Meccanismi di riparo del DNA, Microbiologia

I meccanismi di riparo del DNA

La prima slide ci fa vedere come ceppi batterici possono sopravvivere meglio o peggio ad agenti

che danneggiano il DNA. Questo è un tipico esperimento in cui noi possiamo prendere dei batteri

ed esporli a degli agenti che danneggiano il DNA, sia agenti chimici o fisici, facciamo sempre

l'esempio dei raggi ultravioletti, e dopo l'esposizione andare a fare quella che viene chiamata curva

di sopravvivenza. Cosa vuol dire? Vuol dire prendere delle aliquote (ormai siete espertissimi a fare

le CFU) quindi vuol dire fare le CFU, fare una conta vitale. Quindi a dosi crescenti del nostro

trattamento andiamo a vedere quanti batteri sopravvivono. Se noi facciamo questo con ceppi

batterici diversi, in particolare qui abbiamo quello che viene definito Wilde Type e qui abbiamo il

mutante, o magari ceppi batterici diversi solamente non so, possiamo vedere che ci sono delle curve

diverse, quindi il fatto che ci siano delle curve diverse ci sta ad indicare (curve diverse di che? Di

sopravvivenza ad un determinato trattamento) che ci sono diciamo batteri che possono sopravvivere

meglio e batteri che invece sopravvivono peggio. I particolare in questo grafico viene riportato il

confronto tra un ceppo WT e un ceppo mutante, e noi vediamo che il mutante è più sensibile

all'agente genotossico. Questo che cosa ci porta a concludere, pensando in termini genetici, ci porta

a concludere che il mutante avrà disattivati dei pathway che servono a sopravvivere a quell'agente

mutageno, se l'agente è un agente genotossico è un agente che determina delle aberrazione a livello

del DNA possiamo concludere che il mutante avrà disattivati dei meccanismi di riparo del DNA e

indirettamente possiamo concludere che esistono dei meccanismi di riparo del DNA. Quindi in

soldoni diciamo che questo tipo di risposta è atteso quando esistono dei meccanismi di riparo quindi

quando noi li eliminiamo abbiamo una ridotta sopravvivenza. Questa è la solita tabella con una serie

di geni di E.coli coinvolti nel meccanismo di riparo, vedete è una tabella molto lunga che ci sta ad

indicare che i meccanismi e anche le funzioni geniche sono diverse e quindi questo ci sta ad

indicare che i meccanismi di riparo del DNA sono molteplici e quindi la storia è abbastanza

complicata. In generale, possiamo suddividere i meccanismi di riparo del DNA in meccanismi

specifici e meccanismi più generali. Definiamo i meccanismi specifici quei meccanismi che vanno a

riconoscere una specifica lesione e a correggerla, meccanismi a specifici non hanno una determinata

specificità per una particolare lesione, per esempio una base deaminata, ma riconoscono per

esempio una distorsione della doppia elica. I meccanismi specifici sono diversi, il primo che

andiamo a vedere riguarda meccanismi che vanno a eliminare in maniera selettiva le basi

deaminate. Qui vi ho messo degli esempi di deaminazione di basi. Allora la deaminazione vuol dire

la rimozione del gruppo aminico -NH2. Cosa succede se io elimino il gruppo aminico dalla citosina

vuol dire che la citosina invece di quell'-NH2 avrà un ossigeno e quindi dalla citosina mi passa ad

uracile. Se una citosina mi passa ad uracile una base di tipo GC mi diventa AT. La stessa cosa se

elimino il gruppo aminico dall'adenina questa mi diventa inosina e quindi AT mi diventa GC. Dalla

guanina tolgo il gruppo aminico e posso avere AT e AT, perchè la guanina deaminata mi può dare la

xantina o l'oxo-guanina. Questo tipo di alterazione se non viene corretta quindi mi determina una

mutazione. Io passo da qui a qui (es. AT->GC) quando non ho correzione. Esistono però degli

enzimi che sono capaci di rimuovere in maniera specifica le basi deaminate. Qui vi ho solo messo

per ricordarvelo ( forse lo ricordate meglio di me) questo è il legame glicosidico. Il legame

glicosidico è il legame che tiene legata la base allo zucchero, perchè dobbiamo prendere in

considerazione il legame glicosidico? Perchè per rimuovere la base deaminata noi utilizziamo degli

enzimi che vengono chiamati DNA-glicosilasi, sono degli enzimi che tagliano in maniera specifica

quel legame glicosidico. Ma dove lo tagliano? Non lo taglieranno sempre perchè se lo tagliano

sempre distruggerebbero tutto il DNA, tagliano il legame glicosidico della base deaminata. Quindi,

se questa è la doppia elica e questa una base deaminata, l'N-glicosilasi la riconosce e rimuove la

base deaminata. Ma no può finire lì perchè se rimuovo la base deaminata io ottengo un sito AP

(apurinico o apirimidinico) un sito senza base, allora ecco che subentra un altro enzima

Apurinicendonucleasi

che riconosce il sito che ha perso la base e lo taglia. Cosa taglia? Taglierà lo scheletro

fosfato-zucchero e quindi a questo punto determina un gap. Quando siamo arrivati al gap siamo

apposto perchè una volta che noi abbiamo un gap abbiamo la DNA polimerasi I, vi ricordo è la

riparativa, che copia quindi sintetizza l'informazione mancante utilizzando come stampo il

filamento omologo continuo, poi ci saranno le elicasi che richiudono e quindi in questo modo noi

abbiamo riparato la lesione. le N-glicosilasi sono diverse e sono tante quante sono le diverse basi

deaminate. In E. coli è molto importate questo meccanismo di riparo e ve ne accorgete dal fatto che

sono state isolate ad oggi una dozzina di N-glicosilasi, almeno 12 diverse, quindi vuol dire che il

sistema è molto utile e si sono selezionati nell'evoluzione tutta una batteria di enzimi che fanno

questo lavoro. Questo meccanismo a due step può essere operato anche da un altro tipo di enzima,

le AP liasi. Le AP liasi hanno entrambe le attività, cioè vi rimuovono la base deaminata e il sito

apurinico. Quindi la lesione, questo tipo di lesioni, cioè l'eliminazione delle basi deaminate, può

avvenire in 2 step o con delle glicosilasi a cui segue l'attività delle endonucleasi apuriniche oppure

utilizzando queste APliasi che hanno entrambe le attività. Questo meccanismo che viene chiamato

VSP (very short patch repair) è un meccanismo particolare che rietra sempre nei meccanismi di

riparo delle basi deaminate. È particolare perchè è rivolto alla correzione di una particolare base

deaminata che è la 5-metil-citosina. Voi sapete che molti organismi, forse in tutti gli organismi,

esistono questi meccanismi di modificazione del DNA post sintesi e consistono proprio nel

modificare le basi aggiungendo dei gruppi metilici, questo esiste sia nei procarioti che negli

eucarioti. Negli eucarioti per esempio la metilazione dei promotori, che cambiano forza quando

sono più o meno metilati. Nei procarioti esistono delle metilasi, un altro sistema che utilizza la

metilasi è per esempio la difesa dagli enzimi di restrizione, avetestudiato gli enzimi di restrizione e

possiamo considerarlo un meccanismo immunitario dei batteri quidi un batterio che produce u

enzima di restrizione si deve difendere, EcoRI che è l'enzima prodotto da E. coli si deve difendere

da quell'enzima, e come si difende? Metilando i siti riconosciuti dall'enzima di restrizione. Quindi la

metilazione è un processo importante di difesa, però cosa succede se una base metilata viene

deaminata? Allora nel caso della 5- metil-citosina, non vi ho fatto tutto il percorso, ma allora la

deaminazione della 5-metil-citosina porta ad una variazione del codice genetico delle basida GC ad

GT e praticamente quello che succede è che se io deamino la citosina produco la timina, la timina

essendo una normale base per il DNA non può essere riconosciuta da nessuna N-glicosilasi, non

esiste una N-glicosilasi che riconosce la timina, quindi se non si potesse correggere questo errore si

avrebbe per forza una mutazione. Invece esistono dei siti particolati che sono questi con questa

sequenza questo meccanismo è valido solo per questi siti CCmWGG (W=AT o TA) Se io mi trovo

una metilazione nella seconda citosina e la seconda citosina metilata si deamina subentra questo

meccanismo VSP. VSP in realtà è un'endonucleasi che riconosce in maniera specifica la 5-

metilcitosina

deaminata che ora è una timina, in questa sequenza, ci si lega, la taglia, si forma un gap che

poi viene riparato dalla polI. Quindi a questo punto se noi prendiamo in considerazione i difetti

dovuti alla deaminazione della base facciamo due sottoclassi, una classe più generale in cui la

riparazione avviene ad opera delle glicosilasi ed endonucleasi apuriniche o APliasi e una seconda

classe di danno molto specifico riconosciuto da questo VSP, che consiste nel riconoscimento di una

metil-citosina deaminata presente in maniera specifica in questa sequenza. La seconda classe di

danni che prendiamo in considerazione e quindi di meccanismi di riparo di questi danni, sono i

danni causati dai ROS. Questi sono una serie di elementi che fanno parte di questa famiglia, ROS

sta per Reactive Oxygene Species (specie reattive dell'ossigeno)sono composti altamente reattivi

perchè hanno almeno un elettrone in più