncogenesi ma non è imprescindibile da essa, cioè sono stati visti casi in

cui con il carcinoma della cervice uterina, il DNA non era stato integrato nell'ospite .

DIAGNOSI DI LABORATORIO

Generalmente esiste

 isolamento colturale

 indagine sierologica,

 pap test,

 indagini di tipo molecolare.

Per l'isolamento colturale, si prende il campione biologico e lo inserisco in una coltura adeguata e aspetto i

tempi fondamentali per permettere al virus di poter infettare il terreno: in tal caso però, proprio per HPV

non è possibile questo tipo di indagine perchè è un virus che ha tropismo solo per gli epiteli. Infatti, in

coltura in questi casi dovrei mettere tutti gli strati di differenziazione epiteliali, ma queste culture sono

dispendiose perché sono organotipici, e anche in termini di tempo non convengono molto. Questo tipo di

isolamento in virologia è comunque importante perchè fa capire se il terreno è stato infettato dal virus e

testa anche la virulenza, cioè la capacità di un virus di infettare una cellula vicina . Al giorno d'oggi tale

metodica non è molto utilizzata perchè richiede almeno 15 gg di tempo per poter fare diagnosi.

Per quanto riguarda la sierologia è impossibile fare diagnosi.,. perché non ci sono marcatori anticorpali

PAP test è un esame citologico che identifica velocemente alterazioni della mucosa uterina; presenta vari

pro e contro tra cui la bassa sensibilità, l'esperienza di lettura dell'operatore deve essere comprovata e

possono essere fatti errori anche a livello del prelievo del campione.

L'indagine di biologia molecolare risulta essere la più attendibile e sicura non solo nell' ambito da HPV ma in

tutto il campo della virologia, e ha quindi soppiantato tutte le altre metodiche diagnostiche. E' molto

efficace perchè vede tutte le modificazioni citologiche di cellule infette.

Tecniche utilizzate sono ad esempio la PCR che permette il riconoscimento di uno specifico gene target dell'

acido nucleico, tali tecniche servono per vedere con quale genotipo virale si è infettato l'organismo e serve

anche a rilevare l'mRNA per E6 ed E7. I genotipi che si riscontrano con maggior frequenza a livello mondiale

sono i: 16- 18- 31-33-45. Tale tipo di indagine evidenzia in maniera precoce l'attività trascrizionale del virus;

la presenza di E6 ed E7 come marcatori di infezione persistente e indica l'evoluzione in senso neoplastico

della lesione.

I Campioni biologici variano a seconda del sito dove devo ricercare la lesione: per quanto riguarda la sfera

ano-genitale, si parte dal tampone, per arrivare al Cytobrush, lo striscio; per gli uomini, si applica il tampone

uretrale e del liquido seminale.

Il campione sangue non è diagnostico perchè il virus rimane in zona mucosale e cutanea, ma in alcuni

pazienti con carcinoma in stato avanzato si è riscontrata la presenza del virus anche nel sangue periferico

perchè cellule tumorali che si staccano dalla massa di origine entrano in circolo per dirigersi in nuovi

distretti. Iter diagnostico molecolare

Estraendo tutti gli acidi nucleici, vado a cercare l'HPV DNA, tramite la PCR e qualora si trovasse un riscontro

positivo al test bisogna vedere quali dei genotipi di HPV è quello a cui imputare l'infezione e vedere se è ad

alto o basso rischio. La tipizzazione viene fatta ovviamente ricercando i genotipi più comuni e si può anche

ricercare l’mrna di E6 ed E7.

Non esistono