Meccanismi di riparo del DNA, Microbiologia

GT e praticamente quello che succede è che se io deamino la citosina produco la timina, la timina

essendo una normale base per il DNA non può essere riconosciuta da nessuna N-glicosilasi, non

esiste una N-glicosilasi che riconosce la timina, quindi se non si potesse correggere questo errore si

avrebbe per forza una mutazione. Invece esistono dei siti particolati che sono questi con questa

sequenza questo meccanismo è valido solo per questi siti CCmWGG (W=AT o TA) Se io mi trovo

una metilazione nella seconda citosina e la seconda citosina metilata si deamina subentra questo

meccanismo VSP. VSP in realtà è un'endonucleasi che riconosce in maniera specifica la 5-

metilcitosina

deaminata che ora è una timina, in questa sequenza, ci si lega, la taglia, si forma un gap che

poi viene riparato dalla polI. Quindi a questo punto se noi prendiamo in considerazione i difetti

dovuti alla deaminazione della base facciamo due sottoclassi, una classe più generale in cui la

riparazione avviene ad opera delle glicosilasi ed endonucleasi apuriniche o APliasi e una seconda

classe di danno molto specifico riconosciuto da questo VSP, che consiste nel riconoscimento di una

metil-citosina deaminata presente in maniera specifica in questa sequenza. La seconda classe di

danni che prendiamo in considerazione e quindi di meccanismi di riparo di questi danni, sono i

danni causati dai ROS. Questi sono una serie di elementi che fanno parte di questa famiglia, ROS

sta per Reactive Oxygene Species (specie reattive dell'ossigeno)sono composti altamente reattivi

perchè hanno almeno un elettrone in più (acqua ossigenata, il radicale OH.), esistono anche i NOS,

specie reattive dell'azoto che causano gli stessi problemi. Diciamo che prima di arrivare ad avere un

danno da queste specie chimiche le cellule hanno una serie di enzimi che sono deputati ad

eliminarli, ad esempio la catalasi tipico enzima batterico che scinde l'acqua ossigenata, i batteri

vengono suddivisi in catalasi positivi e catalasi negativi. La mieloperossidasi enzima che a partire

dall''acqua ossigenata in presenza di HCl, quindi di cloro, forma l'acido ipocloroso HOCl. Questo è

uno dei meccanismi di killing che viene operato dai macrofagi quando devono uccidere i batteri

intracellulari. Nel lisosoma c'è la mieloperossidasi, e quindi quando il lisosoma si fonde con il

fagosoma e forma il fagolisosoma che porta all'interno il batterio uno dei meccanismi con cui il

fagolisosoma può uccidere il batterio è proprio attivando la mieloperossidasi che utilizza la H2O2 e

degli ioni Cl per formare l'acido ipocloroso, e l'acido ipocloroso uccide i batteri. I ROS possono

essere variamente utilizzati dalle cellule anche come meccanismi di difesa dai batteri, tutte le cellule

si possono difendere eliminandoli o utilizzandoli per eliminare altri batteri. Questo è più o meno lo

stesso schema, vi fa vedere come si producono i ROS e come si arriva ad avere detossificazione,

quindi ad eliminare i ROS. Se non eliminiamo i ROS completamente comunque i ROS riescono ad

interagire con il DNA, questi sono i danni che si formano, si formano delle basi modificate, quella

più usata è la 7,8-diidro-8-oxoguaninina chiamata GO ( o anche 8-oxodg). Cosa succede quando

questa base si trova nel DNA? Quando si trova nel DNA si ha una variazione della sequenza da GC

ad AT perchè la 8-oxoguanina invece di legare la citosina lega la adenina quindi se non viene

eliminata voi avete variazione di sequenza da GC ad AT,alla successiva sintesi voi avete che nel sito

invece di esserci GC vi trovate AT. E se questa base non viene rimossa questo errore viene

perpetuato poiché la sintesi è semiconservativa. Chi è che fa questo lavoro di pulizia? Viene fatto

dal complesso dei Mut. Molti dei geni coinvolti nei processi di riparo sono stati chiamati Mut

perché quando vengono a mancare si induce mutagenesi, perché l'abbiamo visto se la base non

viene eliminata e l'errore non viene corretto si fissa una mutazione. Nella fattispecie il pathway che

andiamo a vedere è costituito da tre geni MutM MutY MutT. Iniziamo da quello in blu

(MutT)perchè è il più semplice ed è il meno diretto nel senso che è un enzima di detossificazione

perchè vedete MutT in realtà è una fosfatasi che mi va a eliminare in maniera specifica la 8-oxo

guanina quindi se me la elimina io non la incorporo nel DNA, ci siete? Quindi elimina, è come la

catalasi che mi rimuove H2O2 ok? È un enzima detossificante! Poi ci sono invece MutM e MutYche

vanno a riparare l'8-oxoguanina che si è già incorporata, quindi io la posso eliminare prima oppure

comunque se la incorporo la devo eliminare. Come la elimino? Allora MutM è una N-glicosilasi

quindi è sempre una glicosilasi, le abbiamo già viste le glicosilasi per le basi deaminate e tagliano il

legame glicosidico, e quindi tolgono la base. MutM è una N-glicosilasi specifica per l'8-oxoguanina

quindi naturalmente se voi togliete la base 8-oxoguanina scindendo il legame glicosidico vi rimane

il sito apurinico, come lo rimuovete? Con le APendonucleasi! Vediamo cosa fa MutY: in realtà fa

una cosa diversa perchè non va a rimuovere l'8-oxoguanina ma mi rimuove la base opposta, quindi

è sempre una N-glicosilasi che rimuove la A opposta all'8-oxoguanina. Quindi è un riparo un po'

falsato perchè comunque mi rimane l'8-oxoguanina (si spera che poi venga corretta). È talmente

importante eliminare questa 8-oxoguanina che si scelgono entrambe le strade, quella più breve, cioè

eliminare subito l'8-oxoguanina, quella un pochino più lunga, ovvero intanto mi elimino la A perchè

sta al posto sbagliato e poi vediamo se la cellula riesce ad eliminare. Qui è uno schema che

rappresenta quanto abbiamo detto, quindi abbiamo detto che MutT è una fosfatasi che mi elimina

l'8-oxoguanina prima di essere incorporata, se viene incorporata abbiamo MutM che me la elimina

direttamente oppure MutY se avviene prima la replicazione rispetto all'intervento di MutM, quindi

perpetuo questa situazione, MutYmi può togliere la A. una volta che ho tolto la A io posso mettere

la C e se riesco a mettere la C praticamente ripristino l'informazione, se non riesco a mettere la C mi

porto dietro la mutazione, però elimino la G. In questa slide ho voluto sottolineare quali sono le

caratteristiche genetiche di questi mutanti Mut, qui la prima cosa è abbastanza intuitiva perchè

l'abbiamo fatto ripetutamente questo discorso quando riusciamo a riconoscere se 2 mutazioni

agiscono allo stesso pathway oppure se agiscono in pathway diversi, quindi questi 3 geni che

abbiamo visto in realtà possiamo considerarli come 3 geni che appartengono allo stesso pathway o a

3 pathway diversi? DIVERSI perchè fanno cose diverse, il loro gol ultimo è eliminare l'8-

oxoguanina però ci arrivano con 3 vie diverse, quindi il fenotipo di mutanti singoli, doppi o tripli è

lo stesso o è diverso? È DIVERSO! I doppi saranno più gravi dei singoli, i tripli saranno ancora più

gravi; il fenotipo è additivo, l'effetto delle mutazioni in questi geni è additivo! L'altra cosa da

considerare e questo va un pochino questo il secondo punto è generale, vale un po' per tutti i

meccanismi di riparo, perchè abbiamo detto che i meccanismi ( per lo meno per quelli specifici) i

meccanismi di riparo molto spesso sono dei meccanismi specifici quindi questo che cosa vuol dire

che se io elimino questi geni la frequenza di mutazioni non sarà uguale per tutti i geni o per tutti i

siti perchè c'è una sorta di specificità di sequenza per esempio per quanto abbiamo visto fino adesso

abbiamo visto che il Very Short Patch Repair quello è molto specifico, quindi se io elimino il

meccanismo di riparo mi aspetterò mutazioni in quel sito ma non nel resto del genoma. Quindi le

mutazione nei geni Mut aumentano la frequenza di mutazioni in alcuni siti, cioè per alcuni tipi di

mutazioni. Un'altra lesione che si può verificare è l'alchilazione. per alchilazione intendiamo

l'aggiunta di gruppi alchilici CH3, CH3CH2 bla bla bla.. l'aggiunta di questi gruppi può avvenire in

seguito ad esposizione ad agenti alchilanti, qui ce ne sono alcuni, li riconoscete come tipici agenti

mutageni. Quando si faceva la mutagenesi random (adesso si fa un po' meno) e per mutagenizzare

un ceppo gli davo metil-metansulfonato (MMS). La formazione di basi alchilate determina quindi

delle mutazioni e quindi anche per questa lesione esistono dei geni specifici che rimuovono le basi

alchilate. Vediamo dei geni che rimuovono in maniera specifica per esempio la 3-metil adenina e la

3-metil guanina che è il prodotto di questo gene AlkA. Questi enzimi naturalmente ritornano

diciamo come enzimi che tolgono la base in maniera specifica la base cambiata la base alterata e

quindi fanno sempre parte della famiglia delle N-glicosilasi. Questa AlkA è meno specifica perchè

vedete può rimuovere 3 basi diverse, mentre invece c'è un altro gene che è TagA (3methyl

glycosilase) e il prodotto di questo gene rimuove in maniera specifica la 3-metiladenina. Quindi

ricapitolando poi dobbiamo andare a vedere come vengono regolati questi geni (la cosa si complica

un pochino) però rifacendo un attimo il punto della situazione le basi possono subire un processo di

alchilazione, la base alchilata viene rimossa da N-glisosilasi specifiche, tra queste riconosciamo

AlkA che riconosce e rimuove 3-metiladenina, 3-metilguanina e 7-metilguanina, o Tag che

riconosce in maniera specifica 3-metiladenina. Un'altra classe di enzimi che diciamo posssono

intervenire nel rimuovere questo danno sono le metiltransferasi: la metiltransferasi prende il gruppo

metilico da qualche parte e lo trasferisce su se stessa. In questo caso la metiltranferasi prende il

gruppo metilico dalla base alchilata e lo transferisce su se stessa. Ci sono situazioni in cui il livello

di alchilazione del DNA è talmente forte, è talmente pesante, che si possono avere trasferimenti di

gruppi metilici anche sul gruppo fosfato . Anche in questo caso la metiltransferasi può utilizzare

questo gruppo metilico legato al fosfato e trasferirlo su se stessa, ve lo dico perchè poi adesso

vediamo il dettaglio dei due casi. Chi sono queste metiltrasferasi? In E. coli ci sono 2 enzimi che

fanno questo lavoto, Otg (enzima che lavora in maniera più specifica in cellule in attiva

proliferazione quindi in fase esponenziale) e poi c'è un altro enzima che è quello che è stato più

studiato, poi lo vedremo più in dettaglio, Ada. Ada se lo vedete è una metiltransferasi più specifica,

in fase stazionaria in condizioni di stress. Qu